Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

Riepilogo

Il protocollo delineato descrive la procedura per la produzione del complesso proteico del dominio legante il recettore HiBiT e la sua applicazione per il rilevamento rapido e sensibile degli anticorpi SARS-CoV-2.

Abstract

L'emergere della pandemia di COVID-19 ha aumentato la necessità di migliori metodi di rilevamento sierologico per determinare l'impatto epidemiologico della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Il crescente numero di infezioni da SARS-CoV-2 solleva la necessità di migliori test di rilevamento degli anticorpi. Gli attuali metodi di rilevamento degli anticorpi compromettono la sensibilità per la velocità o sono sensibili ma richiedono molto tempo. Una grande percentuale di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 prende di mira il dominio di legame del recettore (RBD), uno dei compartimenti immunogenici primari di SARS-CoV-2. Recentemente abbiamo progettato e sviluppato un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) altamente sensibile e bioluminescente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2. Il testo seguente descrive la procedura per produrre il complesso HiBiT-RBD e un test rapido per valutare la presenza di anticorpi mirati alla RBD utilizzando questo strumento. A causa della durata del prodotto proteico HiBiT-RBD su un'ampia gamma di temperature e della procedura sperimentale più breve che può essere completata entro 1 ora, il protocollo può essere considerato un'alternativa più efficiente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2 nei campioni di siero dei pazienti.

Introduzione

La recente comparsa di un nuovo coronavirus, SARS-CoV21, ha causato oltre 2.800.000 morti e 128 milioni di infezioni al ^{30 marzo} 20212. A causa della mancanza di una procedura di trattamento affidabile e consolidata per le terapie cliniche SARS-CoV-2, sono stati fatti molti sforzi per limitare l'ulteriore trasmissione virale e, cosa più importante, per sviluppare un trattamento efficace e robusto o un ^vaccino3. Ad oggi, ci sono più di 50 candidati vaccini COVID-19 in studi segnalati dall'Organizzazione Mondiale della ^Sanità4. Il rilevamento di anticorpi contro SARS-CoV-2 è di fondamentale importanza per determinare la stabilità a lungo termine della risposta umorale alla somministrazione del vaccino e nei pazienti guariti di COVID-195. Alcuni studi hanno dimostrato che esiste la possibilità che i pazienti con SARS-CoV-2 recuperati perdano la maggior parte degli anticorpi che legano RBD dopo 1 anno5,6,7,8,9. Sono necessarie ulteriori indagini per comprendere meglio l'immunità duratura e piattaforme di rilevamento degli anticorpi più sensibili possono aiutare ulteriormente tale lavoro. Anche le segnalazioni di immunità sostenuta di infezioni lievi da SARS-CoV-2, che suggeriscono risposte anticorpali a lungo termine, sono un'area di studio interessante e utile. Un metodo di rilevamento rapido e accurato è essenziale per il monitoraggio degli anticorpi nei sieri degli individui per fornire maggiori informazioni sull'immunità nella popolazione.

Come altri coronavirus, SARS-CoV-2 utilizza la glicoproteina spike sporgente per legarsi all'enzima-2 di conversione dell'angiotensina (ACE2) per avviare una cascata di eventi che portano alla fusione delle membrane virali e ^cellulari6,7. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che l'RBD della proteina Spike ha un ruolo cruciale nell'suscitare una risposta anticorpale potente e specifica contro SARS-CoV28,9,10,11. In particolare, le correlazioni osservate da Premkumar et al. tra il titolo dell'anticorpo legante RBD e la potenza di neutralizzazione sars-CoV-2 del plasma dei pazienti sono coerenti con RBD come compartimento immunogenico della struttura del ^virus9. Con questo in mente, molti test diagnostici disponibili per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 richiedono tempo e costi, richiedono una lunga procedura di incubazione e lavaggio (saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA]) o mancano di sensibilità e accuratezza (saggio immunologico a flusso laterale [LFIA])¹². Pertanto, un metodo sierologico complementare quantitativo e rapido di rilevamento degli anticorpi derivati da COVID-19 con elevata sensibilità, risposta rapida e costo relativamente basso servirebbe alla necessità di un test sierologico affidabile per la sorveglianza epidemiologica sars-CoV-2.

