Campionamento del tessuto adiposo sottocutaneo umano utilizzando una tecnica di mini-liposuzione

Riepilogo

Il manoscritto e il video associato dimostrano una tecnica di biopsia percutanea per ottenere campioni di tessuto adiposo sottocutaneo dalle aree circostanti l'ombelico. Questo metodo è un modo a basso rischio ed efficiente per studiare una serie di parametri (ad esempio, espressione genica o proteica, attività enzimatica, contenuto lipidico) all'interno del tessuto adiposo.

Abstract

Gli studi sul tessuto adiposo sono utili per comprendere le condizioni metaboliche e di altro tipo. Il tessuto adiposo sottocutaneo umano è accessibile. Con una formazione adeguata e una stretta aderenza alla tecnica asettica, i campioni adiposi sottocutanei possono essere ottenuti in modo sicuro ed efficiente in un ambiente non clinico dai ricercatori. Dopo la somministrazione di anestetico locale laterale all'ombelico, un ago da 14 G attaccato a una siringa da 5 o 10 ml viene inserito attraverso la pelle nel tessuto sottocutaneo. Sotto aspirazione, la siringa viene mossa in un movimento alternativo e affettato per isolare frammenti di tessuto adiposo. Prelevare lo stantuffo è sufficiente per garantire che i frammenti di tessuto adiposo vengano aspirati attraverso l'ago nella siringa. Una singola biopsia può raccogliere circa 200 mg di tessuto. Questa tecnica di biopsia è molto sicura sia per i partecipanti che per il personale di ricerca. Dopo la biopsia, i partecipanti possono riprendere la maggior parte delle attività quotidiane, anche se dovrebbero evitare il nuoto e attività eccessivamente faticose per 48 ore per evitare sanguinamenti eccessivi. I partecipanti possono sottoporsi in sicurezza a 2 biopsie in un solo giorno, il che significa che la tecnica può essere applicata in studi di intervento acuto prima-dopo.

Introduzione

Il tessuto adiposo può fornire informazioni utili sulla funzione metabolica degli esseri umani. Il tessuto adiposo sottocutaneo umano è facilmente accessibile. Una tecnica per l'estrazione del tessuto adiposo sottocutaneo è stata descritta per la prima volta a metà degli anni '80¹; Da allora, il protocollo iniziale è stato migliorato per aumentare la resa e migliorare la tollerabilità dei partecipanti allo studio. Il tessuto adiposo sottocutaneo può essere ottenuto da numerosi siti, più comunemente dal gluteo¹ e dalla zona addominale². I campioni di quest'ultimo possono essere più desiderabili in quanto forniscono informazioni più preziose in contesti correlati alla malattia metabolica³.

La biopsia del tessuto adiposo sottocutaneo utilizzando il metodo mini-liposuzione può essere eseguita in modo sicuro ed efficiente in un contesto non clinico. A seguito di un'adeguata formazione da parte di un medico certificato e utilizzando una rigorosa tecnica asettica, i ricercatori possono eseguire regolarmente queste biopsie con un rischio minimo sia per i partecipanti che per gli investigatori. Il team di biopsia deve essere composto da almeno 2 persone: la persona che eseguirà la biopsia e un assistente.

La persona responsabile della biopsia ha il compito di confermare l'identità del partecipante, controllare che il partecipante possa sottoporsi in sicurezza alla procedura (vedere i passaggi del protocollo 2.1-2.4 di seguito), assicurarsi che il partecipante sia a proprio agio durante tutta la procedura, garantire che la tecnica sterile sia mantenuta durante tutta la procedura, eseguire la procedura e fornire al partecipante procedure post-trattamento verbali e scritte. Il ruolo dell'assistente è quello di gestire e processare rapidamente il tessuto adiposo ottenuto per successive analisi e/o stoccaggio. L'assistente aiuta anche essendo le "mani non sterili" e assicurando che il partecipante sia a suo agio durante tutta la procedura. Lo scopo di questo video e articolo è quello di descrivere la procedura di biopsia passo-passo per ottenere in modo sicuro il tessuto adiposo sottocutaneo dalla zona addominale.

