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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo la radiosintesi di 1-(2-[18F]Fluoroetil)-L-triptofano, un agente di imaging tomografico ad emissione di positroni per studiare il metabolismo del triptofano, utilizzando una strategia one-pot, in due fasi in un sistema di sintesi radiochimica con buone rese radiochimiche, alto eccesso enantiomerico e alta affidabilità.

Abstract

La via della chinurenina (KP) è una via primaria per il metabolismo del triptofano. L'evidenza suggerisce fortemente che i metaboliti del KP svolgono un ruolo vitale nella proliferazione tumorale, nell'epilessia, nelle malattie neurodegenerative e nelle malattie psichiatriche a causa dei loro effetti immunomodulatori, neuromodulatori e neurotossici. L'agente più ampiamente utilizzato per la tomografia ad emissione di positroni (PET) per la mappatura del metabolismo del triptofano, α-[11C]metil-L-triptofano ([11C]AMT), ha una breve emivita di 20 minuti con laboriose procedure di radiosintesi. È necessario un ciclotrone in loco per radiosintetizzare [11C]AMT. Solo un numero limitato di centri produce [11C]AMT per studi preclinici e indagini cliniche. Quindi, è urgentemente necessario lo sviluppo di un agente di imaging alternativo che abbia un'emivita più lunga, una cinetica in vivo favorevole ed è facile da automatizzare. L'utilità e il valore di 1-(2-[18F]fluoroetil)-L-triptofano, un analogo del triptofano marcato con fluoro-18, è stato riportato in applicazioni precliniche in xenotrapianti derivati dalla linea cellulare, xenotrapianti derivati dal paziente e modelli tumorali transgenici.

Questo documento presenta un protocollo per la radiosintesi di 1-(2-[18F]fluoroetil)-L-triptofano utilizzando una strategia one-pot, two-step. Utilizzando questo protocollo, il radiotracciante può essere prodotto in una resa radiochimica del 20 ± 5% (decadimento corretto al termine della sintesi, n > 20), con purezza radiochimica ed eccesso enantiomerico di oltre il 95%. Il protocollo presenta una piccola quantità di precursore con non più di 0,5 mL di solvente di reazione in ogni fase, un basso carico di 4,7,13,16,21,24-esaooxa-1,10-diazabiciclo potenzialmente tossico[8.8.8]esacosano (K222) e una fase mobile ecologicamente benigna e iniettabile per la purificazione. Il protocollo può essere facilmente configurato per produrre 1-(2-[18F]fluoroetil)-L-triptofano per l'indagine clinica in un modulo disponibile in commercio.

Introduzione

Nell'uomo, il triptofano è un componente essenziale della dieta quotidiana. Il triptofano viene metabolizzato principalmente attraverso la via della chinurenina (KP). Il KP è catalizzato da due enzimi limitanti la velocità, indoleamina 2, 3-diossigenasi (IDO) e triptofano 2, 3-diossigenasi (TDO). Più del 95% del triptofano viene convertito in chinurenina e nei suoi metaboliti a valle, generando in definitiva nicotinamide adenina dinucleotide, che è essenziale per la trasduzione dell'energia cellulare. Il KP è un regolatore chiave del sistema immunitario e un importante regolatore della neuroplasticità e degli effetti neurotossici1,2. Il metabolismo anormale del triptofano è implicato in vari disturbi neurologici, oncologici, psichiatrici e metabolici; pertanto, gli analoghi del triptofano radiomarcati sono stati ampiamente utilizzati nelle indagini cliniche. I due radiotraccianti di triptofano clinicamente studiati più comuni sono 11C-α-metil-L-triptofano ([11C]AMT) e 11C-5-idrossitriptofano (11C-5-HTP)3.

Nel 1990, 11C-5-HTP è stato utilizzato per visualizzare i tumori neuroendocrini secernenti serotonina4 e per diagnosticare e monitorare la terapia dell'adenocarcinoma prostatico refrattario all'ormone metastatico5. Successivamente, è stato utilizzato come strumento di imaging per la quantificazione del sistema serotoninergico nel pancreas endocrino6. 11 anni C-5-HTP è stato anche un tracciante promettente per il rilevamento non invasivo di isole vitali nel trapianto di isole intraportali e diabete di tipo 27,8. Negli ultimi due decenni, molti amminoacidi radiomarcati sono passati all'indagine clinica9,10. In particolare, l'analogo del triptofano marcato con carbonio-11 [11C]AMT ha ricevuto ampia attenzione per la mappatura della sintesi della serotonina cerebrale11,12,13,14 e per la localizzazione di focolai epilettici, tumori epilettogeni, complesso di sclerosi tuberosa, gliomi e tumori al seno15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24,25,26. [11C] L'AMT ha anche un elevato assorbimento in vari tumori di basso e alto grado nei bambini27. Inoltre, l'analisi cinetica del tracciante di [11C]AMT in soggetti umani è stata utilizzata per differenziare e classificare vari tumori e differenziare il glioma dal danno tissutale indotto dalle radiazioni15. [11C] L'imaging guidato da AMT mostra significativi benefici clinici nei disturbi cerebrali3,25. Tuttavia, a causa della breve emivita del carbonio-11 (20 min) e delle laboriose procedure di radiosintesi, l'uso di [11C]AMT è limitato ai pochi centri PET con un ciclotrone in loco e una struttura di radiochimica.

