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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il colostro bovino è sia una fonte primaria di nutrienti che un supporto immunologico per il vitello appena nato. La comprensione del livello di proteine terapeutiche (lattoferrina e IgG) è importante per il dosaggio e la standardizzazione del colostro bovino per il consumo umano.

Abstract

Il colostro è un fluido biologico complesso prodotto dai mammiferi subito dopo il parto. Soddisfa tutte le esigenze nutrizionali dei neonati come buona fonte di macro e micronutrienti, peptidi bioattivi e fattori di crescita. Il colostro bovino è anche una potenziale fonte di nutrimento e bioattivo grazie al suo ricco contenuto proteico che include immunoglobuline G (IgG) e lattoferrina. Tuttavia, il livello di lattoferrina e IgG nel colostro bovino cambia notevolmente durante il periodo di lattazione. Pertanto, il monitoraggio della concentrazione di IgG e lattoferrina per l'uso del colostro bovino come fonte proteica è una questione importante da studiare. I metodi in questo articolo descrivono come determinare il contenuto proteico, nonché le concentrazioni specifiche di lattoferrina e IgG. Questi metodi includono le seguenti fasi: Isolamento delle proteine del colostro bovino, Determinazione della concentrazione proteica tramite il saggio dell'acido bicinconnico (BCA), Visualizzazione delle proteine tramite SDS-PAGE, Determinazione della lattoferrina e della concentrazione di IgG utilizzando un test ELISA.

Introduzione

Il colostro è la secrezione iniziale della ghiandola mammaria prodotta dai mammiferi poco dopo il parto. Il colostro è ricco di macro e micronutrienti, peptidi antimicrobici e fattori di crescita 1,2,3,4. La composizione varia gradualmente nel tempo durante il passaggio al latte maturo 5,6,7, ma in modo più significativo entro 24 ore dal parto8. La composizione del colostro è influenzata anche da fattori materni, tra cui età, parità, razza, salute e stato nutrizionale, nonché da fattori estrinseci, tra cui stagione, parto prematuro, lattazione prematura, fattori di manipolazione colostrale (raggruppamento del colostro e temperatura di conservazione) e induzione del parto 9,10,11. Rispetto al latte maturo, il colostro contiene meno lattosio e più grassi, proteine, peptidi, azoto non proteico, ceneri, ormoni, fattori di crescita, citochine, nucleotidi, vitamine e minerali12. Il colostro bovino contiene un'ampia gamma di proteine, tra cui immunoglobuline, lattoferrina, α-lattoalbumina (α-LA), β-lattoglobulina (β-Lg), lattoperossidasi e diversi fattori di crescita13. La concentrazione proteica totale del colostro bovino varia tra 11,26 mg/mL e 169,55 mg/mL14. Il contenuto proteico comprende siero di latte e caseina ad una concentrazione media di 124,00 mg/mL e 26,00 mg/mL, rispettivamente15. La porzione di siero di latte contiene tre tipi principali di immunoglobuline (Igs) come IgG (85%-90%), IgM (7%) e IgA (5%)16. Le principali Ig nel colostro bovino sono le IgG, che forniscono l'immunità passiva e modulano il sistema immunitario adattativo e innato nel vitello17. La concentrazione iniziale di Ig del colostro bovino da prima mungitura può variare da 20 a 200 mg/mL e diminuire a circa 0,4-1,0 mg/mL18. La concentrazione media di IgG è di circa 60 mg/mL e diminuisce costantemente fino a livelli inferiori a 1 mg/mL durante la transizione al latte maturo19.

Un'altra importante proteina bioattiva nel colostro è la lattoferrina, una glicoproteina legante il ferro con una concentrazione di 1,5-5 mg/mL. Le proprietà della lattoferrina includono il miglioramento dell'assorbimento del ferro e il possesso di attività antimicrobica20,21, legante il lipopolisaccaride, immunomodulazione e stimolante la crescita delle cellule epiteliali intestinali e dei fibroblasti22. Il colostro bovino contiene anche α-lattoalbumina e β-lattoglobulina. Queste proteine sono fonti di aminoacidi essenziali e hanno anche attività battericida 23,24,25. Le concentrazioni medie di α-LA e β-Lg nel colostro sono in media rispettivamente di 2,77 mg/mL2 e 11,5 mg/mL26. Successivamente, queste concentrazioni diminuiscono a 1-1,5 mg/mL27 e a 4,8 mg/mL26 nel latte maturo. Il colostro contiene anche una quantità significativa di lattoperossidasi (media 22,8 μg/mL) e lisozima (media 0,40 μg/mL)26. La lattoperossidasi è una glicoproteina che possiede attività antimicrobica contro i batteri Gram-positivi e negativi28 producendo specie reattive dell'ossigeno. Il lisozima funziona come agente antimicrobico scindendo il componente peptidoglicano delle pareti cellulari batteriche, portando così alla morte cellulare 29,30.

