Una piattaforma di microscopia multifoto personalizzata per l'imaging dal vivo di Mouse Cornea e Conjunctiva

Riepilogo

Qui è presentata una piattaforma microscopica multifoto per l'imaging della superficie oculare del mouse vivo. Il mouse transgenico fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all'interno della superficie oculare. I segnali di seconda generazione armonica non lineari derivati da strutture collagenose forniscono immagini senza etichette per architetture tropiche.

Abstract

L'analisi itologica convenzionale e i sistemi di coltura cellulare sono insufficienti per simulare completamente le dinamiche fisiologiche e patologiche in vivo. La microscopia multifotona (MPM) è diventata una delle modalità di imaging più popolari per lo studio biomedico a livelli cellulari in vivo, i vantaggi includono alta risoluzione, penetrazione dei tessuti profondi e fototossicità minima. Abbiamo progettato una piattaforma di imaging MPM con un supporto per gli occhi per mouse personalizzato e uno stadio stereotassico per l'imaging della superficie oculare in vivo. Il mouse reporter a doppia proteina fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all'interno della superficie oculare. Oltre ai segnali di fluorescenza multifotona, l'acquisizione di seconda generazione armonica (SHG) consente contemporaneamente la caratterizzazione dell'architettura stroa collagenos. Questa piattaforma può essere utilizzata per l'imaging intravitale con posizionamento accurato su tutta la superficie oculare, tra cui cornea e congiuntiva.

Introduzione

Le strutture superficiali oculari, tra cui la cornea e la congiuntiva, proteggono altri tessuti oculari più profondi da disturbi esterni. La cornea, la parte anteriore trasparente dell'occhio, funziona sia come lente refrattiva per dirigere la luce nell'occhio sia come barriera protettiva. L'epitelio corneale è lo strato più esterno della cornea ed è costituito da strati distinti di cellule superficiali, cellule alali e cellule basali. Lo stroma corneale è composto da lamellae collagenose sofisticate e confezionate incastonate con cheratociti. L'endotelio corneale, un singolo strato di cellule esagonali piatte, ha un ruolo importante nel mantenere la trasparenza della cornea mantenendo lo stroma corneale in uno stato relativamente disidratato attraverso le sue funzioni di^{pompaggio 1}. Limbus forma il confine tra la cornea e la congiuntiva, ed è il serbatoio delle cellule staminali epiteliali corneali². La congiuntiva altamente vascolarizzata aiuta a lubrificare gli occhi producendo muco e lacrime³.

Le dinamiche cellulari delle strutture della superficie corneale sono convenzionalmente studiate dall'analisi sittologica o dalla coltura cellulare in vitro, che potrebbe non simulare adeguatamente le dinamiche cellulari in vivo. Un approccio non invasivo per l'imaging dal vivo può, pertanto, colmare tale lacuna. Grazie ai suoi vantaggi, che includono alta risoluzione, minimo fotodamage e profondità di imaging più profonda, MPM è diventato una potente modalità in diverse aree della ricerca biologica^4,5,6,7,8. Per l'imaging corneale, MPM fornisce informazioni cellulari dall'autofluorescenza intrinseca derivata dal NAD(P)H intracellulare. I segnali di seconda generazione armonica (SHG) derivati dalle fibre di collagene di tipo I non centrosmimetriche sotto la scansione laser femtosecondi forniscono strutture stromali collagenose senza ulteriori procedure di colorazione⁹. In precedenza, noi e altri gruppi abbiamo sfruttato MPM per l'imaging di cornee animali e umane^{9,10,11,12,13,14,15}.

Linee di topo transgenici che presentano proteine fluorescenti in specifiche popolazioni cellulari sono state ampiamente utilizzate per vari studi nella biologia cellulare, tra cui lo sviluppo, l'omeostasi dei tessuti, la rigenerazione dei tessuti e la carcinogenesi. Abbiamo usato ceppi di topi transgenici etichettati con proteine fluorescenti per l'imaging in vivo di cornee^9,10, follicoli^{piliferi 10} ed epidermide¹⁰ da MPM. Il ceppo del topo a doppia fluorescente con membrana cellulare etichettata con tdTomato e nucleo cellulare etichettato con EGFP è allevato da due ceppi di topo: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sor^tm1Ytchn/J, #021847)¹⁶ e mT-mG (Gt(ROSA26)^{ACTB-tdTomato-EGFP}, #007676)¹⁷. La linea di topi transgenici R26R-GR contiene un duplice costrutto di proteine fluorescenti, tra cui un gene di fusione H2B-EGFP e un gene di fusione del segnale di ancoraggio mCherry-GPI, inseriti nel locus Gt (ROSA)26Sor. Il ceppo transgenico mT-mG è un tdTomato mirato alla membrana cellulare e topi Cre-reporter fluorescenti EGFP. Prima della ricombinazione di Cre, la proteina della membrana cellulare con espressione di fluorescenza tdTomato è ampiamente presente in varie cellule. Questo ceppo di topo transgenico ci permette di visualizzare nuclei-EGFP e membrana con tdTomato senza eccitazione Cre. Due femmine (R26R-GR )^eun topo transgenico maschio (mT-mG⁾sono state allevate insieme per produrre topi sufficienti per gli esperimenti. In questo studio sono stati utilizzati la loro prole con R26R-GR^--;mT-mG^-/- genotipo, un doppio ceppo di topi fluorescenti. Rispetto a una linea di topo fluorescente come descritto^{in precedenza 9,10}, questo ceppo di topo a doppio reporter fluorescente ci fornisce un 50% di acquisizione ridotta del tempo di imaging.