Fluorine-18 ha un'emivita favorevole di 109,8 min, rispetto all'emivita di 20 min del carbonio-11. Sempre più spesso, gli sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di radiotraccianti marcati con fluoro-18 per il metabolismo del triptofano3,28. Un totale di 15 unici radiotraccianti di triptofano con fluoro-18 sono stati riportati in termini di radioetichettatura, meccanismi di trasporto, stabilità in vitro e in vivo, biodistribuzione e assorbimento tumorale negli xenotrapianti. Tuttavia, è stata osservata una rapida defluorurazione in vivo per diversi traccianti, tra cui 4-, 5-, e 6-[18F]fluorotriptofano, precludendo un'ulteriore traduzione clinica29. 5-[18F]Fluoro-α-metiltriptofano (5-[18F]FAMT) e 1-(2-[18F]fluoroetil)-L-triptofano (L-[18F]FETrp, noto anche come acido (S)-2-ammino-3-(1-(2-[18F]fluoroetil)-1H-indol-3-il)propanoico, peso molecolare 249,28 g/mole), sono i due radiotraccianti più promettenti con cinetica in vivo favorevole nei modelli animali e grande potenziale di superamento [11 C]AMT per la valutazione delle condizioni cliniche con metabolismo del triptofano deregolato28. 5-[18F]FAMT ha mostrato un elevato assorbimento negli xenotrapianti tumorali IDO1-positivi di topi immunocompromessi ed è più specifico per l'imaging del KP rispetto a [11C]AMT28,30. Tuttavia, la stabilità in vivo di 5-[18F]FAMT rimane una potenziale preoccupazione in quanto non sono stati riportati dati di defluorurazione in vivo oltre 30 minuti dopo l'iniezione del tracer30.

Uno studio preclinico in un modello murino di medulloblastoma geneticamente modificato ha mostrato che, rispetto al 18F-fluorodesossiglucosio (18F-FDG), L-[18F]FETrp aveva un elevato accumulo nei tumori cerebrali, una defluorizzazione in vivo trascurabile e un basso assorbimento di fondo, dimostrando un rapporto target-non target superiore31,32. Gli studi di dosimetria delle radiazioni nei topi hanno indicato che L-[18F]FETrp aveva un'esposizione dosimetrica favorevole inferiore di circa il 20% rispetto al tracciante clinico 18F-FDG PET33. In accordo con le scoperte di altri ricercatori, i dati degli studi preclinici forniscono prove sostanziali a sostegno della traduzione clinica di L-[18F]FETrp per lo studio del metabolismo anormale del triptofano negli esseri umani con disturbi cerebrali come epilessia, neuro-oncologia, autismo e sclerosi tuberosa28,31,32,33,34,35,36 . Un confronto complessivo tra i tre traccianti più ampiamente studiati per il metabolismo del triptofano, 11C-5-HTP, [11C]AMT e L-[18F]FETrp, è mostrato nella Tabella 1. Sia 11C-5-HTP e [11C]AMT hanno una breve emivita e laboriose procedure di radioelabazione. Un protocollo per la radiosintesi di L-[18F]FETrp utilizzando un approccio one-pot, two-step è descritto qui. Il protocollo prevede l'uso di una piccola quantità di precursore di radioetichettatura, un piccolo volume di solventi di reazione, un basso carico di K222 tossico e una fase mobile ecologicamente benigna e iniettabile per la purificazione e la facile formulazione.

Protocollo

ATTENZIONE: Il protocollo coinvolge materiali radioattivi. Qualsiasi dose aggiuntiva di materiali radioattivi potrebbe portare ad un aumento proporzionale della possibilità di effetti avversi sulla salute come il cancro. I ricercatori devono seguire le pratiche di dose "il più basso ragionevolmente ottenibile" (ALARA) per guidare il protocollo di radiosintesi con un'adeguata protezione nella cella calda o nel cappuccio di piombo. Ridurre al minimo il tempo di contatto diretto, utilizzare uno scudo di piombo e mantenere la massima distanza per qualsiasi fase di esposizione alle radiazioni nel processo di radiosintesi sono essenziali. Indossa un badge di dosimetria delle radiazioni e anelli di monitoraggio delle mani durante l'intero esperimento e monitora frequentemente superfici potenzialmente contaminate come guanti, maniche e piedi. La Nuclear Regulatory Commission (NRC), i regolamenti locali e istituzionali devono essere seguiti per l'uso, la spedizione e lo smaltimento di qualsiasi materiale radioattivo.

1. Preparativi iniziali

  1. Preparare il 10% di etanolo in 50 mM di acetato di sodio/acido acetico in fase mobile per cromatografia liquida semipreparata ad alte prestazioni (HPLC).
    1. Introdurre 3 ml di acido acetico glaciale in un matraccio tarato pulito da 1000 ml. Aggiungere 900 ml di acqua ultrapura (resistività di 18 milioni di ohm-cm a 25 °C) nel matraccio volumetrico; aggiungere circa 8 mL di soluzione di idrossido di sodio 6 M e regolare il pH a 5,5 utilizzando un pHmetro calibrato e una striscia di pH. Dopo che la soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, portare il volume a 1000 ml con acqua ultrapura per preparare la soluzione di acetato di sodio/acido acetico da 50 mM (pH 5,5).
    2. Filtrare sotto vuoto la soluzione attraverso un filtro a membrana da 0,2 μm e trasferire la soluzione in due flaconi di solvente da 500 ml.
    3. Introdurre circa 250 mL del tampone di cui sopra in un matraccio tarato da 500 ml. Utilizzare un cilindro graduato per misurare 50 ml di etanolo della Farmacopea degli Stati Uniti (USP) e aggiungere l'etanolo al pallone volumetrico. