ウシ初乳における総タンパク質および生理活性タンパク質濃度の測定(英語)

要約

ウシの初乳は、新生子牛の主要な栄養源であると同時に、免疫学的サポートでもあります。治療用タンパク質(ラクトフェリンおよびIgG)のレベルを理解することは、ウシ初乳の投与とヒトの消費の標準化にとって重要です。

要約

初乳は、哺乳類が分娩直後に作り出す複雑な生体液です。これは、多量栄養素と微量栄養素、生理活性ペプチド、および成長因子の優れた供給源として、新生児のすべての栄養要件を満たしています。ウシ初乳は、免疫グロブリンG(IgG)やラクトフェリンなどの豊富なタンパク質含有量により、栄養と生物活性の潜在的な供給源でもあります。しかし、ウシ初乳中のラクトフェリンとIgGのレベルは、授乳期間中に著しく変化します。したがって、ウシ初乳をタンパク質源として使用するためのIgGとラクトフェリンの濃度をモニタリングすることは、研究すべき重要な問題です。この記事の方法では、タンパク質含有量、およびラクトフェリンとIgGの特定の濃度を測定する方法について説明します。これらの方法には、次のステップが含まれます:ウシ初乳タンパク質の単離、ビシンコニン酸アッセイ(BCA) による タンパク質濃度の決定、SDS-PAGE による タンパク質の可視化、ラクトフェリンの測定、およびELISAアッセイを使用したIgG濃度。

概要

初乳は、哺乳類が分娩直後に産生する乳腺の最初の分泌物です。初乳には、多量栄養素と微量栄養素、抗菌ペプチド、および成長因子が豊富に含まれています1,2,3,4。組成は、成熟乳^への移行を通じて経時的に徐々に変化します^5,6,7が、最も顕著なのは分娩後24時間以内^8です。初乳の組成は、年齢、出産、品種、健康状態、栄養状態などの母性要因、および季節、早産、早産、早産、初乳の取り扱い因子(初乳のプールと貯蔵温度)、分娩の誘発などの外因性要因の影響も受けます^9,10,11.成熟した牛乳と比較して、初乳には乳糖が少なく、脂肪、タンパク質、ペプチド、非タンパク質窒素、灰分、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ヌクレオチド、ビタミン、ミネラルが多く含まれています¹²。ウシ初乳には、免疫グロブリン、ラクトフェリン、α-ラクトアルブミン(α-LA)、β-ラクトグロブリン(β-LG)、ラクトペルオキシダーゼ、およびいくつかの成長因子¹³を含む幅広いタンパク質が含まれています。ウシ初乳の総タンパク質濃度は、11.26 mg / mLから169.55 mg / mLの範囲です¹⁴。タンパク質含有量は、ホエイとカゼインを含み、平均濃度はそれぞれ124.00 mg/mLと26.00 mg/mLです¹⁵。ホエイ部分には、IgG(85%-90%)、IgM(7%)、IgA(5%)の3つの主要なタイプの免疫グロブリン(Igs)が含まれています¹⁶。ウシ初乳の主要なIgはIgGであり、受動免疫を提供し、子牛の適応免疫系と自然免疫系を調節します¹⁷。最初の搾乳ウシ初乳の初期Ig濃度は、20〜200 mg / mLの範囲であり、約0.4〜1.0 mg / mLに減少します¹⁸。平均IgG濃度は約60 mg/mLであり、成熟乳への移行を通じて1 mg/mL未満まで着実に低下します¹⁹。