In questo lavoro, descriviamo un protocollo tecnico dettagliato per l'imaging in vivo della superficie oculare in modo passo-passo utilizzando la nostra piattaforma di imaging e i topi transgenici a doppia fluorescente.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della National Taiwan University e chang Gung Memorial Hospital.

1. Configurazione della microscopia multifoto

1. Costruire un sistema basato su un microscopio verticale con immersione in acqua 20x 1.00 obiettivo NA (Figura 1A).
2. Usa Ti: laser zaffiro (con lunghezza d'onda regolabile) come fonte di eccitazione. Impostare la lunghezza d'onda di uscita laser su 880 nm per EGFP e 940 nm per tdTomato (Figura 1A).
3. Includere due specchi dicroici (495 nm e 580 nm) per la separazione di SHG/EGFP e EGFP/tdTomato (Figura 1A). Separare i segnali SHG, EGFP e tdTomato mediante i filtri del passabanda 434/17nm, 510/84nm e 585/40nm (Figura 1A).
4. Al fine di ottimizzare la qualità dell'immagine ed evitare danni da fotobleaching e tessuti, impostare la potenza laser a circa 35 mW per l'imaging cornea e 50 mW per limbus. Misurare la potenza del laser prima che il laser passi il sistema ottico. L'esatta potenza laser sui campioni è di circa 8-9 mW. La progettazione microscopica completa è illustrata nella Figura 1A.
   NOTA: Il limite superiore della potenza laser è impostato su 70 mW per evitare il foto-sbiancamento e danni ai tessuti.

2. Preparazione degli animali per l'imaging dal vivo

1. Utilizzare topi di 8-12 settimane per l'esperimento. Iniettare intramuscolare 50-80 mg/kg di HCl di tiletamine e zolazepam HCl per anestesia generale. Controllare la mancanza di risposta al riflesso di ritiro pizzicando un dito del piedi. Un'anetizzazione sufficiente è importante per consentire un monitoraggio stabile della frequenza respiratoria.
   NOTA: I topi all'età di 8 settimane o più sono raccomandati perché i loro bulbi oculari sono maturati.
2. Posizionare il mouse sotto anestesia su uno stadio riscaldato e inserire la sonda di monitoraggio della temperatura nell'ano.
   CAUTION: La sonda deve essere inserita completamente nella cavità avaale senza esposizione all'aria, per evitare il surriscaldamento del riscaldatore e l'induzione del colpo di calore.

3. Tenuta oculare per l'imaging live della superficie oculare

1. Per l'imaging live della superficie oculare, utilizzare il supporto del mouse stereotassico progettato su base personalizzata composto da due parti: un supporto per la testa per stabilizzare la testa e un portaocchi per ritrarre le palpebre ed esporre l'intera superficie oculare (Figura 1B-D).
2. Inserire le barre dell'orecchio nella carne uditiva esterna e mantenere la fissazione a tre punti del supporto della testa(Figura 1B,D).
3. Applicare con suarità una soluzione di idro cloruro di ossibuprocaina dello 0,4% in salina e lasciarla per 3 minuti per anestetizzare la superficie oculare.
4. Assicurarsi che il bulbo oculare sia sporgente da una corretta retrazione manuale della palpebra. In caso contrario, può verificarsi ischemia e sanguinamento del bulbo oculare.
5. Posizionare con attenzione un anello del tubo di polietilene del detentore degli occhi lungo il margine della palpebra per esporre la superficie oculare. Stabilizzare il bulbo oculare con il portaoculare composto da una forzata Dumont n. 5 con le punte coperte con il loop di tubo di polietilene (Figura 1C,D).
6. Le foci della vite che utilizzano una manopola in fopinge distale del portaoculare per mantenere stabile il bulbo oculare (Figura 1D).
7. Applicare un gel per gli occhi con l'indice di rifrazione di 1.338 sulla superficie corneale come mezzo di immersione per mantenere l'umidità della superficie oculare ogni ora. Inoltre, l'applicazione regolare del gel per gli occhi ogni ora evita di offuscarsi in cornea durante l'imaging.
8. Ruotare il bulbo oculare con il supporto bloccato sullo stage stepper-motorizzato per l'imaging su tutta la superficie corneale dalla cornea centrale alla regione periferica (Figura 1C,D).
   CAUTION: Sia l'eccesso che la quantità insufficiente di gel oculari possono influire sulla qualità delle immagini durante l'imaging. Pertanto, integrare il gel per gli occhi ogni ora per mantenere la superficie umida regolarmente è importante per l'imaging.