Protocollo

NOTA: L'Università di Stirling NHS, Invasive, o Clinical Research Committee ha approvato la procedura di biopsia descritta di seguito. Tutti gli studi di ricerca che utilizzano questa procedura devono essere approvati dal comitato etico indipendente competente. Il partecipante alla biopsia deve aver completato una formazione formale nella tecnica descritta in conformità con i requisiti del proprio istituto. In genere, ciò comporta l'osservazione di una dimostrazione della tecnica di biopsia del tessuto adiposo descritta da parte di un medico certificato, seguita da una pratica supervisionata. Una volta che il tirocinante ha eseguito 10 biopsie di tessuto adiposo su soggetti volontari sotto supervisione, saranno esaminati da un medico certificato per garantire una buona conoscenza e pratica della procedura. Il medico certificato fornisce quindi all'individuo un modulo di esame firmato.

1. Preparazione della sala di laboratorio

1. Assicurarsi che il laboratorio abbia una stanza adeguatamente privata con superfici pulite e pulibili e non porose e un letto pulito e confortevole (preferibilmente non poroso) su cui il partecipante possa sdraiarsi supino. Pulire tutte le superfici necessarie per la procedura di biopsia utilizzando spray etanolo al 70% e asciugamani di carta puliti. Fornire cuscini o cuscini puliti per sostenere il partecipante, se necessario.
2. Tenere appositi contenitori per lo smaltimento degli oggetti taglienti e i sacchetti per rifiuti a rischio biologico a portata di mano dell'area in cui viene eseguita la biopsia e a portata di mano della persona che esegue la biopsia.
3. Preparare l'attrezzatura necessaria per la procedura e installarla su un carrello medico generale appena pulito prima che il partecipante arrivi al laboratorio (Figura 1). Per un elenco completo dei materiali di consumo necessari, vedere la tabella dei materiali.

2. Preparazione dei partecipanti

1. Assicurarsi che tutti i partecipanti forniscano il consenso informato scritto prima di sottoporsi alla procedura in conformità con i protocolli richiesti dal comitato etico indipendente dell'istituzione. Inoltre, chiedere ai partecipanti di compilare un questionario scritto per assicurarsi che non siano allergici a qualsiasi materiale utilizzato nella procedura (vale a dire, nichel, cromo, anestetico locale, iodio, crostacei e cerotti).
2. Confermare l'identità del partecipante. Assicurarsi che il partecipante comprenda la procedura da eseguire e i potenziali effetti secondari, tra cui lividi, dolore e infezione (Tabella 1). Raccogliere il consenso verbale in aggiunta al consenso informato scritto precedentemente ottenuto.
3. Descrivi al partecipante come verrà eseguita la procedura, con enfasi su come si sentirà la somministrazione dell'anestetico e la biopsia stessa. Assicurati che il partecipante sia a suo agio nel procedere.
   NOTA: L'anestetico sottocutaneo locale produrrà una sensazione di bruciore, simile a una puntura d'ape di breve durata. Molti partecipanti riferiscono la somministrazione di anestetico come la parte più scomoda della tecnica. Una volta che l'anestetico ha avuto effetto, il partecipante non dovrebbe sentire più di una leggera sensazione di strattone durante la biopsia.
4. Assicurarsi che il partecipante non abbia allergie all'anestetico locale (in particolare dal tipo ammino-ammide, se si utilizza lidocaina o simili), alcuni metalli (nichel e cromo) e crostacei (se si utilizzano soluzioni a base di iodio). Inoltre, assicurarsi che i partecipanti non stiano assumendo alcuna forma di farmaco anticoagulante.
5. Fornire al partecipante l'opportunità di andare a svuotare la vescica, se necessario, per assicurarsi che non debbano interrompere la procedura o provare un disagio eccessivo nel passaggio 4.1.