初乳中の別の重要な生理活性タンパク質は、1.5〜5 mg / mLの濃度の鉄結合糖タンパク質であるラクトフェリンです。ラクトフェリンの特性には、鉄の吸収を高めるだけでなく、抗菌活性^{を有すること20,21}、リポ多糖類の結合、免疫調節、および腸上皮細胞と線維芽細胞²²の成長を刺激することが含まれます。ウシの初乳には、α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンも含まれています。これらのタンパク質は必須アミノ酸の供給源であり、殺菌活性も持っています23,24,25。初乳中のα-LAおよびβ-Lgの平均濃度は、それぞれ平均2.77 mg/mL²および11.5 mg/mL²⁶です。その後、これらの濃度は成熟乳中で1〜1.5 mg / mL²⁷、および4.8 mg / mL²⁶に減少します。初乳には、かなりの量のラクトペルオキシダーゼ(平均22.8μg/mL)とリゾチーム(平均0.40μg/mL)²⁶も含まれている。ラクトペルオキシダーゼは、活性酸素種を産生することにより、グラム陽性菌および陰性菌²⁸に対する抗菌活性を有する糖タンパク質である。リゾチームは、細菌の細胞壁のペプチドグリカン成分を切断することにより抗菌剤として機能し、それによって細胞死を引き起こします^29,30。

その特性により、IgGとラクトフェリンは、乳児用調製粉乳、栄養補助食品、回復期の患者やスポーツマン向けの高タンパク質製剤、薬理学や美容学31,32,33を強化するために、さまざまな食品に加工されます。ウシ初乳は、IgGとラクトフェリンの重要な供給源です。しかし、ウシ初乳におけるこれらの生理活性タンパク質の組成は、授乳期間中に著しく変化します。したがって、研究や食品加工に使用される初乳サンプル中のこれらの生理活性タンパク質の濃度の変化を監視することが重要です。この研究は、分娩後 6 日間のウシ初乳中の総タンパク質、ラクトフェリン、および IgG の濃度と組成を監視する方法を説明することを目的としています。

プロトコル

初乳サンプルは、トルコのチャナッカレにあるUluova Milk Trading Companyのホルスタイン乳牛28頭から、7月から8月にかけての正午に分娩後6日間採取し、急速冷凍しました。同日に採取した検体を各検体の日ごとにプールし、総タンパク質、ラクトフェリン、IgG濃度を分析しました。すべてのサンプルを二重にアッセイしました。

1. サンプル調製

1. 200 μL のウシ初乳と 400 μL の dH₂O を混合して、分析用の希釈サンプルを得ます。それに応じてすべてのサンプルを希釈します。
2. 希釈したサンプルと希釈していないサンプルを4°C、1000 x g で30分間遠心分離します。
3. 中間相を適切なラベル付けされた新しいチューブに分けます。手順1.2を繰り返します。明確な中間相を得るため。すぐに使用しない場合は、中相全体と希釈したサンプルを-20°Cで保存してください。
4. 希釈したサンプルから得られた中間相は、BCA、SDS-PAGE、およびラクトフェリンアッセイに使用します。IgGアッセイのために、希釈されていないサンプルから中間相を採取します。
5. 各サンプルのサンプル希釈液を調製して、測定値が標準曲線範囲内にあることを確認します。希釈したサンプルから得られた各中間相をBCAアッセイの場合は1:300、ラクトフェリンアッセイの場合は1:30,000に希釈し、希釈されていないサンプルから得られた各中間相をIgGアッセイの場合は1:400,000に希釈します。
   注:希釈係数は、吸光度値と標準曲線に基づいて決定されます。

2. BCAタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を決定します

1. 標準物質および試薬の調製
   1. アッセイに使用するには、市販のキット( 材料表を参照)に付属の試薬(0.1 M水酸化ナトリウムに炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ビシンコニン酸、酒石酸ナトリウムを含むBCA試薬A)を使用してください。BCA試薬Bには4%の硫酸第二銅が含まれています。アルブミン(BSA)標準物質は、0.9%生理食塩水および0.05%アジ化ナトリウム中に2.0 mg / mLのウシ血清アルブミンを含んでいます。
   2. すべてのサンプルとタンパク質標準試料を室温(RT)で平衡化します。
   3. 試薬A:Bを50:1の比率で混合することにより、十分な量の作業試薬(WR)を調製します。各サンプルと標準試料には200μLのWRが必要です。
   4. 希釈アルブミン(BSA)標準液を以下の希釈スキーム(表1)に従って調製し、最終BSA濃度が20〜2,000 μg/mLの作業範囲を示します。希釈剤として_dH2Oを使用してください。