4. Acquisizione di immagini seriali

NOTA: impostare la prima e l'ultima diapositiva in ogni pila per ridurre gli artefatti di movimento di rilascio.

1. Prima di scattare le immagini, immagine del campo di destinazione con una fonte di luce di mercurio.
2. Fare clic sul simbolo del software al microscopio per attivare il software.
3. Selezionare il guadagno PMT corretto e il guadagno digitale per visualizzare la struttura cellulare nella superficie oculare.
4. Impostare la prima diapositiva e l'ultima diapositiva per acquisire una pila.
5. Immettere i valori numerici per la risoluzione dell'immagine e il passaggio z, ad esempio 512 x 512 e 1 m come passo z.
6. Fare clic sul pulsante Start per raccogliere le immagini seriali z.
7. Acquisire immagini dal vivo due volte nella stessa area, prima a 880 nm di eccitazione per la raccolta dei segnali SHG/EGFP e seconda a 940 nm di eccitazione per la raccolta dei segnali EGFP/tdTomato.
   NOTA: la combinazione di due stack fornisce immagini a 3 canali. La risoluzione dell'immagine e le dimensioni del formato di scansione erano rispettivamente 512 x 512 x 512 pixel e 157 m x157 m.

5. Elaborazione delle immagini e ricostruzione 3D

1. Caricare le immagini z-seriali nel software Fiji¹⁸.
2. Selezionare il filtro 3D mediano plugin in Fiji per ridurre i rumori di fondo.
3. Selezionare il filtro Maschera di contrasto pacchetto in Figi per affinare le immagini.
4. Fare clicsu "Auto " in luminosità/contrasto per ottimizzare automaticamente la qualità delle immagini.
5. Salvare le immagini come sequenze di immagini per poter esportare le immagini seriali z.
6. Caricare immagini z-seriali in software commerciale (ad esempio, Avizo lite) per la ricostruzione 3D utilizzando il rendering del volume.
7. In tutte le immagini MPM, presentare i segnali EGFP, tdTomato e SHG rispettivamente in pseudo-verde, rosso e ciano.
8. Acquisire immagini struttura 3D dall'istantanea.

Risultati

Utilizzando questa piattaforma di imaging dal vivo, la superficie oculare del mouse può essere visualizzata a livello cellulare. Per visualizzare singole cellule singole nella superficie oculare, abbiamo impiegato i topi transgenici a doppia fluorescente con EGFP espresso nel nucleo e tdTomato espresso nella membrana cellulare. Lo stroma corneale ricco di collagene è stato evidenziato dai segnali SHG.

Nell'epitelio corneale sono state mostrate cellule superficiali, cellule alare e cellule ba...

Discussione

Questa piattaforma di imaging MPM personalizzata con un software di controllo è stata utilizzata per l'imaging intravitale degli organi epiteliali del topo, tra cui^{la pelle 10}, il follicolo^{pilifero 10} e la superficie oculare^9,10 (Figura 1A). Il sistema su base su base è stato utilizzato per la sua flessibilità nel cambiare i componenti ottici per vari esperimenti, fin dall'inizio del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVIZO Lite software	Thermo Fisher Scientific		Version: 2019.3.0
Bandpass filters	Semrock	FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40
Dichroic mirrors	Semrock	FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36
Galvano	Thorlabs	GVS002
Jade BIO control software	SouthPort Corporation	Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride	Sigma	O0270000
PMT	Hamamatsu	H7422A-40
Polyesthylene Tube	BECTON DICKINSON	427401
Stereotaxic mouse holder	Step Technology Co.,Ltd	000111
Ti: Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy	Olympus	BX51WI
Vidisic Gel	Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH	D13581
Zoletil	Virbac	VR-2831