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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Una piattaforma di microestrazione-gascromatografia in fase solida dello spazio di testa è descritta qui per l'identificazione e la quantificazione volatili veloci, affidabili e semi-automatizzate nei frutti di ribes nero maturi. Questa tecnica può essere utilizzata per aumentare la conoscenza dell'aroma della frutta e per selezionare cultivar con sapore migliorato ai fini dell'allevamento.

Abstract

C'è un crescente interesse nella misurazione dei composti organici volatili (COV) emessi dai frutti maturi ai fini dell'allevamento di varietà o cultivar con caratteristiche organolettiche migliorate e, quindi, per aumentare l'accettazione da parte dei consumatori. Recentemente sono state sviluppate piattaforme metabolomiche ad alto rendimento per quantificare una vasta gamma di metaboliti in diversi tessuti vegetali, compresi i composti chiave responsabili del gusto del frutto e della qualità dell'aroma (volatilomica). Un metodo che utilizza la microestrazione in fase solida dello spazio di testa (HS-SPME) accoppiato con gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) è descritto qui per l'identificazione e la quantificazione dei COV emessi dai frutti di ribes nero maturo, una bacca molto apprezzata per il suo sapore e benefici per la salute.

I frutti maturi delle piante di ribes nero (Ribes nigrum) sono stati raccolti e congelati direttamente in azoto liquido. Dopo l'omogeneizzazione dei tessuti per produrre una polvere fine, i campioni sono stati scongelati e immediatamente miscelati con una soluzione di cloruro di sodio. Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato trasferito in una fiala di vetro dello spazio di testa contenente cloruro di sodio. I COV sono stati quindi estratti utilizzando una fibra di microestrazione in fase solida (SPME) e un gascromatografo accoppiato a uno spettrometro di massa a trappola ionica. La quantificazione volatile è stata eseguita sui cromatogrammi ionici risultanti integrando l'area di picco, utilizzando uno specifico ione m/z per ciascun VOC. La corretta annotazione voC è stata confermata confrontando i tempi di ritenzione e gli spettri di massa di standard commerciali puri eseguiti nelle stesse condizioni dei campioni. Più di 60 COV sono stati identificati in frutti di ribes nero maturi coltivati in località europee contrastanti. Tra i COV identificati, i composti aromatici chiave, come terpenoidi e sostanze volatili C6, possono essere utilizzati come biomarcatori per la qualità del frutto del ribes nero. Inoltre, vengono discussi i vantaggi e gli svantaggi del metodo, compresi i potenziali miglioramenti. Inoltre, è stato sottolineato l'uso di controlli per la correzione dei lotti e la minimizzazione dell'intensità della deriva.

Introduzione

Il sapore è un tratto di qualità essenziale per qualsiasi frutto, che influisce sull'accettazione da parte dei consumatori e quindi influisce in modo significativo sulla commerciabilità. La percezione del sapore comporta una combinazione del sistema gustativo e olfattivo e dipende chimicamente dalla presenza e dalla concentrazione di una vasta gamma di composti che si accumulano nelle parti commestibili della pianta, o nel caso dei COV, sono emessi dal frutto maturo1,2. Mentre l'allevamento tradizionale si è concentrato su tratti agronomici come la resa e la resistenza ai parassiti, il miglioramento dei tratti della qualità della frutta, incluso il sapore, è stato a lungo trascurato a causa della complessità genetica e della difficoltà di fenotipizzare correttamente queste caratteristiche, portando al malcontento dei consumatori3,4. I recenti progressi nelle piattaforme metabolomiche hanno avuto successo nell'identificare e quantificare i composti chiave responsabili del gusto e dell'aroma dei frutti5,6,7,8. Inoltre, la combinazione del profilo dei metaboliti con strumenti genomici o trascrittomici consente di chiarire la genetica alla base del sapore del frutto, che a sua volta aiuterà i programmi di selezione a sviluppare nuove varietà con caratteristiche organolettiche migliorate2,4,9,10,11,12,13,14.

Le bacche di ribes nero (Ribes nigrum) sono molto apprezzate per il loro sapore e le loro proprietà nutrizionali, essendo ampiamente coltivate nelle zone temperate di Europa, Asia e Nuova Zelanda15. La maggior parte della produzione viene lavorata per prodotti alimentari e bevande, che sono molto popolari nei paesi nordici, principalmente a causa delle proprietà organolettiche delle bacche. Il colore intenso e il sapore del frutto sono il risultato di una combinazione di antociani, zuccheri, acidi e COV presenti nei frutti maturi16,17,18. L'analisi dei volatili del ribes nero risale agli anni 196019,20,21. Più recentemente, diversi studi si sono concentrati sui COV del ribes nero, identificando composti importanti per la percezione dell'aroma di frutta e valutando l'impatto del genotipo, dell'ambiente o delle condizioni di conservazione e lavorazione sul contenuto di VOC5,17,18,22,23.

