Produzione rapida, economica e semplice di lisato privo di cellule batteriche

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per produrre lisato batterico per l'espressione genica senza cellule, utilizzando un ceppo ingegnerizzato di Escherichia coli e richiedendo solo attrezzature di laboratorio standard.

Abstract

L'espressione genica senza cellule offre il potere della biologia senza le complicazioni di un organismo vivente. Sebbene esistano molti di questi sistemi di espressione genica, la maggior parte sono piuttosto costosi da acquistare e / o richiedono attrezzature speciali e competenze finemente affinate per produrre in modo efficace. Questo protocollo descrive un metodo per produrre lisato batterico privo di cellule che supporta alti livelli di espressione genica, utilizzando solo apparecchiature di laboratorio standard e richiedendo un'elaborazione minima. Il metodo utilizza un ceppo di Escherichia coli che produce un'endolisina che non influisce sulla crescita, ma che lisa in modo efficiente un pellet cellulare raccolto seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. L'unica ulteriore elaborazione richiesta è una breve incubazione seguita da centrifugazione per eliminare l'autolizzato dai detriti cellulari. I circuiti genici dinamici possono essere ottenuti attraverso l'espressione eterologa della proteasi ClpX nelle cellule prima della raccolta. Un ceppo di E. coli privo del gene lacZ può essere utilizzato per applicazioni di biorilevamento ad alta sensibilità e prive di cellule utilizzando una lettura colorimetrica o fluorescente. L'intero protocollo richiede solo 8-9 ore, con solo 1-2 ore di lavoro pratico dall'inoculazione al completamento. Riducendo i costi e i tempi per ottenere lisato senza cellule, questo metodo dovrebbe aumentare l'accessibilità economica dell'espressione genica senza cellule per varie applicazioni.

Introduzione

L'espressione genica nei lisati privi di cellule ha diversi vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule vive^1,2,3,4. I lisati possono essere facilmente modificati biochimicamente e utilizzati in condizioni che potrebbero essere dannose o impossibili da ottenere nelle cellule vive. I circuiti di espressione genica non devono competere o competere con i processi biologici dell'ospite e testare nuovi circuiti genetici è semplice come aggiungere DNA. Per questi motivi, l'espressione genica cell-free ha trovato varie applicazioni, dai biosensori^5,6 alla prototipazione rapida di circuiti genici sintetici^7,8 allo sviluppo di cellule artificiali^9. La maggior parte dell'espressione genica senza cellule utilizza lisati cellulari che sono stati altamente elaborati, generalmente richiedendo protocolli lunghi e complessi, attrezzature specializzate e / o passaggi sensibili che possono portare a variazioni significative tra utenti e lotti^10,11.

Questo documento descrive un metodo semplice ed efficiente per la produzione di lisato senza cellule che richiede un'elaborazione e un'esperienza minime (Figura 1A)¹². Il metodo si basa su cellule di E. coli che sono progettate per lisare seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Le cellule esprimono un'endolisina dal fago lambda che degrada la parete cellulare. Mentre le cellule crescono, questa endolisina rimane nel citoplasma, sequestrata dalla parete cellulare. Tuttavia, un semplice ciclo di congelamento-disgelo interrompe la membrana citoplasmatica, rilasciando l'endolisina nel periplasma, dove degrada la parete cellulare, con conseguente rapida lisi cellulare. Il protocollo può essere completato con poche ore di lavoro pratico e richiede solo un congelatore, una centrifuga capace di 30.000 × g (per risultati ottimali; velocità inferiori possono essere utilizzate con maggiore attenzione per non disturbare il pellet), un miscelatore a vortice e una semplice soluzione tampone. Il lisato funzionale può anche essere prodotto liofilizzando le cellule e reidratandole in situ. Tuttavia, questo metodo produce lisati con attività inferiore, presumibilmente a causa dei detriti cellulari rimanenti.

I lisati sono altamente attivi per l'espressione genica senza cellule e possono essere migliorati in vari modi a seconda dell'uso finale. La velocità di sintesi proteica può essere ulteriormente aumentata concentrando il lisato utilizzando concentratori di spin standard. Il DNA lineare può essere protetto dalla degradazione aggiungendo proteine GamS purificate. La degradazione delle proteine, necessaria per dinamiche circuitali più complesse come l'oscillazione, può essere ottenuta coesprimendo un esamere ClpX nel ceppo¹³produttore di autolizzato. Infine, le letture visive basate su LacZ sono abilitate utilizzando un ceppo autolizzato privo di lacZ. Nel complesso, questo metodo produce lisato privo di cellule altamente attivo che è adatto per una vasta gamma di applicazioni.

