Evitare il danno da ischemia e riperfusione nel trapianto di fegato

Riepilogo

Di seguito viene presentato un protocollo per fornire un protocollo di trapianto di fegato senza ischemia passo dopo passo in perfusione meccanica normotermica ex situ (37 °C) di fegati umani da donatori a riceventi.

Abstract

Attualmente, la perfusione meccanica ex situ è una tecnica fiorente che fornisce un metodo di conservazione migliore per gli organi dei donatori rispetto alla tradizionale conservazione statica a freddo (0-4 °C). L'afflusso continuo di sangue agli organi mediante perfusione meccanica, dall'approvvigionamento e dalla conservazione fino all'impianto, facilita la prevenzione completa del danno da ischemia e riperfusione e consente la valutazione funzionale ex situ dei fegati dei donatori prima del trapianto. In questo manoscritto, forniamo un protocollo di trapianto di fegato senza ischemia passo dopo passo in cui un apparato di perfusione meccanica normotermico ex situ viene utilizzato per la perfusione pulsatile attraverso l'arteria epatica e la perfusione continua della vena porta dai fegati dei donatori umani ai riceventi. Nel periodo di perfusione, viene condotta un'analisi biochimica del perfusato per valutare l'attività metabolica del fegato e viene eseguita anche una biopsia epatica per valutare il grado di lesione. Il trapianto di fegato libero da ischemia è un metodo promettente per evitare il danno da ischemia-riperfusione e può potenzialmente aumentare il pool di donatori per il trapianto.

Introduzione

Il danno da ischemia e riperfusione (IRI) è una complicanza ben nota e diffusa nel trapianto di organi. Eventi non immunologici evidenti portano a scarsi esiti del trapianto e a una funzione ritardata del trapianto, che sono correlati alle alte percentuali di insufficienza d'organo, retrapianto e morte del ricevente¹. La conservazione a freddo convenzionale (CCS) degli organi è stata precedentemente identificata come un metodo classico per rallentare il metabolismo, ma non ha un'influenza sulla prevenzione della disfunzione progressiva e del danno all'integrità cellulare. Inoltre, l'accumulo di leucociti è indotto dai metaboliti reattivi dell'ossigeno nella fase di riperfusione. Tutti questi processi biologici diventano ancora più rilevanti quando utilizziamo innesti di donatori con criteri estesi (ECD) come i fegati grassi e quelli provenienti da donatori di età superiore ai 65 anni. Questi innesti ECD sono più vulnerabili ai danni e ad altri impatti dannosi, in particolare quelli della CCS². La tecnologia della perfusione epatica normotermica ex situ per la conservazione degli organi dei donatori ha fatto grandi progressi negli ultimi decenni ed è del tutto fattibile^{nella pratica} clinica3. La sicurezza e la fattibilità delle tecniche di perfusione calda negli organi dei donatori sono state valutate in studi preclinici e alcuni gruppi di studio hanno progettato nuovi tipi di perfusato e tattiche di riscaldamento in modelli animali. Alcuni studi clinici di perfusione calda per conservare i fegati dei donatori sono stati avviati in Asia orientale, Europa e Nord America ^4,5.

La perfusione meccanica normotermica (NMP) facilita uno scenario metabolicamente attivo in cui gli organi possono raggiungere l'omeostasi con ossigeno e sostanze nutritive continuamente forniti. Il metabolismo degli innesti viene attivato e possiamo giudicare durante la perfusione se gli organi del donatore sono adatti al trapianto ai riceventi in base all'indice biochimico del perfusato o alla biopsia degli organi perfusi. I parametri disponibili durante il periodo di conservazione offrono anche ai chirurghi un mezzo per trattare gli innesti o ripristinare gli innesti ECD ^6,7.

I globuli rossi sono il vettore di ossigeno più utilizzato. Alcuni altri ingredienti essenziali, tra cui antibiotici, agenti antitrombotici e sostanze nutritive sono inclusi anche nel perfusato⁸. Nella pratica corrente, dopo che un fegato è stato recuperato, viene conservato e preparato sul retro in una soluzione 0-4°C. Quindi, il fegato freddo viene perfuso nell'apparato NMP già preparato per diverse ore per la valutazione e il ripristino. Tuttavia, il fegato subisce doppi attacchi di IRI all'inizio della NMP e dopo l'impianto, sebbene il fegato sia protetto e riparato in una certa misura durante il processo NMP ^9,10. Pertanto, abbiamo cercato di rivalutare il processo e riflettere su come evitare i due attacchi IRI. Abbiamo ipotizzato che l'IRI fosse evitabile se fosse stato fornito un continuo afflusso di sangue al fegato. Per verificare questa ipotesi, abbiamo modificato il protocollo convenzionale di doppia conversione in un'alimentazione ininterrotta dell'arteria epatica (HA) e della vena porta (PV) utilizzando un dispositivo Liver-Assist. Questa nuova procedura di trapianto è stata chiamata trapianto di fegato libero da ischemia (IFLT). Il primo caso di IFLT è stato precedentemente pubblicato e ha attirato una notevole attenzione da parte degli esperti di trapianto di organi¹¹.