3. Procedura di biopsia - istruzioni per il rilevatore di biopsia

1. Una volta che il partecipante è sdraiato in posizione supina, identificare il sito della biopsia a circa 5-10 cm lateralmente all'ombelico.
   NOTA: Se il partecipante deve sottoporsi a più biopsie nello stesso giorno, identificare i siti di biopsia sui lati opposti dell'ombelico per ogni biopsia. Ciò garantirà la massima distanza tra ciascun sito di biopsia.
2. Lavarsi le mani con sapone e acqua tiepida secondo le linee guida mediche standard⁴.
3. Posizionare il foglio sterile sul carrello pulito o sull'area di lavoro, avendo cura di toccare solo i bordi esterni del foglio.
4. Indossare guanti chirurgici sterili utilizzando una tecnica asettica adeguata. Chiedere all'assistente di aprire il resto dell'apparecchiatura in modo tale che cada sul foglio sterile preparato senza toccare/contaminare l'apparecchiatura. Assicurati che l'assistente faccia attenzione a non toccare gli oggetti quando rimuove gli strumenti dai loro involucri sterili.
5. Istruire l'assistente a erogare una piccola quantità di soluzione a base di iodio su una garza sterile (senza saturare eccessivamente la garza) sul piano di lavoro.
6. Sterilizzare circa 5-10 cm² intorno al sito di biopsia scelto utilizzando la garza sterile e la soluzione a base di iodio. Assicurarsi che la pelle sia pulita in un movimento a spirale che si muove verso l'esterno dal sito di biopsia proposto. Ripetere la procedura di pulizia della pelle due volte. Rimuovere il liquido in eccesso (ad esempio, che scorre dall'area sterile) pulendo con una garza sterile fresca.
7. Insieme all'assistente, confermare verbalmente il contenuto della fiala di anestetico locale (2% di lidocaina in questo protocollo) e che questo è entro la sua data di scadenza. Istruire l'assistente a tenere il flaconcino aperto capovolto e aspirare 5 mL di anestetico locale in una siringa, usando un ago da 21 G. Gettare l'ago nel cestino degli oggetti taglienti e assicurarsi che la siringa sia priva di bolle d'aria.
8. Applicare un ago da 26 G sulla siringa ed espellere eventuali bolle d'aria. Pizzicare delicatamente la pelle addominale e il tessuto adiposo, allontanandolo dalla parete addominale. Quindi, inserire l'ago orizzontalmente nel tessuto sottocutaneo con un angolo non superiore a 10° rispetto alla superficie della pelle.
   1. Aspirare lo stantuffo della siringa di altri 0,5 ml (per assicurarsi che l'ago non sia in un vaso sanguigno). Se nella siringa compare sangue, prelevare e reinserire l'ago con un'angolazione diversa.
   2. Sollevare un bleb di 2-4 mm di diametro per anestetizzare l'area di inserimento.
   3. Far avanzare l'ago nel tessuto sottocutaneo e somministrare ~1 mL di lidocaina a forma di ventaglio (Figura 2), avendo cura di prelevare lo stantuffo ogni volta prima di iniettare l'anestetico.
   4. Rimuovere e smaltire l'ago da 26 G, applicare un ago da 21 G sulla siringa, espellere eventuali bolle d'aria e somministrare i restanti ~4 ml di lidocaina a forma di ventaglio (Figura 2), avendo cura di prelevare lo stantuffo ogni volta prima di iniettare l'anestetico.
9. Attendere circa 5 minuti affinché l'anestetico locale abbia effetto. Utilizzare un bisturi sterile per spingere delicatamente l'area della biopsia a i) assicurarsi che l'anestetico locale abbia avuto effetto e ii) identificare i confini dell'area anestetizzata. Se necessario, attendere un altro minuto o due e rivalutare.
10. Una volta accertato che l'anestetico locale sta funzionando, pizzicare delicatamente la pelle e il tessuto adiposo (come nel punto 3.8) e utilizzare un bisturi sterile per fare una piccola puntura di 1-2 mm nella pelle.
    NOTA: Questo deve essere abbastanza grande da facilitare l'ingresso dell'ago da 14 G e deve essere abbastanza piccolo da non richiedere alcuna sutura per chiuderlo. È comune che da questo punto in poi si verifichi un sanguinamento, che può essere controllato con un pezzo di garza sterile.
11. In primo luogo, applicare un ago da 14 G su una siringa da 5 o 10 ml. Quindi, mentre si pizzica delicatamente la pelle e il tessuto adiposo, inserire gradualmente l'ago attraverso la puntura nel tessuto adiposo approssimativamente centralmente nella zona anestetizzata e con un angolo non superiore a 10 ° rispetto alla superficie della pelle.
    NOTA: Per tutti i casi di avanzamento dell'ago al punto 3.11, deve essere mantenuto un angolo della siringa non superiore a 10°.
    1. Applicare l'aspirazione estraendo lo stantuffo a circa 2,5 ml. Fai la biopsia muovendo l'ago in un rapido movimento avanti e indietro per tagliare frammenti di tessuto adiposo. Dopo circa 30 secondi, ruotare l'ago e la siringa di 90° e ripetere questa procedura per rompere i frammenti di tessuto adiposo, che vengono poi aspirati nella siringa mediante aspirazione.
       NOTA: è possibile utilizzare siringhe di altre dimensioni. È essenziale che il ricercatore scelga una dimensione della siringa che consenta sia una buona presa sulla siringa sia di mantenere comodamente la retrazione dello stantuffo per il mantenimento del vuoto. Sono disponibili siringhe di bloccaggio che mantengono il vuoto, che possono migliorare il controllo dell'ago e ridurre la difficoltà percepita per il bioptico ⁵.
    2. Dopo circa 45-60 secondi del punto 3.11.1, rimuovere l'ago e svuotare il contenuto della siringa su uno strato di garza che copre una barca per pesare. Assicurarsi che il lume dell'ago sia rivolto verso il basso per evitare potenziali schizzi di sangue.
    3. Ripetere i passaggi 3.11.1 e 3.11.2 per un massimo di 3 volte. Verificare che il partecipante si accontenti di procedere prima di ogni ripetizione della procedura di cui sopra.
    4. Durante l'esecuzione delle fasi 3.11.1 e 3.11.2, istruire l'assistente a elaborare e preparare i campioni per l'analisi/conservazione (vedere paragrafo 5).