Collettivamente, i limiti degli attuali saggi sierologici hanno spinto lo studio del sistema di segnalazione bioluminescente come potenziale agente diagnostico in future indagini sierosoratorie. La bioluminescenza è una reazione enzima/substrato naturale, con emissione luminosa. La nanoluc luciferasi è la più piccola (19 kDa), ma il sistema più luminoso rispetto alla Renilla e alla lucciola luciferasi (36 kDa e 61 kDa, rispettivamente)^13,14. Inoltre, Nanoluc ha il più alto rapporto segnale/rumore e stabilità tra i sistemi precedentemente menzionati. L'elevata intensità del segnale di Nanoluc supporta il rilevamento anche di quantità molto basse di fusioni di ^reporter15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) è una versione divisa del sistema Nanoluc, che è composto da due segmenti: piccolo BiT (11 amminoacidi; SmBiT) e BiT di grandi dimensioni (LgBiT) con interazioni di affinità relativamente bassa (_KD = 190 μM ) per formare un complesso ^{luminescente16}. NanoBiT è ampiamente utilizzato in vari studi che coinvolgono l'identificazione delle interazioni proteina-proteina15,17,18,19 e delle vie di segnalazione cellulare11,20,21.

Recentemente, è stato introdotto un altro piccolo peptide con un'affinità nettamente superiore a LgBiT (_KD = 0,7 nM ), vale a dire il sistema HiBiT Nano-Glo, al posto di SmBiT. L'alta affinità e il segnale forte del test Nano-Glo "add-mix-read" rendono HiBiT un tag peptidico adatto, quantitativo e luminescente. In questo approccio, il tag HiBiT viene aggiunto alla proteina bersaglio sviluppando un costrutto che impone interferenze strutturali minime. La fusione HiBiT-proteina si legherebbe attivamente alla controparte LgBiT, producendo un enzima luciferasi altamente attivo per generare bioluminescenza rilevabile in presenza di reagenti di rilevamento (Figura 1). Allo stesso modo, abbiamo sviluppato un sistema basato su HiBiT Nano-Glo per misurare prontamente il titolo anticorpale neutralizzante nei sieri di individui recuperati da SARS-CoV-2 e recentemente abbiamo sviluppato un RBD SARS-CoV-2 con tag HiBiT. Questo documento descrive il protocollo per la produzione del bioreporter HiBiT-RBD utilizzando procedure e apparecchiature di laboratorio standard e mostra come questo bioreporter può essere utilizzato in un test rapido ed efficiente per rilevare gli anticorpi mirati a SARS-CoV-2 RBD.

Protocollo

NOTA: Il protocollo descritto di seguito aderisce a tutte le linee guida etiche secondo il codice di protocollo 20200371-01H.