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Protocollo

1. Preparare supporti e buffer.

1. Preparare 2xYTPG medio.
   1. Mescolare 62 g di polvere 2xYT, 5,99 g di fosfato di potassio monobasico, 13,93 g di fosfato di potassio bibasico e acqua deionizzata a 2 L.
   2. Autoclave su ciclo liquido con un tempo di esposizione di 30 min^14.
   3. A 400 mL di 2xYTP media da 1.1.2, aggiungere 7,2 g di D-glucosio (destrosio) e mescolare fino a quando non si scioglie.
   4. Filtrare-sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 μm.
2. Preparare il buffer S30A.
   1. Mescolare Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM di concentrazione finale), glutammato di potassio (60 mM finale) e glutammato di magnesio (14 mM finale).
   2. Regolare il pH a 7,7 utilizzando 10 M KOH.
3. Preparare la soluzione 1 (vedere Tabella 1).
   1. Sospendere l'acido 4-(2-idrossietil)-1- piperazineetanosolfonico (HEPES) in 2 ml di acqua.
   2. Regolare il pH a 8,0 usando KOH.
   3. Aggiungere tutti gli altri componenti dalla Tabella 1.
   4. Regolare il pH a 7,6 utilizzando 10 M KOH. Filtro-sterilizzare.
4. Preparare una soluzione premiscelata 2,5x (vedere Tabella 2).
   1. Mescolare tutti i componenti nella Tabella 2.
   2. Regolare il pH a 7,5 utilizzando KOH.
   3. Aliquota e congelamento a -80 °C.
      NOTA: una reazione da 20 μL utilizza 8,9 μL di premiscela.

2. Preparare le cellule.

1. Strisciare le cellule autolizzate su piastre di agar LB contenenti ampicillina da 50 μg/mL utilizzando un ciclo inoculante e crescere a 37 °C (vedere Nota 1).
2. Scegliere una singola colonia in una coltura iniziale di LB/ampicillina media usando una punta di pipetta e crescere a 37 °C durante la notte.
3. Inoculare 400 mL di terreno 2xYTPG contenente ampicillina da 50 μg/mL con 400 μL di coltura iniziale e crescere a 37 °C in un matraccio Erlenmeyer da 1 L, agitando a 300 giri/min.
4. Misurare periodicamente la densità ottica della coltura a 600 nm (OD₆₀₀) utilizzando uno spettrofotometro per leggere una cuvetta ottica con una lunghezza del percorso di 1 cm. Quando l'OD₆₀₀ supera 1, iniziare a diluire la coltura 5 volte prima delle misurazioni per garantire che le misurazioni rimangano all'interno dell'intervallo lineare di un tipico spettrofotometro da laboratorio. Continuare a far crescere le cellule fino a quando la coltura diluita 5 volte raggiunge OD₆₀₀ di 0,3 (corrispondente a una coltura OD₆₀₀ di 1,5).