Grazie alle loro proprietà, le IgG e la lattoferrina vengono trasformate in diversi prodotti alimentari per fortificare le formule per lattanti, gli integratori alimentari, i preparati ad alto contenuto proteico per convalescenti e sportivi, nonché in farmacologia e cosmetologia 31,32,33. Il colostro bovino rappresenta un'importante fonte di IgG e lattoferrina. Tuttavia, la composizione di queste proteine bioattive nel colostro bovino cambia notevolmente durante il periodo di lattazione. Pertanto, è fondamentale monitorare i cambiamenti nella concentrazione di queste proteine bioattive nei campioni di colostro utilizzati per la ricerca e la lavorazione degli alimenti. Questo studio ha lo scopo di descrivere i metodi per monitorare la concentrazione e la composizione della proteina totale, della lattoferrina e delle IgG nel colostro bovino durante i 6 giorni successivi al parto.

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Protocollo

I campioni di colostro sono stati raccolti per 6 giorni dopo il parto a mezzogiorno nel periodo luglio-agosto, da 28 vacche da latte Holstein della Uluova Milk Trading Company di Çanakkale, in Turchia, e surgelati. I campioni raccolti lo stesso giorno sono stati raggruppati in base al giorno di ciascun campione e analizzati per le loro concentrazioni totali di proteine, lattoferrina e IgG. Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato.

1. Preparazione del campione

  1. Miscelare 200 μL di colostro bovino con 400 μL di dH2O per ottenere un campione diluito per l'analisi. Diluire tutti i campioni di conseguenza.
  2. Centrifugare campioni diluiti e non diluiti a 4 °C, 1000 x g per 30 min.
  3. Separare la fase centrale in un nuovo tubo etichettato in modo appropriato. Ripetere il passaggio 1.2. per ottenere una fase intermedia chiara. Conservare l'intera fase intermedia e i campioni diluiti a -20 °C, se non utilizzati immediatamente.
  4. Utilizzare la fase intermedia ottenuta da campioni diluiti per i saggi BCA, SDS-PAGE e lattoferrina. Raccogliere la fase intermedia da campioni non diluiti per il dosaggio delle IgG.
  5. Preparare le diluizioni del campione per ogni campione per assicurarsi che le letture rientrino nell'intervallo della curva standard. Diluire ciascuna fase intermedia ottenuta dai campioni diluiti a 1:300 per il test BCA e 1:30.000 per il test della lattoferrina e diluire ciascuna fase intermedia ottenuta da campioni non diluiti a 1:400.000 per il test IgG.
    NOTA: I fattori di diluizione sono determinati in base al valore di assorbanza e alla curva standard.

2. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA

  1. Preparazione di standard e reagenti
    1. Utilizzare i reagenti forniti nel kit disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) da utilizzare per il saggio: reagente BCA A, contenente carbonato di sodio, bicarbonato di sodio, acido bicinconnico e tartrato di sodio in idrossido di sodio 0,1 M. Il reagente BCA B contiene il 4% di solfato rameico. Albumina (BSA) standard, contiene albumina sierica bovina a 2,0 mg/mL in soluzione fisiologica allo 0,9% e azoturo di sodio allo 0,05%.
    2. Equilibrare tutti i campioni e gli standard proteici a temperatura ambiente (RT).
    3. Preparare volumi sufficienti di reagente di lavoro (WR) miscelando il rapporto 50:1 del reagente A:B. Sono necessari 200 μl di WR per ogni campione e standard.
    4. Preparare gli standard di albumina diluita (BSA) secondo il seguente schema di diluizione (Tabella 1), che presenta un intervallo di lavoro compreso tra 20 e 2.000 μg/mL di concentrazione finale di BSA. Utilizzare dH2O come diluente.

Tabella 1: Schema di diluizione degli standard BSA.

FialaVolume di diluente (μL)Volume e fonte di BSA (μL)Concentrazione finale BSA (μg/mL)
Un0300 μl di brodo2000
B125375 μL di brodo1500
C325325 μL di brodo1000
D175175 di flaconcino B diluito750
E325325 di flaconcino di diluizione C500
F325325 di flaconcino di diluizione E250
G325325 di flaconcino di diluizione F125
H400100 di flaconcino di diluizione G25
Io40000 = Vuoto
  1. Procedura di dosaggio del BCA
    1. Trasferire 25 μl di ogni standard o campione BCA in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 200 μl di WR a ciascun pozzetto contenente standard o campione. Mescolare accuratamente la piastra su uno shaker per 30 s.
    2. Coprire la piastra con un sigillante per piastre e incubare a 37 °C per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lasciare che le reazioni si equilibrino in RT per circa 10 minuti. Leggere ogni piastra a 562 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il relativo software associato.
  2. Generazione della curva standard e determinazione dei risultati
    1. Registrare i valori di assorbanza per gli standard e i campioni. Si prega di consultare la Tabella 1 per la serie di diluizione. Sottrarre i valori di assorbanza del bianco standard da ciascun valore di assorbanza degli standard e del campione. Fare la media delle letture duplicate per ogni standard e campione per stimare la concentrazione proteica totale.
    2. Costruisci una curva standard tracciando l'assorbanza media corretta per ogni standard sull'asse x e la concentrazione sull'asse y. Disegna una curva lineare con il software appropriato in grado di eseguire l'adattamento della curva a quattro parametri.
    3. Utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di ciascun campione interpolando la sua risposta alla concentrazione. Moltiplicare per il fattore di diluizione (passaggio 1.5) per ottenere la concentrazione effettiva del campione.

3. Visualizzazione delle proteine mediante saggio SDS-PAGE

  1. Preparazione del campione e delle soluzioni
    1. Preparare le soluzioni stock
      1. Preparare una soluzione di SDS al 10% (p/v), Tris-HCl 1,5 M pH 8,3, Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, soluzione di persolfato di ammonio (APS) al 10% (p/v) (preparare fresco).
      2. (w/v) SDS: Pesare 1 g di SDS e aggiungere 10 mL di dH2O.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Pesare 18,15 g di Tris e sciogliere con ~60 mL di dH2O. Regolare a pH 8,8 con HCl. Aggiungere dH2O per portare il volume a 100 mL.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Pesare 6,00 g di Tris e sciogliere con ~60 mL di dH2O. Regolare a pH 6,8 con HCl. Aggiungere dH2O per portare il volume a 100 mL.
      5. APS: Pesare 15 mg di APS e aggiungere 150 μL di dH2O.
        ATTENZIONE: L'acrilammide e la SDS sono tossiche e dannose. Indossare guanti protettivi e lavorare sotto il cappuccio.
    2. Preparare il tampone del campione aggiungendo 50 μl di β-mercaptoetanolo a 950 μl di tampone del campione 2x SDS-PAGE.
      ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è tossico se inalato. Indossare guanti protettivi e lavorare sotto il cappuccio.
    3. Preparare il tampone di corsa mescolando 100 mL di 10x Tris-glycine SDS Running Buffer con 900 mL di dH2O.
    4. Preparare la soluzione colorante (45% dH2O, 45% metanolo, 10% acido acetico glaciale, 2 g di Coomassie Brilliant Blue R).
    5. Preparare la soluzione decolorante (50% dH2O, 40% metanolo, 10% acido acetico glaciale).
  2. Preparazione del gel
    1. Preparare l'attrezzatura dell'unità di elettroforesi, compresa la cassetta del gel, gli alimentatori, gli elettrodi e i cavi per il test. Pulire le lastre di vetro con etanolo e assemblare il panino. Assicurarsi che i bordi inferiori delle lastre di vetro e dei distanziatori siano ben allineati.
    2. Preparare la miscela di gel separatore contenente 3,5 mL di dH2O, 2,4 mL di acrilammide/metilene bis acrilammide, 2 mL di 1,5M Tris-HCl, 100 μL di SDS al 10% (p/v), 80 μL di APS al 10%, 8 μL di N,N,N',N'-Tetrametil etilendiammina (TEMED).
      ATTENZIONE: TEMED è tossico e/o irritante. Indossare guanti protettivi e lavorare sotto il cappuccio.
    3. Versare la miscela di gel separatore nelle piastre di gel a un livello di circa 1-1,5 cm sotto la parte superiore della piastra più corta.
    4. Stratificare la parte superiore del gel separatore con isopropanolo per rimuovere le bolle nella parte superiore del gel ed evitare che il gel polimerizzato si secchi.
    5. Versare l'isopropanolo sopra il gel separatore dopo che il gel separatore si è polimerizzato per almeno 15 minuti.
    6. Preparare la miscela di gel da impilare contenente 1,92 mL di dH2O, 300 μL di acrilammide al 40%, metilene bis acrilammide, 750 μL di Tris-HCl 0,5M, 100 μL di SDS al 10% (p/v), 30 μL di APS al 10% e 3 μL di TEMED.
    7. Versare la soluzione di gel di impilamento sopra il gel di separazione in modo che le piastre di gel siano riempite. Inserire il pettine nella parte superiore dei distanziatori.
    8. Lasciare polimerizzare il gel da impilare a temperatura ambiente per circa 15 minuti.
  3. Esecuzione del gel
    1. Collegare il gel al gruppo elettrodo. Aggiungere 1x Tris-glycine SDS Running Buffer appena preparato in entrambe le camere dell'apparato.
    2. Rimuovere il pettine.
    3. Caricare 5 μL della scala (10-250 kDa) e 8 μL della fase intermedia dei campioni diluiti nei pozzetti del gel. Far scorrere il gel a 80 V fino a quando il colorante non migra nel gel separatore e aumentare a 120 V fino a quando il colorante raggiunge il fondo del gel. Spegnere la potenza applicata dopo che il colorante ha raggiunto il fondo del gel.
  4. Colorazione e decolorazione del gel
    1. Rimuovere il gel dall'apparecchio una volta completata la corsa e rimuovere i distanziatori e le piastre di vetro. Metti il gel in un piccolo vassoio.
    2. Colorare il gel aggiungendo una soluzione colorante (passaggio 3.1.4) per 30 minuti agitando delicatamente a 55 giri/min.
    3. Versare la soluzione colorante dal gel. Sciacquare il gel con una piccola quantità di soluzione decolorante e scartare il colorante.
    4. Aggiungere un volume sufficiente di soluzione decolorante per coprire il gel e stendere agitando delicatamente per ~1 ora fino a quando le bande sono visibili.