Nel dispositivo di perfusione sono state utilizzate due pompe rotative che forniscono un flusso arterioso epatico pulsatile e un'alimentazione fotovoltaica continua in cui il flusso era controllato da una pressione rilevante. Il sistema è controllato dalla pressione e consente di regolare automaticamente il flusso attraverso il fegato in base alla resistenza nel fegato. L'ossigenazione e l'eliminazione di CO₂ del perfusato sono regolate da due ossigenatori a membrana a fibra cava. Possiamo impostare temperature diverse in base ai diversi tipi di perfusione della macchina (che vanno da 10 °C a 37 °C). Siamo in grado di monitorare e registrare in tempo reale la pressione, la temperatura, il flusso e l'indice di resistenza nel quadro strumenti durante il processo di perfusione. L'assistenza al fegato non è un dispositivo trasportabile. Pertanto, i donatori utilizzati per l'IFLT devono essere trasferiti al centro trapianti.

Questo articolo mirava a offrire un protocollo IFLT passo-passo in cui un apparato NMP ex situ viene utilizzato per fornire perfusione pulsatile all'HA e mantenere la perfusione continua del PV dall'approvvigionamento del fegato del donatore umano all'impianto.

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Protocollo

Questo protocollo è stato esaminato e approvato dal comitato etico del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Sun Yat-sen, Guangzhou, Cina. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti. Tutte le procedure negli studi che hanno coinvolto partecipanti umani sono state eseguite in conformità con la Dichiarazione di Helsinki del 1964 e le sue successive modifiche o revisioni.

1. Preparazione della soluzione di perfusione e del dispositivo

NOTA: Il volume totale della soluzione di perfusione preparata per NMP secondo questo protocollo è di circa 3.000 mL, come riportato in precedenza¹, e la concentrazione finale di emoglobina è di 6-10 g/L. I componenti della soluzione di perfusione sono elencati nella Tabella 1.

1. Aggiungere i componenti del perfusato al serbatoio dell'organo del dispositivo di assistenza epatica artificiale (Tabella dei materiali) attraverso il connettore nella parte superiore dell'ossigenatore e rimuovere tutte le bolle dalla tubazione.
2. Accendere la pompa venosa secondo le istruzioni del produttore, che vengono visualizzate sullo schermo. Accendere la pompa arteriosa in modo simile. Annullare la pressione secondo le istruzioni sullo schermo del dispositivo. Fare clic sul pulsante Pressione per impostare la pressione HA nell'intervallo 50-60 mmHg e la pressione PV nell'intervallo 5-10 mmHg durante l'intero processo di perfusione meccanica a temperatura normale.
3. Avviare l'ossigenazione utilizzando una miscela di O₂ e aria (30% O₂) a una portata combinata di 400 mL/min. Riscaldare la soluzione di perfusione a 37 °C.
4. Ottenere un campione di soluzione di perfusato dal tubo di derivazione a T della linea di perfusione arteriosa per la coltura microbica (8 mL), l'analisi dei gas ematici (0,5 mL) e il test di funzionalità epatica (3 mL) dopo che il dispositivo è stato innescato (pO₂, pCO₂, pH ed elettrolita entro l'intervallo normale e temperatura vicina a 37 °C) e monitorare i parametri biochimici di conseguenza.
   NOTA: Il perfusato deve essere preparato fresco prima dell'uso in una sala operatoria a flusso laminare. Se necessario, viene aggiunto bicarbonato o insulina.