4. Procedura post-biopsia

1. Una volta ottenuto un campione soddisfacente (cioè ~ 200 mg) di tessuto adiposo, posizionare 1-2 strati di garza sterile sulla ferita da puntura, quindi posizionare un impacco di ghiaccio su questi e applicare una pressione decisa per circa 10 minuti per indurre l'emostasi.
2. Quando si è verificata l'emostasi, pulire via qualsiasi soluzione a base di iodio / sangue secco con una garza sterile e applicare una medicazione adesiva per ferite con tampone assorbente sul sito. Verificare che il partecipante si senta bene e fornire istruzioni verbali e scritte sul sito di biopsia.
   1. Sottolinea che i partecipanti mostreranno probabilmente qualche livido per i prossimi giorni. Informali che questo può essere sostanziale, anche se è ridotto al minimo dalla banchisa al punto 4.1 e si risolverà senza effetti duraturi.
   2. Raccomandare che se i partecipanti avvertono qualsiasi disagio / dolore una volta che l'anestetico è svanito, dovrebbero assumere analgesici come il paracetamolo seguendo le istruzioni sul pacchetto, ma astenersi dall'assumere analgesici che hanno attività anticoagulanti (ad esempio, ibuprofene o aspirina).
   3. Spiegare che gonfiore, arrossamento o scarico dal sito della biopsia sono indicazioni di infezione. Nell'improbabile eventualità che si verifichino questi segni o sintomi, istruire il partecipante a consultare urgentemente un medico o un'unità di emergenza locale. Informare il partecipante che se cerca un consiglio medico, deve anche informare il team di ricerca.
      NOTA: Come personale di ricerca, né il rilevatore della biopsia né l'assistente possono fornire consulenza o trattamento medico; Tuttavia, è importante che il team di ricerca sia a conoscenza e registri tutti i casi di complicanze derivanti dalla procedura di biopsia.
   4. Raccomandare ai partecipanti di evitare il nuoto o attività eccessivamente faticose per 48 ore fino a quando il sito di incisione non si è chiuso.
3. Rimuovere eventuali oggetti taglienti usati e materiali contaminati in appositi contenitori per oggetti taglienti e/o rifiuti clinici.
4. Pulire tutte le superfici utilizzate nella procedura di biopsia utilizzando spray etanolo al 70% e asciugamani di carta puliti. Collocare gli articoli monouso e non monouso in appositi sacchetti clinici per lo smaltimento o la pulizia, rispettivamente.