4. Concentrazione di lattoferrina utilizzando un ELISA di lattoferrina bovina

  1. Preparazione di standard e reagenti
    1. Per questo test utilizzare il kit ELISA Bovine LF/LTF/Lattoferrina, disponibile in commercio.
    2. Equilibra tutti i campioni e gli standard in base alla RT.
    3. Preparare volumi sufficienti di reagente di rilevazione A e B Soluzione di lavoro responsabili del legame con l'antigene catturato.
    4. Diluire i reagenti di rivelazione A e B in un rapporto di 1:100 utilizzando rispettivamente i diluenti per saggi A e B.
    5. Preparare un tampone di lavaggio 1x funzionante diluendo il concentrato di tampone di lavaggio 30x con dH2O.
    6. Mettere una quantità sufficiente di soluzione di substrato di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) in una microprovetta sterile.
    7. Risospendere una provetta di standard liofilizzato (100 ng/mL) con 0,5 mL di diluente campione e incubare a RT per 10 minuti agitando delicatamente. Girare la fiala per assicurarsi che tutto il sanple liofilizzato sia raccolto sul fondo.
    8. Preparare una serie di diluizioni standard secondo il seguente schema di diluizione (Tabella 2).

Tabella 2: Schema di diluizione degli standard di lattoferrina bovina.

FialaVolume di diluente (μL)Volume e fonte di Lf (μL)Concentrazione finale di Lf (ng/mL)
D10500 μL di brodo100
D2250250 di flaconcino di diluizione D150
D3250250 di flaconcino di diluizione D225
D4250250 di flaconcino di diluizione D312.5
D5250250 di flaconcino di diluizione D46.25
D6250250 di flaconcino di diluizione D53,125
D7250250 di flaconcino di diluizione D61,563
D825000 = Vuoto
  1. Misurazione della concentrazione di lattoferrina bovina
    1. Pipettare 100 μl di ogni standard o campione di lattoferrina nella piastra a 96 pozzetti rivestita. Coprire la piastra con un sigillante per piastre per evitare l'evaporazione. Incubare a 37 °C per 1 ora.
    2. Aspirare il liquido di ogni pozzetto. Aggiungere 100 μl del reagente di rilevazione A soluzione di lavoro a ciascun pozzetto. Coprire con un sigillante per piastre e agitare delicatamente per garantire una miscelazione accurata. Incubare a 37 °C per 1 ora.
    3. Lavare tre volte aggiungendo circa 350 μl di tampone di lavaggio 1x dopo aver aspirato il liquido da ciascun pozzetto. Lasciare riposare ogni lavaggio per 1-2 minuti prima di aspirare completamente. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio, quindi capovolgere la piastra e picchiettare su una carta assorbente pulita.
    4. Aggiungere 100 μl della soluzione di lavoro del reagente di rivelazione B a ciascun pozzetto. Coprire con un nuovo sigillante per piastre. Incubare a 37 °C per 30 min. Aspirare il liquido da ogni pozzetto e lavarlo cinque volte come descritto al punto 4.2.3. Mettere 90 μl di soluzione di substrato TMB in ciascun pozzetto e coprire con un nuovo sigillante per piastre.
    5. Incubare a 37 °C per 10-20 min al riparo dalla luce. Controllare il colore ottimale monitorando periodicamente. Si noti che il colore blu intenso nel pozzetto include un'alta concentrazione di lattoferrina.
    6. Aggiungere 50 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto. Il colore cambierà da blu a giallo. Misurare immediatamente l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il relativo software associato.
      NOTA: Picchiettare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione accurata fino a quando il cambiamento di colore non è uniforme.
  2. Generazione della curva standard e determinazione dei risultati
    1. Seguire il passaggio 2.3.1 per la generazione dei dati per stimare la concentrazione di lattoferrina.
    2. Costruire una curva standard tracciando l'assorbanza media corretta per ogni standard come descritto nel passaggio 2.3.2 ma disegnando una curva polinomiale con un software appropriato in grado di eseguire l'adattamento della curva a quattro parametri.
    3. Calcolare il contenuto di lattoferrina di ciascun campione interpolando il valore di assorbimento nell'equazione generata come descritto al punto 2.3.3.