表1: BSA標準の希釈スキーム。

薬瓶	希釈液の量(μL)	BSAの量と供給源(μL)	最終BSA濃度(μg/mL)
ある	0	300 μlのストック	2000
B	125	375 μL ストック	1500
C	325	325 μL ストック	1000
D	175	バイアルB希釈子の175	750
E	325	バイアルC希釈の325	500
F	325	バイアルE希釈の325	250
G	325	バイアルF希釈の325	125
H	400	100バイアルG希釈	25
私	400	0	0 = 空白

2. BCAアッセイの手順
   1. 各BCA標準試料またはサンプル25 μLを96ウェルプレートに移します。200 μLのWRをウェル含有する各標準試料またはサンプルに加えます。プレートをプレートシェーカーで30秒間完全に混合します。
   2. プレートをプレートシーラーで覆い、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、反応を室温に対して約10分間平衡化させます。マイクロプレートリーダーとそれに関連するソフトウェアを使用して、各プレートを562 nmで読み取ります。
3. 標準曲線の生成と結果の決定
   1. 標準試料とサンプルの吸光度値を記録します。希釈シリーズについては 表1 を参照してください。標準ブランクの吸光度値を、標準試料とサンプルの各吸光度値から減算します。各標準試料とサンプルの重複測定値を平均化して、総タンパク質濃度を推定します。
   2. 各標準試料の補正平均吸光度を X 軸に、濃度を Y 軸にプロットして、標準曲線を作成します。4パラメータ曲線フィットが可能な適切なソフトウェアを使用して線形曲線を描画します。
   3. 標準曲線を使用して、濃度に対する応答を補間することにより、各サンプルの濃度を決定します。希釈係数(ステップ1.5)を掛けて、サンプルの実際の濃度を求めます。