1. Produzione e valutazione del bioreporter HiBiT-RBD

1. Produrre una quantità sufficiente di bioreporter HiBiT-RBD
   1. Prepararsi per la coltura cellulare
      1. Preparare il mezzo Eagle modificato (DMEM) completo di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina. Quindi, riscaldare il supporto a bagnomaria a 37 °C.
      2. Accendere l'armadio di sicurezza biologica (BSC) e utilizzare il 70% di etanolo v/v per sterilizzare la superficie dell'armadio.
   2. Coltivare la linea cellulare.
      1. Estrarre la linea cellulare da -80 °C o azoto liquido e scongelarla a bagnomaria a 37 °C.
         NOTA: Una linea cellulare appropriata è facile da mantenere in coltura, ha un'elevata efficienza di trasfezione ed è adatta per la produzione di proteine esogene. Rene embrionale umano, cellule HEK293 sono state utilizzate per questo protocollo.
      2. Mescolare le cellule scongelate con almeno 10 ml di mezzo completo, pipettare la sospensione cellulare su una capsula di Petri di 10 cm e ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule nel piatto. Posizionare il piatto in un incubatore di colture cellulari a 37 °C, 5% di _CO2 e 85-95% di umidità.
      3. Osservare le cellule al microscopio fino a quando il livello di confluenza raggiunge l'80-90%. Ad alta confluenza, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con soluzione salina calda tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere 1 ml di acido tetraacetico tripsina-etilendiammina allo 0,25% per staccare le cellule dalla superficie.
         NOTA: Le celle HEK293 si staccano abbastanza facilmente. Quindi, la fase di lavaggio dovrebbe essere eseguita molto delicatamente per evitare il distacco accidentale e la perdita di cellule.
      4. Dopo circa 5 minuti, guarda le cellule al microscopio. Se tutte le cellule sono galleggianti, aggiungere almeno 4 ml di mezzo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo sterile. Contare le cellule usando un emocitometro e aggiungere 1 × ¹⁰⁶ cellule in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per la trasfezione.
         NOTA: Dopo 24 ore, le cellule dovrebbero essere all'80% o più confluenti.
   3. Trasfezione del plasmide HiBiT-RBD
      1. Utilizzare 1 μg del plasmide di espressione HiBiT-RBD con un reagente di trasfezione adatto. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere il volume totale a ciascun pozzetto della piastra, in base alle gocce.
         NOTA: seguire il protocollo di trasfezione del produttore. In questo caso, una miscela (una quantità specificata) del reagente di trasfezione con DMEM è stata aggiunta al plasmide diluito (1 μg) in DMEM (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare un marcatore contenente (ad esempio, plasmide di proteina fluorescente verde [GFP]) come controllo per monitorare l'efficienza della trasfezione.
      2. Il giorno successivo, sostituire il mezzo contenente la miscela di trasfezione con il mezzo completo. Osservare bene il controllo della trasfezione 48 ore dopo la trasfezione.
         NOTA: Se la trasfezione è stata positiva ed efficiente (oltre l'80% GFP-positiva), le cellule dovrebbero essere pronte per la raccolta del bioreporter HiBiT-RBD. Il costrutto contiene anche His-tag, che può essere utilizzato per ottenere proteine purificate al posto del surnatante totale.
      3. Raccogliere il surnatante in microtubi da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di 1x tampone di lisi passiva (PLB) alle cellule; incubare e agitare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente per la lisi cellulare.
         NOTA: Il surnatante e la soluzione lisata possono essere conservati a -20 °C con lieve perdita di integrità per almeno 6 mesi. Secondo Azad et ^al.22, il reporter è stabile a un ampio intervallo di pH (4-12) e temperatura (4-42 °C).
2. Valutazione del segnale luminescente dal bioreporter mediante saggio della luciferasi
   1. Preparazione dei componenti di reazione
      1. Utilizzare il surnatante come fonte del bioreporter.
         NOTA: Sia il surnatante che il lisato contengono il bioreporter HiBiT-RBD e possono essere utilizzati per il test. Tuttavia, il surnatante è raccomandato come fonte a causa di ragioni spiegate nelle note seguenti.
      2. Diluire l'LgBiT e il substrato a 1x prima dell'uso (la concentrazione di stock è 100x).
         NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli su LgBiT.
   2. Saggio della luciferasi
      1. Trasferire 50 μL del surnatante da ciascun pozzo o tubo a una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 50 μL di 1x LgBiT a ciascun pozzetto. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Aprire il software del luminometro, aggiungere 50 μL di 1x substrato (furimazina) a ciascun pozzetto, posizionare la piastra nel luminometro ed eseguire il software.
         NOTA: Aggiungere il substrato immediatamente prima di leggere la piastra per evitare il consumo del substrato da parte degli enzimi attivi prima della misurazione del segnale.

2. Rilevamento dell'anticorpo anti-RBD con un test rapido e sensibile

1. Test di rilevamento degli anticorpi HiBiT-RBD
   1. Preparare il bioreporter HiBiT-RBD come descritto nella sezione 1.1 del protocollo.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare il surnatante per il seguente dosaggio in quanto è più semplice da raccogliere e contiene la versione glicosilata matura della proteina. Inoltre, il lisato ha diverse altre proteine che potrebbero interferire con l'interazione HiBiT-RBD-anticorpo.
   2. Combinare 50 μL del surnatante contenente HiBiT-RBD con 1 μg dell'anticorpo commerciale SARS-CoV-2-RBD in un microtubo da 1,5 mL. Aggiungere 20 μL di proteina legante le immunoglobuline (proteina G) alla soluzione. Aumentare il volume totale a 300 μL aggiungendo PBS.
      NOTA: Il volume totale della miscela può essere ridotto a 150 μL. Volumi totali inferiori non sono raccomandati in quanto potrebbero risultare in una miscelazione inadeguata degli anticorpi con il bioreporter.
   3. Incubare il tubo o i tubi su uno shaker o rotatore per 30 minuti. Centrifugare a 12.000 × g per 30 s, scartare il surnatante e lavare con PBS. Ripetere il processo tre volte per rimuovere HiBiT-RBD libero. Risospesso in 50 μL di PBS e trasferire in una piastra a 96 pozzetti.
   4. Aggiungere 50 μL di 1x LgBiT e attendere 5 min. Quindi, aggiungere 50 μL di 1 substrato NanoLuc. Leggere immediatamente il segnale luminescente con un luminometro.