5. Determinazione della concentrazione di IgG di campioni mediante ELISA di IgG bovine

  1. Preparazione di standard e reagenti
    1. Utilizzare gli elementi richiesti tra quelli forniti nel kit ELISA IgG bovino.
    2. Equilibra tutti i campioni e gli standard in base alla RT.
    3. Preparare volumi sufficienti di soluzione di lavoro di coniugato enzima-anticorpo diluendo 10 μl di concentrato di perossidasi di rafano (HRP)-avidina (100x) con 990 μl di diluente coniugato enzima-anticorpo.
    4. Preparare volumi sufficienti di 1x tampone di lavaggio diluendo 20x concentrato di tampone di lavaggio con dH2O.
    5. Preparare volumi sufficienti della soluzione diluente 1x diluendo il concentrato diluente 20x con dH2O.
    6. Aggiungere 1,0 mL di dH2O al calibratore di IgG bovine e mescolare delicatamente fino a quando non si sarà sciolto. La concentrazione finale del calibratore è di 123.000 ng/mL.
    7. Preparare una serie di diluizioni standard secondo lo schema di diluizione descritto nella tabella 3.

Tabella 3: Schema di diluizione degli standard di IgG bovini.

FialaVolume di diluente (μL)Volume e fonte di IgG (μL)Concentrazione finale di IgG (ng/mL)
D1900100 μL di brodo12300
D2900100 di flaconcino di diluizione D11230
D3178122 di flaconcino di diluizione D2500
D415050 di flaconcino di diluizione D3250
D5150150 di flaconcino di diluizione D4125
D6100100 di flaconcino di diluizione D562.5
D7100100 di flaconcino di diluizione D631.25
D8100100 di flaconcino di diluizione D715,625
D9100100 di flaconcino di diluizione D87,813
D1010000 = Vuoto
  1. Procedura di test ELISA delle IgG bovine
    1. Pipettare 100 μl di ogni standard o campione di IgG nella piastra a 96 pozzetti rivestita. Coprire la piastra con un sigillante per piastre e incubare a RT per 30 minuti. Aspirare il liquido da ogni pozzetto.
    2. Lavare quattro volte riempiendo i pozzetti con 1x tampone di lavaggio e aspirare. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio, quindi capovolgere la piastra e picchiettare contro la carta assorbente pulita. Aggiungere 100 μl di coniugato enzima-anticorpo opportunamente diluito a ciascun pozzetto. Coprire con un sigillante per piastre e agitare delicatamente per garantire una miscelazione accurata.
    3. Incubare a RT per 10 min. Lavare e rimuovere il tampone di lavaggio residuo dai pozzetti come descritto al punto 5.2.2. Aggiungere 100 μl di substrato TMB a ciascun pozzetto; Coprire con un nuovo sigillante per piastre.
    4. Incubare a RT per esattamente 10 minuti lontano dalla luce. Arrestare la reazione aggiungendo 100 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto. Leggere ogni piastra a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il relativo software associato.
  2. Generazione della curva standard e determinazione dei risultati
    1. Seguire il passaggio 2.3.1 per l'edizione dei dati per stimare la concentrazione di IgG.
    2. Costruisci una curva standard tracciando la concentrazione sull'asse x e l'assorbanza media corretta per ogni standard sull'asse y. Disegna una curva polinomiale con un software appropriato in grado di eseguire l'adattamento della curva a quattro parametri.
    3. Calcolare il contenuto di IgG di ciascun campione interpolando il valore di assorbimento sull'equazione generata come descritto al punto 2.3.3.

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Risultati

Seguendo il protocollo, i campioni di colostro bovino sono stati analizzati per determinare la concentrazione di proteine, lattoferrina e IgG. I risultati delle analisi delle proteine, della lattoferrina e delle IgG del colostro bovino sono mostrati nella Tabella 4.

Tabella 4: Concentrazione di proteine, lattoferrina e IgG del colostro bovino.