5. Elaborazione del campione - istruzioni per l'assistente

1. Utilizzare pinzette sterili e soluzione salina allo 0,9% per risciacquare il campione di tessuto adiposo per rimuovere i contaminanti visibili (cioè sangue, vascolarizzazione). Quindi, pesare i campioni di tessuto adiposo utilizzando bilance digitali. Dividere il tessuto in pezzi di dimensioni appropriate per l'analisi a valle e posizionarli in appositi tubi di stoccaggio utilizzando pinzette sterili. Immergere le provette contenenti le biopsie del tessuto adiposo in azoto liquido a -190 °C per congelare i campioni fino a conservare i campioni a -80 °C.
   NOTA: l'assistente deve completare l'elaborazione del campione il più rapidamente possibile, in genere entro 3 minuti dall'aspirazione del campione, per ridurre al minimo la potenziale degradazione del campione.

Risultati

La procedura di biopsia del tessuto adiposo descritta è una tecnica efficiente e a basso rischio per i ricercatori per ottenere campioni di tessuto adiposo sottocutaneo da volontari umani. Abbiamo eseguito 39 biopsie del tessuto adiposo sottocutaneo utilizzando la procedura descritta in 11 donne sane e normopeso (età, 27,4 ± 3,3 anni; indice di massa corporea (BMI), 22,6 ± 1,5 kg.m²). Tutti i partecipanti hanno frequentato il laboratorio tra le 07:00 e le 10:00 dopo un periodo di digiuno di 8-12 ore. La re...

Discussione

Il protocollo descritto e il video associato forniscono una panoramica passo-passo di una tecnica di mini-liposuzione per ottenere campioni di tessuto adiposo sottocutaneo dalla zona addominale. Questo gruppo di ricerca ha eseguito un totale di 124 biopsie nel corso di 19 mesi senza effetti avversi nei partecipanti. La procedura è sicura e associata a un rischio minimo per i partecipanti o il team di biopsia, a condizione che vengano seguite le misure di sicurezza descritte. La tecnica asettica (compresa l'apertura e l'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item: 14 G needle 14 G x 3 1/8" 210 mm x 80 mm	B Braun	4665473	Per biopsy: 1
Item: 21 G needle 21 G x 1 1/2" 0.8 mm x 38 mm	Terumo	AN*2138R1	Per biopsy: 2
Item: 26 G  needle 26 G x 1/2" microlance needle 0.45 mm x 13 mm	BD	303800	Per biopsy: 2
Item: 5 mL syringe 5 mL luer	DB plastipak	302187	Per biopsy: 2
Item: Adhesive wound dressing Opsite Post-Op Dressing 9.5 x 8.5	Smith & Nephew	6600709	Per biopsy: 1
Item: Disposable sterile scalpel Disposable Scalpel Sterile Blade no. 10	Swann Morton	/0501	Per biopsy: 1
Item: Icepack BlueDot Reusable Hot/Cold Pack 26.5 cm x 13.0 cm	NuCare	F711	Per biopsy: 1
Item: Iodine based antiseptic Videne antiseptic solution	Ecolab Videne	3030440	Per biopsy: q.s
Item: Lidocaine 2% w/o epinephrine Lidocaine 2% injection 5 mL	B Braun	3558553	Per biopsy: 5 mL
Item: Non-sterile gloves Starguard sensitive powder free nitrile gloves	Starguard	SG-N-S	Per biopsy: pair
Item: Sodium chloride 0.9% Sodium chlride 0.9% w/v intravenous infusion BP	BBraun	S8004-5384	Per biopsy: q.s.
Item: Stabilization solution* RNAlater Stabilization Solution	ThermoFisher Scientific	AM7020	Per biopsy: q.s
Item: Sterile forceps Sterile forceps	Rocialle	RML109-006	Per biopsy: 1
Item: Sterile gauze swabs Non woven swabs sterile 7.5 x 7.5 cm	Prestige	1860	Per biopsy: 5
Item: Sterile gloves Prestige soft vinyl sterile powder free medical gloves	Prestige	S: P4301 M:P3302 L:P3301	Per biopsy: pair
Item: Sterile Microcentrifuge tubes 1.5 mL Sterile Microcentrifuge Tubes	StarLab	I1415-5510	Per biopsy: q.s
Item: Sterile sheet Paper plain white 90 x 90 cm	Rocialle	RML 126-216	Per biopsy: 1
Item: Weighing boat Diamond shape weigh boats	Heathrow Scientific	HS1427C	Per biopsy: 1
* denotes optional materials