3. Preparare il lisato.

1. Preparare il tampone S30A integrato con 2 mM di ditiotreitolo (DTT). Miscelare 3 mL di tampone S30A con 6 μL di soluzione madre DTT a 1 M. Posto su ghiaccio per l'uso nel passaggio 3.7.
2. Raccogliere le cellule centrifugando a 1800 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Scartare il surnatante versandolo e usando un pipetto per rimuovere il liquido rimanente.
4. Risospendare il pellet in 45 mL di tampone freddo (4-10 °C) S30A utilizzando un miscelatore a vortice.
5. Pesare un tubo centrifugo vuoto da 50 ml, trasferire le celle al suo interno e ripetere i passaggi 3.2-3.3 per lavare le celle.
6. Pesare il pellet, sottraendo il peso di un tubo vuoto da 50 ml. Assicurarsi di aspirare accuratamente qualsiasi surnatante rimanente per garantire una misurazione accurata del peso del pellet.
   NOTA: Una resa tipica è di ~ 1,3 g di pellet cellulare da 400 ml di coltura di produzione.
7. Aggiungere 2 volumi di tampone S30A freddo integrato con 2 mM di ditiotreitolo, cioè 2 mL di tampone per ogni 1 g di pellet cellulare, e risospesciare le cellule mescolando vigorosamente il vortice.
8. Congelare le cellule. Posizionare il tubo da 50 ml contenente le celle in un congelatore a -20 °C o -80 °C fino a quando il pellet non è completamente congelato.
   NOTA: il passaggio di congelamento è un buon punto di arresto per la giornata.
9. Scongelare le celle in un bagno d'acqua a temperatura ambiente.
10. Vortice vigoroso per 2-3 min.
11. Incubare a 37 °C per 45 minuti con agitazione a 300 giri/min.
12. Eliminare il campione da detriti cellulari pesanti centrifugando in tubi centrifugati trasparenti a 30.000 × g per 45 minuti a 4 °C.
    NOTA: se non è disponibile una centrifuga capace di 30.000 x g, centrifugare per 45 minuti a 21.000 × ge prestare maggiore attenzione nel passaggio 3.13, poiché il pellet sarà meno compatto.
13. Trasferire con cura il surnatante in un nuovo tubo con una pipetta, evitando di disturbare il più possibile il pellet. Se il surnatante trasferito è contaminato da materiale dal pellet, ripetere il passaggio precedente.
14. Trasferire il surnatante in tubi centrifughi da 1,5 mL e centrifugare ancora una volta a 21.000 × g (o la velocità massima di una centrifuga da tavolo) per 5 minuti.
15. Aliquotare l'autolisi eliminata nei volumi desiderati, evitando accuratamente qualsiasi pellet rimanente, e congelare a -80 °C o utilizzare immediatamente.
    NOTA: Una singola reazione da 20 μL utilizza 8 μL di autolizzato.

4. Espressione genica senza cellule

NOTA: l'autolizzato è ora pronto per qualsiasi uso finale desiderato. Di seguito è riportato un protocollo standard di esempio per l'espressione genica senza cellule.

1. Per una reazione di 20 μL, mescolare su ghiaccio 8 μL di autolizzato e 8,9 μL di premiscela. Vedi NOTA alla fine della sezione del protocollo riguardante l'ottimizzazione delle concentrazioni di glutammato magnesio e PEG 8000.
2. Aggiungere DNA (ad esempio, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 a una concentrazione finale di 8 nM), qualsiasi altro reagente e acqua a 20 μL.
3. Posizionare la reazione in una micropiastra a 384 pozzetti e misurare il decorso temporale di fluorescenza e/o gli endpoint utilizzando un lettore di piastre. Per la proteina fluorescente verde (GFP), utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nm.

5. Modifiche del protocollo

Nota : le seguenti modifiche del protocollo consentono di servire altre applicazioni.

1. Espressione genica senza cellule utilizzando modelli di DNA lineare
   1. Eseguire i passaggi di cui al paragrafo 4, integrando la reazione con una proteina GamS purificata da 2,2 μM (espressa e purificata come descritto¹²⁾prima dell'aggiunta del DNA lineare.
2. Espressione genica priva di cellule che incorpora la degradazione proteica
   1. Nel passaggio 2.1, utilizzare cellule autolizzate contenenti il plasmide pACYC-FLAG-dN6-His (vedere la tabella dei materiali). In tutti i mezzi di crescita, includono anche 34 μg / mL di cloramfenicolo.
   2. Nella fase 2.3, includere 40 μM isopropil β-D-1-tiogalattopoliranoside (IPTG) nel mezzo di crescita per indurre l'espressione dal plasmide.
   3. Ripetere i passaggi 3.2-3.4 (lavaggio) altre due volte (per un totale di tre lavaggi) per garantire la completa rimozione del cloramfenicolo, che è un inibitore della traduzione. Per i primi due lavaggi (fase 3.4), sostituire il tampone S30A con soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7.4).
   4. Nel passaggio 4.2, integrare con un ulteriore 3 mM di ATP (aggiunto da una soluzione madre di 100 mM di ATP in acqua, pH 7,2) e 4,5 mM di glutammato di magnesio (utilizzando una soluzione madre da 1 M in acqua) (concentrazioni finali) per compensare l'elevato uso di ATP da parte di ClpXP, nonché la chelazione del magnesio da parte dell'ATP aggiuntivo.
3. Espressione genica senza cellule mediante letture basate su LacZ (inclusa colorimetrica)
   1. Nel passaggio 2.1, utilizzare celle autolizzate che non esprimono nativamente LacZ (vedere la tabella dei materiali).
4. In alternativa, preparare il lisato direttamente dalle cellule liofilizzate.
   1. Eseguire tutti i passaggi dalla versione 1.1 alla versione 3.7.
   2. Miscelare 8 μL di sospensione cellulare con 8,9 μL di premiscela.
   3. Aggiungere DNA plasmidico (se lo si desidera), altri reagenti personalizzati e acqua per raggiungere un volume finale di 20 μL.
   4. Trasferire la reazione su una micropiastra a 384 pozzetti e liofilizzarla.
      NOTA: i campioni liofilizzati possono essere conservati per un massimo di una settimana e possibilmente più a lungo.
   5. Per iniziare la reazione, reidratarla con 18 μL di acqua deionizzata integrata con qualsiasi DNA desiderato o altri reagenti.
   6. Segui le dinamiche di fluorescenza in un lettore di lastre.