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Discussione

Questo studio fornisce informazioni su notevoli cambiamenti nelle concentrazioni di proteine, lattoferrina e IgG nel colostro durante la transizione al latte maturo. Il rilevamento dei cambiamenti nella concentrazione di lattoferrina e IgG è stato effettuato mediante ELISA a sandwich e la concentrazione totale di proteine è stata analizzata mediante il test BCA. I risultati indicano che il colostro precoce ha la più alta concentrazione di proteine, lattoferrina e IgG, che successivame...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è supportato da Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD e BMH sono dipendenti di Evolve BioSystems, un'azienda focalizzata sul ripristino del microbioma infantile.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10X Running Buffer (Tris-Glycine-SDS)ClearBandTGS10SDS-Page analysis
2-mercaptoethanolgibco31350-010SDS-Page analysis
Acetic Acid GLACIALIsolab901,013,2500SDS-Page analysis
Bovine IgG ELISA KitAviva Systems BiologyOKIA00005Determination of IgG concentration
Bovine LF / LTF / Lactoferrin ELISA KitLSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884Determinaton of lactoferrin concentration
Coomassie Brillant Blue R 250amresco0472-25GSDS-Page analysis
Hydrochloric Acid Fuming 37%Isolab932,103,2501SDS-Page analysis
IsopropanolIsolab961,023,2500SDS-Page analysis
Laemmli Sample Buffer (2X)ClearBandLSB-2xSDS-Page analysis
MethanolIsolab947,046,2500SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 to 250Thermo Scientific26619SDS-Page analysis
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Determination of protein concentration
Sodium dodecyl sulfate (SDS)BioShopSDS001.500SDS-Page analysis
SureCast Acrylamide Solution 40% (w/v)InvitrogenHC2040SDS-Page analysis
SureCast Ammonium persulfate (APS)Thermo Scientific17874SDS-Page analysis
SureCast Tetramethylethylenediamine (TEMED)InvitrogenHC2006SDS-Page analysis
TECAN Infinite M200 Plate ReaderTecan30035094Measurement of absorbance
Tris baseBioShopTRS001.1SDS-Page analysis