A causa dei suoi numerosi vantaggi, la tecnica scelta per la profilazione volatile ad alto rendimento è HS-SPME/GC-MS24,25. Una fibra di silice, rivestita con una fase polimerica, è montata su un dispositivo a siringa, consentendo l'adsorbimento delle sostanze volatili nella fibra fino al raggiungimento di una fase di equilibrio. L'estrazione dello spazio di testa protegge la fibra dai composti non volatili presenti nella matrice24. SPME può isolare con successo un elevato numero di COV presenti a concentrazioni altamente variabili (parti per miliardo a parti per milione)25. Inoltre, è una tecnica priva di solventi che richiede un'elaborazione limitata del campione. Altri vantaggi di HS-SPME sono la facilità di automazione e il suo costo relativamente basso.

Tuttavia, il suo successo può essere limitato, a seconda della natura chimica dei COV, del protocollo di estrazione (inclusi tempo, temperatura e concentrazione salina), della stabilità del campione e della disponibilità di sufficiente tessuto frutticolo26,27. Questo documento presenta un protocollo per i COV di ribes nero isolati da HS-SPME e analizzati mediante gascromatografia accoppiato con uno spettrometro di massa a trappola ionica. È stato raggiunto un equilibrio tra la quantità di materiale vegetale, la stabilità del campione e la durata dell'estrazione e della cromatografia per essere in grado di elaborare un numero elevato di campioni di ribes nero, alcuni dei quali presentati in questo studio. In particolare, i profili VOC e/o i cromatogrammi di cinque cultivar ('Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran', e 'Tihope') saranno presentati e discussi come dati di esempio. Inoltre, lo stesso protocollo è stato messo in pratica con successo per la misurazione dei VOC in altre specie di bacche di frutta come la fragola (Fragaria x ananassa), il lampone (Rubusidaeus) e il mirtillo (Vaccinium spp.).

Protocollo

1. Raccolta della frutta

  1. Crescere da 4 a 6 piante per genotipo e/o trattamento per garantire sufficiente materiale fruttifero e variabilità.
  2. Se possibile, raccogliere i campioni nella stessa data; se non c'è abbastanza materiale di frutta, raggruppare i campioni raccolti in date diverse.
    NOTA: Si raccomanda che il tempo di raccolta (mattina, mezzogiorno, pomeriggio) rimanga approssimativamente identico in quanto i profili VOC sono influenzati dal ritmo diurno/circadiano28,29,30,31.
  3. Valutare la fase di maturazione dei frutti mediante osservazione visiva32. Frutta in pool dallo stesso stadio di maturazione, poiché lo stato di maturazione influisce fortemente sulle emissioni di COV. Scartare eventuali frutti danneggiati o infetti da agenti patogeni.
    NOTA: Per valutare meglio la maturazione dei frutti, è possibile eseguire un'analisi della consistenza33. Inoltre, il conteggio dei giorni dopo la fioritura può essere utilizzato per garantire che i frutti raggruppati appartengano a uno stadio di maturazione simile.
  4. Includere un minimo di 10-15 frutti per replica biologica (da 3 a 5) per l'analisi VOC.
    NOTA: Qui, tre pool separati di 13-20 frutti (repliche biologiche) di cultivar "Andega", "Ben Tron", "Ben Gairn", "Ben Tirran" e "Tihope" sono stati raccolti in due località (Polonia e Scozia) nell'estate 2018 e direttamente congelati in azoto liquido. I campioni sono stati quindi inviati al laboratorio ed elaborati come descritto di seguito.
  5. Una volta raccolti, congelare immediatamente tutti i frutti in azoto liquido e successivamente conservarli a -80 °C fino alla lavorazione.
    NOTA: Se possibile, i frutti possono essere lavorati direttamente dopo il raccolto. In questo caso, i frutti freschi possono essere omogeneizzati in un mixer, pesati e analizzati direttamente (dal punto 3.1 in poi). Tuttavia, per evitare che i frutti subiscano ulteriori processi degradativi post-raccolta, il materiale fresco deve essere conservato in un dispositivo di raffreddamento (4 °C) e lavorato il più rapidamente possibile. Se non gestito correttamente, l'azoto liquido può produrre ustioni da freddo e può causare asfissia in spazi scarsamente ventilati.