3. Rilevamento ad alto rendimento degli anticorpi specifici di SARS-CoV-2 da campioni di siero del paziente

1. Preparare quantità maggiori del bioreporter HiBiT-RBD per un test ad alto rendimento seguendo la sezione 1.1 del protocollo.
2. Combinare 20 μL di proteina magnetica G con 50 μL del surnatante HiBiT-RBD in un pozzo di piastra a 96 pozzetti per ogni campione. Aggiungere 10 μL del campione di siero a ciascun pozzetto e portare il volume totale a 150 μL aggiungendo PBS.
   NOTA: Utilizzare sia IgG non specifici (controllo negativo) che anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 (controllo positivo) alla concentrazione di 1 μg/mL come descritto nel passaggio 2.1.2. Inoltre, i campioni di siero di topi vaccinati possono anche essere valutati per gli anticorpi. In questo test, i campioni di siero sono stati ottenuti dall'Ottawa Hospital General Campus secondo una procedura approvata e con il consenso informato degli individui.
3. Incubare per 30 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Posizionare la piastra su una rondella magnetica per precipitare il complesso di anticorpi G della proteina.
   NOTA: La struttura specifica della rondella magnetica farà precipitare il complesso sulle pareti laterali di ciascun pozzo.
4. Scartare la soluzione nella sezione centrale di ciascun pozzetto e aggiungere PBS per il lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio almeno tre volte per rimuovere l'eccesso di HiBiT-RBD. Aggiungere 50 μL di 1x PBS e 50 μL di 1x LgBiT. Incubare per almeno 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Preparare il software del luminometro, quindi aggiungere 50 μL di 1x substrato. Posizionare la piastra nella macchina, eseguire il software e registrare i segnali. Confronta i segnali provenienti da campioni di siero, campioni di controllo e sfondo (pozzetti vuoti).

Risultati

I segnali provenienti sia dal lisato cellulare contenente HiBit-RBD che dal surnatante delle cellule trasfettate sono stati registrati (Figura 2) per valutare la fonte proteica appropriata. HiBiT-RBD e LgBit sono stati utilizzati separatamente come controlli e i dati hanno mostrato uno sfondo basso rispetto a un segnale forte quando entrambe le parti sono state combinate. Pertanto, l'interazione HiBiT-RBD con LgBiT è necessaria per generare un enzima attivo per la digestione del substrato e...

Discussione

Il crescente numero di persone infette da SARS-CoV-2 e lo sforzo in corso per la vaccinazione globale richiedono test sierologici sensibili e veloci che possono essere utilizzati in indagini sierologiche su larga scala. Recenti ricerche dimostrano che i bioreporter a base di nanoluciferasi split possono essere utilizzati per sviluppare tali saggi. Recentemente abbiamo sviluppato il bioreporter HiBiT-RBD per progettare un test che possa essere utilizzato per rilevare gli anticorpi specifici di SARS-CoV-2 nel siero del paz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Passive Lysis Buffer	Promega	E194A	30 mL
Bio-Plex Handheld Magnetic Washer	Bio-Rad	171020100
DMEM	Sigma	D6429-500ml
Dual-Glo luciferase Assay System	Promega	E2940	100 mL kit
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
HiBiT-RBD Plasmid			gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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LgBiT	Promega	N3030
penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pierce Protein G Magnetic Beads	Thermo Fisher Scientific	88848
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	SinoBiological	40592-MM57
Synergy Mx Microplate Reader	BioTek		96-well plate reader luminometer
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	2520056	0.25%