Riferimenti

  1. Kehoe, S. I., Jayarao, B. M., Heinrichs, A. J. A survey of bovine colostrum composition and colostrum management practices on Pennsylvania dairy farms. Journal of Dairy Science. 90 (9), 4108-4116 (2007).
  2. Levieux, D., Ollier, A. Bovine immunoglobulin G, β-lactoglobulin, α-lactalbumin and serum albumin in colostrum and milk during the early post partum period. Journal of Dairy Research. 66 (3), 421-430 (1999).
  3. Elfstrand, L., Lindmark-Månsson, H., Paulsson, M., Nyberg, L., Åkesson, B. Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal. 12 (11), 879-887 (2002).
  4. Strekozov, N. I., Motova, E. N., Fedorov, Y. N. Evaluation of the chemical composition and immunological properties of colostrum of cows' first milk yield. Russian Agricultural Sciences. 34 (4), 259-260 (2008).
  5. Playford, R. J., Weiser, M. J. Bovine colostrum: Its constituents and uses. Nutrients. 13 (1), 265(2021).
  6. Godhia, M., Patel, N. Colostrum - Its composition, benefits as a nutraceutical: A review. Current Research in Nutrition and Food Science Journal. 1 (1), 37-47 (2013).
  7. Nakamura, T., et al. Concentrations of sialyloligosaccharides in bovine colostrum and milk during the prepartum and early lactation. Journal of Dairy Science. 86 (4), 1315-1320 (2003).
  8. Arain, H. H., Khaskheli, M., Arain, M. A., Soomro, A. H., Nizamani, A. H. Heat stability and quality characteristics of postpartum buffalo milk. Pakistan Journal of Nutrition. 7 (2), 303-307 (2008).
  9. Maunsell, F. P., et al. Effects of mastitis on the volume and composition of colostrum produced by Holstein cows. Journal of Dairy Science. 81 (5), 1291-1299 (1998).
  10. Tittle, D. J. Factors affecting colostrum quality. Cattle Practice. 10 (2), 131-136 (2002).
  11. Zarcula, S., et al. Influence of breed, parity and food intake on chemical composition of first colostrum in cow. Animal Science and Biotechnology. 43 (1), 43(2010).
  12. McGrath, B. A., Fox, P. F., McSweeney, P. L. H., Kelly, A. L. Composition and properties of bovine colostrum: a review. Dairy Science and Technology. 96 (2), 133-158 (2016).
  13. Bastian, S. E. P., Dunbar, A. J., Priebe, I. K., Owens, P. C., Goddard, C. Measurement of betacellulin levels in bovine serum, colostrum and milk. Journal of Endocrinology. 168 (1), 203-212 (2001).
  14. Zhang, L., et al. Bovine milk proteome in the first 9 days: Protein interactions in maturation of the immune and digestive system of the newborn. PloS One. 10 (2), 0116710(2015).
  15. Godden, S. Colostrum management for dairy calves. The Veterinary clinics of North America. Food Animal Practice. 24 (1), 19-39 (2008).
  16. Larson, B. L., Heary, H. L., Devery, J. E. Immunoglobulin production and transport by the mammary gland. Journal of Dairy Science. 63 (4), 665-671 (1980).
  17. Ulfman, L. H., Leusen, J. H. W., Savelkoul, H. F. J., Warner, J. O., van Neerven, R. J. J. Effects of bovine immunoglobulins on immune function, allergy, and infection. Frontiers in Nutrition. 5, 52(2018).
  18. El-Loly, M. M. Bovine milk immunoglobulins in relation to human health. International Journal of Dairy Science. 2 (3), 183-195 (2007).
  19. Korhonen, H., Marnila, P., Gill, H. S. Milk immunoglobulins and complement factors. British Journal of Nutrition. 84 (1), 75-80 (2000).
  20. Arnold, R. R., Brewer, M., Gauthier, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: Sensitivity of a variety of microorganisms. Infection and Immunity. 28 (3), 893-898 (1980).
  21. Aisen, P., Listowsky, I. Iron transport and storage proteins. Annual Review of Biochemistry. 49 (1), 357-393 (1980).
  22. Zhao, X., et al. The in vitro protective role of bovine lactoferrin on intestinal epithelial barrier. Molecules. 24 (1), 148(2019).
  23. Chatterton, D. E. W., Smithers, G., Roupas, P., Brodkorb, A. Bioactivity of β-lactoglobulin and α-lactalbumin-Technological implications for processing. International Dairy Journal. 16 (11), 1229-1240 (2006).
  24. Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., Hunziker, P. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1526 (2), 131-140 (2001).
  25. Brück, W. M., et al. rRNA probes used to quantify the effects of glycomacropeptide and α-lactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 37 (3), 273-280 (2003).
  26. Indyk, H. E., Hart, S., Meerkerk, T., Gill, B. D., Woollard, D. C. The β-lactoglobulin content of bovine milk: Development and application of a biosensor immunoassay. International Dairy Journal. 73, 68-73 (2017).
  27. Swaisgood, H. E. Protein and amino acid composition of bovine milk. Handbook of Milk Composition. , 464-468 (1995).
  28. Seifu, E., Buys, E. M., Donkin, E. F. Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: A review. Trends in Food Science and Technology. 16 (4), 137-154 (2005).
  29. Wheeler, T. T., Hodgkinson, A. J., Prosser, C. G., Davis, S. R. Immune components of colostrum and milk-A historical perspective. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 12 (4), 237-247 (2007).
  30. Clare, D., Catignani, G., Swaisgood, H. Biodefense properties of milk: The role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9 (16), 1239-1255 (2003).
  31. Mehra, R., Marnila, P., Korhonen, H. Milk immunoglobulins for health promotion. International Dairy Journal. 16 (11), 1262-1271 (2006).
  32. Gapper, L. W., Copestake, D. E. J., Otter, D. E., Indyk, H. E. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (1), 93-109 (2007).
  33. Mettler, A. E. Utilization of whey by-products for infant feeding. International Journal of Dairy Technology. 33 (2), 67-72 (1980).