2. Campione di frutta e preparazione del reagente

  1. Macinare i frutti in polvere fine, avendo cura di tenerli sempre congelati con l'aiuto di azoto liquido. Utilizzare un mulino criogenico, un mulino per perline o un mortaio e un pestello per l'omogeneizzazione. Preraffrecare barattoli di macinazione in acciaio inossidabile o mortaio e pestello con azoto liquido per evitare lo scongelamento del campione.
    NOTA: è fondamentale omogeneizzare i campioni in una polvere fine per garantire una corretta estrazione di VOC.
  2. Pesare 1 g di materiale congelato (dal punto 2.1.) in un tubo da 5 ml precedentemente raffreddato in azoto liquido e annotare il peso esatto. Mantenere il materiale a -80 °C fino alla fase di lavorazione 3.1.
  3. Includere campioni di "riferimento" o "controllo" nell'analisi per verificare le variazioni tecniche, tra cui l'estrazione di COV e le prestazioni HS-SPME/GC-MS. A tale scopo, raggruppare una miscela di campioni di frutta scelti casualmente e includere almeno un campione di controllo al giorno per l'analisi voC. Inoltre, utilizzare uno standard interno, come descritto nel passaggio 2.5., per ridurre al minimo l'impatto della deriva di intensità.
  4. Preparare una soluzione di cloruro di sodio al 20% (p/v) in acqua di grado HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) (di seguito, denominata soluzione di NaCl). Sciogliere NaCl con l'aiuto di un agitatore magnetico; garantire la disponibilità di 1 mL di soluzione per campione.
  5. Preparare una soluzione da 1 ppm in metanolo di grado HPLC di N-pentadecano (D32, 98%) da standard commerciale puro (di seguito, denominato standard interno).
    NOTA: N-pentadecane-d32 sarà utilizzato come standard interno e saranno necessari 5 μL per campione. Il metanolo dovrebbe essere manipolato sotto una cappa aspirante.
  6. Preparare soluzioni da 1 ppm in metanolo di grado HPLC di standard commerciali puri per l'identificazione dei COV (vedere la Tabella 1 per l'elenco degli standard commerciali utilizzati in questo studio).
  7. Preparare 10 mL di flaconcini di spazio di testa con tappo a vite aggiungendo 0,5 g di NaCl in ogni flaconcino necessario. Assicurarsi che i tappi a vite includano un setto composto da un materiale morbido, cioè silicone, con un sottile film di politetrafluoroetilene sul lato interno, per evitare la contaminazione.

3. Preparazione del campione

  1. Aggiungere 1 mL di soluzione di NaCl al tubo da 5 mL contenente il campione congelato pesato. Agitare la provetta fino a quando il campione non è completamente scongelato e omogeneizzato.
  2. Centrifugare a 5000 × g per 5 min a temperatura ambiente.
  3. Trasferire il surnatante con una punta della pipetta da 1000 μL nel flaconcino dello spazio di testa contenente NaCl. Tagliare l'estremità della punta per facilitare questo processo.
  4. Aggiungere 5 μL di standard interno a ciascun flaconcino contenente lo spazio di testa contenente il campione.

4. Acquisizione dati HS-SPME/GC-MS

  1. Posizionare il flaconcino chiuso dello spazio di testa in un autocampionatore GC-MS a temperatura ambiente, per un'esecuzione automatizzata HS-SPME/GC-MS, descritta al paragrafo 4. Non posizionare repliche biologiche in posizioni successive nell'autocampionatore; invece, distribuiscili in modo casuale per ridurre al minimo l'impatto della deriva dell'intensità.
    NOTA: circa 10-12 flaconcini possono essere inseriti contemporaneamente nell'autocampionatore, senza compromettere la stabilità del campione.
  2. Preincubato i flaconcini dello spazio di testa 10 min a 50 °C con agitazione a 17 x g.
  3. Inserire un dispositivo SPME nel flaconcino per esporre la fibra allo spazio di testa per l'estrazione di VOC per 30 minuti a 50 °C con agitazione a 17 x g.
  4. Introdurre la fibra nella porta di iniezione per 1 minuto a 250 °C in modalità splitless per il desorbimento volatile.
  5. Pulire la fibra in una stazione di pulizia SPME con azoto (1 bar N2, ≥ puro al 99,8%) per 5 minuti a 250 °C. Riutilizzare la fibra circa 100x.
  6. Analizzare i COV con un gascromatografo accoppiato a uno spettrometro di massa a trappola ionica (vedere la Tabella dei materiali) ed eseguire la cromatografia sotto un flusso costante di elio (≥ purezza al 99,9999%) di 1 mL/min, con una colonna che ha dimensioni di 60 m x 0,25 mm x 1 μm di spessore. Utilizzare un programma di temperatura del forno isotermico a 40 °C per 3 minuti, seguito da una rampa di 8 °C/min a 250 °C e mantenendo a 250 °C per 5 minuti. Per la spettrometria di massa, impostare le temperature della linea di trasferimento e della sorgente di ioni su 260 °C e 230 °C, rispettivamente. Impostare l'energia di ionizzazione su 70 eV e l'intervallo di massa registrato su m/z 35-220 a 6 scansioni per s.
  7. Estrarre e analizzare soluzioni da 1 ppm di standard commerciali come descritto sopra. Inoltre, eseguire una miscela contenente tutti gli standard commerciali diluiti miscelati con soluzione naCl da 300 μL e acqua di grado HPLC da 900 μL prima dell'acquisizione dei dati del campione per verificare la corretta calibrazione dell'apparecchiatura. Inoltre, includere un campione bianco contenente la sola soluzione di NaCl in ogni lotto.