NOTA 1: Le cellule autolizzate sono progettate per lisare in un ciclo di congelamento-disgelo, quindi è particolarmente importante utilizzare il crioprotettore quando si producono scorte congelate. Abbiamo congelato le scorte al 24% di glicerolo wt/vol e le abbiamo conservate a -80 °C.

NOTA 2: Gli ioni di magnesio e PEG 8000 sono fondamentali per le prestazioni del lisato. La premiscela di base 2,5x, basata su dati precedentemente pubblicati, contiene 6 mM di glutammato di magnesio e 4,8% wt/vol PEG 8000, che diventano rispettivamente 2,4 mM e 1,9%, nella reazione finale. L'autolizzato preparato con il protocollo qui in genere funziona meglio con un ulteriore 5 mM Mg-glutammato e 1,5% PEG 8000 nella reazione finale. Tuttavia, questo può essere ottimizzato nell'intervallo di un ulteriore glutammato 0-10 mM Mg e un ulteriore 0-3% PEG 8000 (rispetto alla premiscela di base). Per preparare la premiscela con i raccomandati 5 mM di Mg-glutammato e 1,5% di PEG 8000 (concentrazioni finali), mescolare 380 μL di premiscela con 4,75 μL di glutammato di magnesio a 1 M e 36,1 μL di PEG 8000 al 40% peso/volume.

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Risultati

I risultati rappresentativi possono essere osservati utilizzando l'autolizzato per esprimere GFP da un plasmide che esprime costitutivamente, qui pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, e registrando un corso temporale di fluorescenza GFP in un lettore di piastre (Figura 1B). Una serie di diluizione di DNA plasmidico ha trovato una forte espressione anche a 1 nM di DNA. Rispetto ad un lisato disponibile in commercio, l'autolizzato può produrre una maggiore resa totale e raggiungere un maggiore ta...

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Discussione

Il protocollo qui descritto produce lisato batterico altamente attivo per l'espressione genica senza cellule. La chiave è utilizzare cellule portatrici del plasmide pAD-LyseR, che esprime citosolicamente l'endolisina del fago lambda. Queste cellule vengono potenziate per lisarsi dopo la permeabilizzazione della membrana interna, consentendo all'endolisina l'accesso alla parete cellulare, che il metodo ottiene attraverso un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Poiché le cellule si lisano efficacemente, il prodotto vi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT media	EMD Millipore	4.85008	or equivalent
3-PGA	Sigma Aldrich	P8877	or equivalent
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff	Millipore Sigma	UFC900308	optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated
ampicillin	Sigma Aldrich	A0166-5G	or carbenicillin, a more stable variant
ATP	Sigma Aldrich	A8937	or equivalent
cAMP	Sigma Aldrich	A9501	or equivalent
CoA	Sigma Aldrich	C4282	or equivalent
CTP	United States Biosciences	14121	or equivalent
D-glucose (dextrose)	Fisher Scientific	AAA1749603	or equivalent
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	D0632-1G	or equivalent
E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR	Addgene	99244
E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR	Addgene	99245
Folinic acid	Sigma Aldrich	F7878	or equivalent
GTP	United States Biosciences	16800	or equivalent
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-25G	or equivalent
LB media	Fisher Scientific	DF0446075	or equivalent
magnesium glutamate	Sigma Aldrich	49605-250G	or equivalent
NAD	Sigma Aldrich	N6522	or equivalent
potassium glutamate	Sigma Aldrich	G1501-100G	or equivalent
potassium hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	221473-25G	for adjusting pH
potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific	BP363-500	or equivalent
potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-500	or equivalent
Spermidine	Sigma Aldrich	85558	or equivalent
Tris-HCl	Fisher Scientific	9310500GM	or equivalent
tRNA mix	Roche	10109541001	or equivalent
UTP	United States Biosciences	23160	or equivalent