  34. Zenker, H. E., Raupbach, J., Boeren, S., Wichers, H. J., Hettinga, K. A. The effect of low vs. high temperature dry heating on solubility and digestibility of cow's milk protein. Food Hydrocolloids. 109, 106098(2020).
  35. Costa, F. F., et al. Microfluidic chip electrophoresis investigation of major milk proteins: Study of buffer effects and quantitative approaching. Analytical Methods. 6 (6), 1666-1673 (2014).
  36. Lönnerdal, B., Du, X., Jiang, R. Biological activities of commercial bovine lactoferrin sources. Biochemistry and Cell Biology. 99 (1), 35-46 (2021).
  37. Belanger, L., Sylvestre, C., Dufour, D. Enzyme-linked immunoassay for alpha-fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta. 48 (1), 15-18 (1973).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Engvall, E. The ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical Chemistry. 56 (2), 319-320 (2010).
  40. Kohl, T. O., Ascoli, C. A. Immunometric double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (6), (2017).
  41. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77 (7), 98-101 (2016).
  42. Abd El-Fattah, A. M., Abd Rabo, F. H. R., EL-Dieb, S. M., El-Kashef, H. A. Changes in composition of colostrum of Egyptian buffaloes and Holstein cows. BMC Veterinary Research. 8 (1), 19(2012).
  43. Newby, T. J., Stokes, C. R., Bourne, F. J. Immunological activities of milk. Veterinary Immunology and Immunopathology. 3 (1-2), 67-94 (1982).
  44. Chigerwe, M., et al. Comparison of four methods to assess colostral IgG concentration in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association. 233 (5), 761-766 (2008).
  45. Foley, J. A., Otterby, D. E. Availability, storage, treatment, composition, and feeding value of surplus colostrum: A review. Journal of Dairy Science. 61 (8), 1033-1060 (1978).
  46. Mechor, G. D., Gröhn, Y. T., McDowell, L. R., Van Saun, R. J. Specific gravity of bovine colostrum immunoglobulins as affected by temperature and colostrum components. Journal of Dairy Science. 75 (11), 3131-3135 (1992).
  47. Pritchett, L. C., Gay, C. C., Besser, T. E., Hancock, D. D. Management and production factors influencing immunoglobulin G1 concentration in colostrum from Holstein cows. Journal of Dairy Science. 74 (7), 2336-2341 (1991).
  48. Quigley, J. D., Martin, K. R., Dowlen, H. H. Concentrations of trypsin inhibitor and immunoglobulins in colostrum of Jersey cows. Journal of Dairy Science. 78 (7), 1573-1577 (1995).
  49. Bielmann, V., et al. An evaluation of Brix refractometry instruments for measurement of colostrum quality in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 93 (8), 3713-3721 (2010).
  50. A Ayar, A., Sıçramaz, H., Çetin, I. The effect of bovine colostrum on the lactic flora of yogurt and kefir. JSM Biotechnology and Biomedical Engineering. 3, 3-8 (2016).
  51. Sobaih, A., Zaki, D. A. Production of novel functional yoghurt fortified with bovine colostrum and date syrup for children. Alexandria Science Exchange Journal. 39, 651-662 (2018).
  52. Saalfeld, M. H., et al. Colostro: a redescoberta de um alimento saudável, nutritivo e com potencial probiótico. Agroecologia e Desenvolvimento Rural Sustentável. 5 (2), 18-24 (2012).
  53. Mouton, E., Aryana, K. J. Influence of colostrum on the characteristics of ice cream. Food and Nutrition Sciences. 06 (05), 480-484 (2015).
  54. Nazir, T., Pal, M. A., Manzoor, A. Effect of admixing varying levels of whole milk to the colostrum on the sensory quality of fermented colostrum product. International Journal of Advanced Research in Science, Engineering and Technology. 7 (4), 156-161 (2018).
  55. Korhonen, H. J. Bioactive milk proteins, peptides and lipids and other functional components derived from milk and bovine colostrum. Functional Foods. , 471-511 (2011).
  56. Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Analytical Biochemistry. 608, 113904(2020).
  57. Johnson, M. Protein quantitation. Materials and Methods. 2, 115(2012).
  58. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  59. Wang, R., et al. Sensitive immunoassays based on specific monoclonal IgG for determination of bovine lactoferrin in cow milk samples. Food Chemistry. 338, 127820(2021).
  60. Kazemi, M. G., Feizy, J. Overview of the important of ELISA technique and application in food industry. Analyzing Microbes. 4 (4), 19-25 (2020).
  61. Verma, J., Saxena, S., Babu, S. G. ELISA-based identification and detection of microbes. Analyzing Microbes. , 169-186 (2013).
  62. Minic, R., Zivkovic, I. Optimization, validation and standardization of ELISA. Norovirus. , (2020).
  63. Drijvers, J. M., Awan, I. M., Perugino, C. A., Rosenberg, I. M., Pillai, S. The enzyme-linked immunosorbent assay. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 119-133 (2017).
  64. Walker, A. Breast milk as the gold standard for protective nutrients. The Journal of Pediatrics. 156 (2), 3-7 (2010).
  65. Patel, K., Rana, R. Pedimune in recurrent respiratory infection and diarrhoea-The Indian experience-The PRIDE study. The Indian Journal of Pediatrics. 73 (7), 585-591 (2006).
  66. Saad, K., et al. Effects of bovine colostrum on recurrent respiratory tract infections and diarrhea in children. Medicine. 95 (37), 4560(2016).
  67. Buckley, J. D., Brinkworth, G. D., Abbott, M. J. Effect of bovine colostrum on anaerobic exercise performance and plasma insulin-like growth factor I. Journal of Sports Sciences. 21 (7), 577-588 (2003).
  68. Kotsis, Y., et al. A low-dose, 6-week bovine colostrum supplementation maintains performance and attenuates inflammatory indices following a Loughborough Intermittent Shuttle Test in soccer players. European Journal of Nutrition. 57 (3), 1181-1195 (2018).

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