2. Approvvigionamento senza ischemia del fegato del donatore

1. Eseguire l'incisione crociata addominale come segue: verticale, dalla tacca sternale alla sinfisi pubica, e trasversale, lateralmente a entrambi i fianchi a livello dell'ombelico. Quando è necessario l'approvvigionamento del polmone o del cuore, è possibile utilizzare una sternotomia. Utilizzare un grande divaricatore a forma di C per fornire esposizione.
2. Eseguire un'ispezione dettagliata dei visceri addominali. Prelevare un campione di biopsia epatica per l'osservazione istologica e la ricerca clinica. Mobilizzare il fegato con una tecnica di precisione.
3. Posizionare una cannula nel dotto biliare comune per il drenaggio biliare e legare il dotto cistico. Tagliare un campione di tessuto dell'intera circonferenza (larghezza: 3-5 mm) dall'estremità del dotto biliare comune per l'osservazione istologica e la ricerca clinica.
4. Sezionare l'arteria celiaca (CA), l'arteria gastroduodenale (GDA), l'arteria splenica (SA), la vena cava inferiore (IVC) e la PV. Inserire una cannula arteriosa da 8 Fr/12 Fr nella GDA o SA. Assicurarsi che non vi sia alcuna interruzione dell'afflusso arterioso al fegato da parte dell'AC.
5. Prelevare una vena iliaca esterna destra lunga 3 cm e anastomizzare il vaso verso la PV in modo end-to-side con blocco parziale della PV per creare una vena di interposizione.
6. Posizionare una cannula cavale da 32-34 Fr nella vena cava inferiore infraepatica (IHIVC) per il deflusso verso il serbatoio dell'organo del dispositivo. Collegare una cannula diritta da 24 Fr alla linea di perfusione fotovoltaica del dispositivo e quindi, attraverso la vena di interposizione, inserirla completamente nel fotovoltaico. Ostruire la vena cava inferiore sopraepatica (SHIVC) bloccando così il drenaggio venoso verso l'atrio destro. Collegare la cannula arteriosa alla linea di perfusione HA del dispositivo Liver Assist. Quindi, avviare NMP e stabilire il circuito in situ.
7. Prelevare il fegato e trasferirlo nel serbatoio dell'organo in NMP continuo. Immediatamente dopo che il fegato è stato rimosso dalla cavità addominale, lavare a freddo i reni attraverso la cannula preposizionata all'interno dell'aorta addominale e procurare i reni in modo convenzionale.
   NOTA: Nel processo di approvvigionamento, isolare completamente l'arteria epatica comune (CHA), legare l'arteria gastrica sinistra (LGA) e isolare il CA all'aorta addominale. Nel caso dell'HA accessorio, bypassare l'arteria in situ prima dell'inizio dell'NMP.

3. Conservazione del fegato del donatore senza ischemia

1. Trasferire il fegato nel dispositivo di perfusione. Rimuovere immediatamente la cannula cavale quando il fegato viene spostato nel serbatoio dell'organo. NMP continuo ex situ dell'innesto epatico fino alla rivascolarizzazione dell'allotrapianto.
2. Impostare la pressione di perfusione PV a 6-10 mmHg con una portata target superiore a 500 mL/min. Impostare la pressione HA a 50-60 mmHg con una portata target superiore a 150 mL/min. Durante l'NMP, assicurarsi che i parametri di perfusione siano stabili e monitorare la pressione e la portata entro un intervallo appropriato.
3. Rimuovere i tessuti ridondanti dal fegato e dai vasi sanguigni. Bloccare transitoriamente l'IVC generale per esaminare SHIVC e IHIVC alla ricerca di perdite. Coprire le superfici asciutte con una garza sterile bagnata per evitare la disidratazione.
4. Raccogliere il tubo biliare in un contenitore di raccolta da 15 ml. Posizionare l'apertura del drenaggio biliare sotto il fegato per consentire alla bile di defluire liberamente. Registra la quantità di produzione di bile e monitora i parametri biochimici ogni 30 minuti.
5. Ottenere un campione di perfusione (0,5 mL) per l'analisi dei gas nel sangue ogni 10-20 minuti, i test di funzionalità epatica (3 mL) ogni 30 minuti e monitorare i parametri biochimici di conseguenza.
6. Valutare la vitalità del fegato mediante l'emogasanalisi e i test di funzionalità epatica del perfusato, nonché i parametri biochimici della bile come precedentemente riportato².
   NOTA: Per la sicurezza del paziente, confermare la vitalità dell'innesto durante l'NMP prima di iniziare le procedure chirurgiche del ricevente. Se necessario, aggiungere 1 mL di papaverina per ridurre la resistenza vascolare.