3. SDS-PAGEアッセイによるタンパク質の可視化

1. サンプルと溶液の調製
   1. ストック溶液の準備
      1. 10%(w/v)SDS、1.5 M Tris-HCl pH 8.3、0.5 M Tris-HCl pH 6.8、10%(w/v)過硫酸アンモニウム(APS)溶液を調製します(新鮮に調製します)。
      2. (w/v)安全データシート:1 gのSDSを秤量し、10 mLのdH₂Oを加えます。
      3. M Tris-HCl pH 8.8:18.15 gのTrisを秤量し、~60 mLのdH₂Oで溶解し、HClでpH 8.8に調整します。dH₂Oを加えて容量を100 mLにします。
      4. M Tris-HCl pH 6.8:6.00 gのTrisを秤量し、~60 mLのdH₂Oで溶解し、HClでpH 6.8に調整し、dH₂Oを加えて容量を100 mLにします。
      5. APS:15 mgのAPSを秤量し、150 μLのdH₂Oを加えます。
         注意:アクリルアミドとSDSは有毒で有害です。保護手袋を着用し、フードの下で作業してください。
   2. 50 μLのβ-メルカプトエタノールを950 μLの2x SDS-PAGEサンプルバッファーに添加して、サンプルバッファーを調製します。
      注意:β-メルカプトエタノールは吸入すると有毒です。.保護手袋を着用し、フードの下で作業してください。
   3. 100 mLの10x Tris-glycine SDS Running Bufferと900 mLのdH₂Oを混合して、Running Bufferを調製します。
   4. 染色液(45%dH₂O、45%メタノール、10%氷酢酸、2 gのCoomassie Brilliant Blue R)を調製します。
   5. 脱染液(50%dH₂O、40%メタノール、10%氷酢酸)を調製します。
2. ゲルの調製
   1. 電気泳動ユニットの機器(ゲルカセット、電源、電極、アッセイ用ケーブルなど)を準備します。ガラスプレートをエタノールで洗浄し、サンドイッチを組み立てます。ガラス板とスペーサーの下端がしっかりと位置合わせされていることを確認してください。
   2. 3.5 mLのdH₂O、2.4 mLの40%アクリルアミド/メチレンビスアクリルアミド、2 mLの1.5M Tris-HCl、100 μLの10%(w / v)SDS、80 μLの10% APS、8 μLのN、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を含む分離ゲル混合物を調製します。
      注意:TEMEDは有毒および/または刺激性があります。保護手袋を着用し、フードの下で作業してください。
   3. 分離ゲル混合物をゲルプレートに、短いプレートの上部から約1〜1.5cm下のレベルまで注ぎます。
   4. 分離ゲルの上部にイソプロパノールを重ねてゲル上部の気泡を取り除き、重合ゲルが乾燥しないようにします。
   5. 分離ゲルが重合した後、分離ゲルの上にイソプロパノールを少なくとも15分間注ぎます。
   6. 1.92 mLのdH₂O、300 μLの40%アクリルアミド/メチレンビスアクリルアミド、750 μLの0.5M Tris-HCl、100 μLの10%(w/v)SDS、30 μLの10% APS、および3 μLのTEMEDを含むスタッキングゲル混合物を調製します。
   7. 分離ゲルの上にスタッキングゲル溶液を注ぎ、ゲルプレートが充填されるようにします。コームをスペーサーの上部に挿入します。
   8. スタッキングゲルを室温で約15分間重合させます。
3. ゲルのランニング
   1. ゲルを電極アセンブリに取り付けます。調製したばかりの1x Tris-glycine SDS Running Bufferを装置の両方のチャンバーに加えます。
   2. コームを取り外します。
   3. はしごの5μL(10-250 kDa)と希釈したサンプルの中相の8μLをゲルのウェルにロードします。色素が分離ゲルに移行するまでゲルを80 Vで泳がせ、色素がゲルの底に達するまで120 Vまで増やします。色素がゲルの底に到達した後、印加された電源をオフにしてください。
4. ゲルの染色と脱染
   1. 実行が完了したら、装置からゲルを取り出し、スペーサーとガラスプレートを取り外します。ゲルを小さなトレイに入れます。
   2. 染色溶液(ステップ3.1.4)を55rpmで穏やかに振とうしながら30分間添加してゲルを染色します。
   3. ゲルから染色液を注ぎます。ゲルを少量の脱染液ですすぎ、染料を捨てます。
   4. ゲルを覆うのに十分な量の脱染液を加え、バンドが見えるまで~1時間穏やかに振とうして脱染します。

4. ウシラクトフェリンELISAを用いたラクトフェリン濃度

1. 標準物質および試薬の調製
   1. このアッセイには、市販のウシLF/LTF/ラクトフェリンELISAキットを使用してください。
   2. すべてのサンプルと標準試料をRTに平衡化します。
   3. 捕捉された抗原への結合に関与する十分な量の検出試薬AおよびBワーキング溶液を準備します。
   4. 検出試薬AおよびBを、アッセイ希釈剤AおよびBを用いてそれぞれ1:100の比率に希釈します。
   5. 30倍洗浄バッファー濃縮液をdH₂Oで希釈して、1倍作動洗浄バッファーを調製します。
   6. 十分な量の3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液を滅菌マイクロチューブに入れます。
   7. 凍結乾燥標準液(100 ng/mL)のチューブ1本を0.5 mLのサンプル希釈液で再懸濁し、室温で10分間静かに撹拌しながらインキュベートします。バイアルを回転させて、凍結乾燥されたサンプルがすべて底に集まるようにします。
   8. 以下の希釈スキームに従って標準希釈シリーズを調製します(表2)。

表2: ウシラクトフェリン標準の希釈スキーム。

薬瓶	希釈液の量(μL)	Lfの体積とソース(μL)	最終LF濃度(ng/mL)
D1	0	500 μL ストック	100
D2	250	バイアルD1希釈液250	50
D3	250	バイアルD2希釈250	25
D4	250	バイアルD250希釈	12.5
D5 の	250	バイアルD4希釈250	6.25
D6	250	バイアルD5希釈の250	3,125
D7	250	バイアルD250希釈	1,563
D8	250	0	0 = 空白