5. Analisi dei cromatogrammi del profilo GC-MS: identificazione e semiquantificazione dei VOC

  1. Apri i file di profilo GC-MS grezzi con il software fornito dal produttore. Per identificare i composti, confrontare i loro tempi di ritenzione e gli spettri di massa e gli indici di ritenzione lineare di Kovats determinati dai cromatogrammi dei campioni con indici di ritenzione ottenuti da standard autentici. Per ogni standard commerciale, annotare il tempo di ritenzione e gli ioni m/z più abbondanti. Quindi, selezionare uno ione m/z specifico per ciascun COV (Tabella 1).
  2. Integra automaticamente i picchi VOC in base ai tempi di ritenzione standard e agli ioni m/z scelti dei file raw GC-MS selezionati. Per questo, fornire un elenco per ogni VOC con tempo di ritenzione e ione m/z selezionato. Sebbene il software integri automaticamente l'area di picco corrispondente allo stesso tempo di ritenzione e allo stesso ione m/z forniti nella configurazione della sequenza, controllare la corretta integrazione di ciascun picco e correggerlo manualmente se necessario.
  3. Calcola l'area di picco di ciascun VOC rispetto a quella dello standard interno per ridurre al minimo la variazione strumentale e la deriva dell'intensità.
    NOTA: Quando si analizzano frutti di diversi genotipi o condizioni di crescita e conservazione, si consiglia vivamente di determinare il contenuto di VOC rispetto al contenuto di peso secco del frutto per escludere effetti di diluizione dovuti a differenze nel contenuto di acqua.
  4. Per la correzione dell'effetto batch, normalizzare l'area di picco VOC di ciascun campione nell'area di picco corrispondente nel campione di controllo analizzato nella stessa esecuzione.
    NOTA: si ottiene una quantificazione relativa dei VOC; tuttavia, ai fini dell'esperimento, il contenuto di VOC può essere determinato in relazione a qualsiasi campione (ad esempio, frutti non trattati per confrontare l'effetto della conservazione sui livelli di VOC).

Risultati

La profilazione voC ad alto rendimento in un ampio insieme di colture da frutto coltivate in condizioni o luoghi diversi o appartenenti a genotipi distinti è necessaria per un'accurata fenotipizzazione degli aromi. Qui viene presentata una piattaforma HS-SPME/GC-MS veloce e semi-automatizzata per la quantificazione relativa dei VOC nelle cultivar di ribes nero. Il rilevamento e l'identificazione dei VOC si basavano su una libreria sviluppata per profilare le specie di frutti di bosco (Tabella 1). Un tip...

Discussione

L'allevamento per l'aroma di frutta è stato a lungo ostacolato dalla complessa genetica e biochimica alla base della sintesi di composti volatili e dalla mancanza di tecnologie per una corretta fenotipizzazione. Tuttavia, i recenti progressi nelle piattaforme metabolomiche, combinati con strumenti genomici, stanno finalmente consentendo l'identificazione dei metaboliti responsabili delle preferenze dei consumatori e di allevare colture con un sapore migliore3. Mentre la maggior parte dei progress...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano i Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación dell'Università di Malaga per le misurazioni HS-SPME/GC-MS. Riconosciamo l'assistenza di Sara Fernández-Palacios Campos nella quantificazione volatile. Ringraziamo anche i membri del consorzio GoodBerry per aver fornito il materiale della frutta.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL screw top headspace vialsThermo Scientific10-HSV
18 mm screw cap Silicone/PTFEThermo Scientific18-MSC
5 mL Tube with HDPE screw capVWR216-0153
CentrifugeThermo Scientific75002415
Methanol for HPLCMerck34860-1L-R
N-pentadecane (D32, 98%)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-1283-1
Sodium chlorideMerckS9888
SPME fiber PDMS/DVBMerck57345-U
Stainless grinding jars for TissueLyserQiagen69985
TissueLyser IIQiagen85300Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill
Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometerThermo Scientific
Triplus RSH autosampler with automated SPME deviceThermo Scientific1R77010-0450
Water for HPLCMerck270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1Thermo Scientificsoftware

Riferimenti

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