4. Impianto del fegato del donatore senza ischemia

1. Resecare il fegato malato del ricevente utilizzando una tecnica convenzionale. Recannulare il donatore IHIVC con una cannula cavale da 32-34 Fr, rimuovere il fegato malato e bloccare lo SHIVC con un morsetto. Quindi, spostare il fegato del donatore dal serbatoio alla cavità addominale del ricevente in modo che un circuito NMP in situ possa essere ristabilito.
2. Sutura dello SHIVC donatore alle controparti riceventi utilizzando suture in polipropilene 3-0 non assorbibili con tecnica bi-cavale o piggy-back.
3. Sutura il PV e l'HA del donatore alle controparti del ricevente in modo end-to-end utilizzando rispettivamente suture in polipropilene non assorbibili 5-0 e 7-0. Eseguire queste anastomosi sotto NMP continuo dell'allotrapianto poiché sia l'HA che il PV contengono rami sia nativi che artificiali in natura.
4. Raccogliere il campione di biopsia epatica prima della riperfusione. Successivamente, rilasciare i morsetti sul PV e sull'HA per ristabilire il doppio afflusso di sangue nativo per il fegato. Allo stesso tempo, interrompere l'NMP dopo la rimozione dell'HA e della cannula PV. Quindi, sciacquare circa 200 ml di perfusato all'interno della cannula IHIVC sotto forma di fegato. Bloccare la cannula IHIVC e rilasciare il morsetto sullo SHIVC. La fase anepatica è terminata. Ottenere nuovamente un campione di perfusato (8 mL) per la coltura microbica.
5. Rimozione delle cannule nel SA o GDA e interposizione della vena. Trattare il donatore SA o GDA e vena di interposizione. Prelevare la cannula nell'IHIVC e anastomizzare l'IHIVC del donatore all'IHIVC ricevente (bi-cavale) o legarlo (piggy-back) secondo la procedura chirurgica. Raccogliere nuovamente il campione del dotto biliare comune dopo aver ritirato la cannula di drenaggio biliare.  Anastomizzare il dotto biliare comune del donatore al dotto biliare comune del ricevente con modalità end-to-end dopo il ritiro del tubo di drenaggio.
6. Raccogliere nuovamente il campione di biopsia epatica dopo un'emostasi meticolosa. Chiudere la parete addominale nella procedura di routine.
   NOTA: Durante il processo di impianto, monitorare attentamente il portale e la cannula arteriosa per evitare torsioni o piegamenti e esaminare i parametri della velocità di flusso in tempo reale per garantire l'afflusso di sangue di HA e PV. Aumentare leggermente la pressione di perfusione quando necessario per garantire che la portata sia sufficiente per il fegato. Durante l'anastomosi di SHIVC, PV o IHIVC, accorciare il moncone venoso il più possibile per evitare l'ostruzione postchirurgica del flusso venoso.

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Risultati

Nell'aprile 2018, un donatore maschio di 66 anni con morte cerebrale non è stato preso in considerazione dai centri di trapianto locali a causa dell'alto rischio di perdita del trapianto in tali donatori. Le ragioni per l'eliminazione del fegato, al momento del prelievo, erano l'età avanzata e l'aspetto macroscopico di consistenza moderata, bordi rotondi del fegato e perfusione non ottimale del trapianto epatico insieme a principali comorbidità del donatore, che includevano ipertensio...

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Discussione

Questa tecnica IFLT è stata stabilita per evitare completamente l'IRI. Questo articolo fornisce un protocollo IFLT passo dopo passo, dal prelievo degli organi, alla conservazione ex situ fino all'impianto.

Basato su NMP, IFLT fornisce una fornitura ininterrotta di sangue e ossigeno agli innesti dall'approvvigionamento e dalla perseveranza all'impianto. Numerosi studi hanno dimostrato che l'NMP presenta vantaggi significativi nella riduzione dell'IRI, nel migl...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% calcium gluconate	Hebei Tiancheng Pharmaceutical Co, Ltd	1S181124101	30 mL
25% magnesium sulphate	Hebei Tiancheng Pharmaceutical Co, Ltd	H20033861	3 mL
5% sodium bicarbonate	Huiyinbi Group Jiangxi Dongya Pharmaceutical Co, Ltd	H36020283	The amount depends on the pH
Cefoperazone sodium and sulbactam sodium	Pfizer	H20020597	1.5 g
Compound Amino Acid Injection	Guangdong Litai Pharmaceutical Co., Ltd	H20063797	250 mL
Crossed-matched leucocyte-depleted washed red cells	Guangzhou Blood Center	H20033739	1300 mL
Heparin	Chengdu Hepatunn Pharmaceutical Co., Ltd	H51021209	37500 U
Liver Assist	Organ Assist	OA.Li.Li.140	Perfusion device
Liver Assist disposable package	Organ Assist	OA.Li.DP.540	Disposable set and cannulas
Metronidazole	Shanghai Baxter Healthcare Co., Ltd.	H20003301	0.5 g
scalp acupuncture	Wuhan W.E.O.Science & Technology Development Co., Ltd	WEO-JX-32B-5.0 0.7*25mm	Bile duct cannula
Succinylated gelatinor	B. Braun Medical Suzhou Co., Ltd	H20113119	1400 mL