2. ウシラクトフェリンの濃度測定
   1. 各ラクトフェリン標準試料またはサンプル100 μLをコーティングされた96ウェルストリッププレートにピペットで移します。蒸発を防ぐために、プレートをプレートシーラーで覆います。37°Cで1時間インキュベートします。
   2. 各ウェルの液体を吸引します。100 μLの検出試薬Aの作業溶液を各ウェルに加えます。プレートシーラーで覆い、穏やかに攪拌して完全に混合します。37°Cで1時間インキュベートします。
   3. 各ウェルから液体を吸引した後、約350 μLの1x洗浄バッファーを加えて3回洗浄します。各洗浄を1〜2分間放置してから、完全に吸引します。最後の洗浄後、吸引して残っている洗浄バッファーを取り除き、プレートを反転させてきれいな吸収紙で軽くたたきます。
   4. 検出試薬Bの作業溶液100μLを各ウェルに加えます。新しいプレートシーラーで覆います。37°Cで30分間インキュベートします。各ウェルから液体を吸引し、ステップ4.2.3の説明に従って5回洗浄します。各ウェルに90 μLのTMB基質溶液を入れ、新しいプレートシーラーで覆います。
   5. 37°Cで10〜20分間、光を避けてインキュベートします。定期的にモニタリングして最適な色を確認してください。ウェル内の濃い青色には、高濃度のラクトフェリンが含まれていることを確認します。
   6. 各ウェルに50μLの停止溶液を加えます。色が青から黄色に変わります。各ウェルの吸光度を450 nmですぐに測定し、マイクロプレートリーダーとそれに関連するソフトウェアを使用します。
      注意: プレートを軽くたたいて、色の変化が均一になるまで完全に混合します。
3. 標準曲線の生成と結果の決定
   1. データ生成のステップ2.3.1に従って、ラクトフェリン濃度を推定します。
   2. ステップ2.3.2で説明したように、各標準試料の補正平均吸光度をプロットし、4パラメータ曲線適合が可能な適切なソフトウェアを使用して多項式曲線を描画することにより、標準曲線を作成します。
   3. ステップ2.3.3で説明したように、生成された式に吸収値を補間することにより、各サンプルのラクトフェリン含有量を計算します。

5. ウシIgG ELISAを用いた試料のIgG濃度測定

1. 標準物質および試薬の調製
   1. ウシIgG ELISAキットに付属しているものから必要なアイテムを使用してください。
   2. すべてのサンプルと標準試料をRTに平衡化します。
   3. 10 μLの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-アビジン濃縮物(100倍)を990 μLの酵素抗体複合体希釈液で希釈することにより、十分な量の酵素抗体標識溶液を調製します。
   4. 20倍洗浄バッファー濃縮液をdH₂Oで希釈し、十分な量の1倍洗浄バッファーを調製します。
   5. 20倍希釈液濃縮液をdH₂Oで希釈することにより、十分な量の1倍希釈液を調製します。
   6. 1.0 mLのdH₂OをウシIgGキャリブレーターに加え、溶解するまで穏やかに混合します。キャリブレーターの最終濃度は123.000 ng / mLです。
   7. 表3に記載の希釈スキームに従って、標準希釈シリーズを調製します。

表3: ウシIgG標準の希釈スキーム。

薬瓶	希釈液の量(μL)	IgGの体積と発生源(μL)	最終IgG濃度(ng/mL)
D1	900	100 μL ストック	12300
D2	900	100バイアルD1希釈	1230
D3	178	バイアルD2希釈の122	500
D4	150	バイアルD50希釈	250
D5 の	150	バイアルD4希釈の150	125
D6	100	100バイアルD5希釈	62.5
D7	100	バイアルD6希釈100	31.25
D8	100	100バイアルD7希釈	15,625
D9	100	バイアルD8希釈100	7,813
D10	100	0	0 = 空白

2. ウシIgG ELISAアッセイの手順
   1. 各IgG標準試料またはサンプル100μLをコーティングされた96ウェルストリッププレートにピペットで移します。プレートをプレートシーラーで覆い、室温で30分間インキュベートします。各ウェルから液体を吸引します。
   2. ウェルに1x洗浄バッファーを充填して4回洗浄し、吸引します。最後の洗浄後、吸引して残留洗浄バッファーを取り除き、プレートを反転させてきれいな吸収紙に軽くたたいます。各ウェルに100 μLの適切に希釈した酵素-抗体複合体を添加します。プレートシーラーで覆い、穏やかに攪拌して完全に混合します。
   3. 室温で10分間インキュベートします。ステップ5.2.2で説明されているように、ウェルから残留洗浄バッファーを洗浄して除去します。各ウェルに100 μLのTMB基質を添加します。新しいプレートシーラーで覆います。
   4. 室温で正確に10分間インキュベートします。各ウェルに100μLの停止溶液を加えて反応を停止します。マイクロプレートリーダーとそれに関連するソフトウェアを使用して、各プレートを450nmで読み取ります。
3. 標準曲線の生成と結果の決定
   1. データ版のステップ 2.3.1 に従って、IgG 濃度を推定します。
   2. X軸に濃度をプロットし、Y軸に各標準試料の補正平均吸光度をプロットして、標準曲線を作成します。4パラメータ曲線フィットが可能な適切なソフトウェアを使用して多項式曲線を描画します。
   3. ステップ2.3.3で説明したように、生成された式に吸収値を補間することにより、各サンプルのIgG含有量を計算します。

結果

プロトコールに従って、ウシ初乳サンプルを分析して、タンパク質、ラクトフェリン、およびIgG濃度を決定しました。ウシ初乳のタンパク質、ラクトフェリン、およびIgG分析の結果を 表4に示します。

表4: ウシ初乳のタンパク質、ラクトフェリン、およびIgGの濃度。

ディスカッション

この研究は、成熟乳への移行期間中の初乳中のタンパク質、ラクトフェリン、およびIgG濃度の大幅な変化に関する情報を提供します。ラクトフェリンとIgG濃度の変化の検出はサンドイッチELISAで行い、総タンパク質濃度はBCAアッセイで分析しました。結果は、初期の初乳がタンパク質、ラクトフェリン、およびIgG濃度が最も高く、その後3日間で減少したことを示して...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Running Buffer (Tris-Glycine-SDS)	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
2-mercaptoethanol	gibco	31350-010	SDS-Page analysis
Acetic Acid GLACIAL	Isolab	901,013,2500	SDS-Page analysis
Bovine IgG ELISA Kit	Aviva Systems Biology	OKIA00005	Determination of IgG concentration
Bovine LF / LTF / Lactoferrin ELISA Kit	LSBio Lifespan Biosciences	LS-F4884	Determinaton of lactoferrin concentration
Coomassie Brillant Blue R 250	amresco	0472-25G	SDS-Page analysis
Hydrochloric Acid Fuming 37%	Isolab	932,103,2501	SDS-Page analysis
Isopropanol	Isolab	961,023,2500	SDS-Page analysis
Laemmli Sample Buffer (2X)	ClearBand	LSB-2x	SDS-Page analysis
Methanol	Isolab	947,046,2500	SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 to 250	Thermo Scientific	26619	SDS-Page analysis
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Determination of protein concentration
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioShop	SDS001.500	SDS-Page analysis
SureCast Acrylamide Solution 40% (w/v)	Invitrogen	HC2040	SDS-Page analysis
SureCast Ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874	SDS-Page analysis
SureCast Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	HC2006	SDS-Page analysis
TECAN Infinite M200 Plate Reader	Tecan	30035094	Measurement of absorbance
Tris base	BioShop	TRS001.1	SDS-Page analysis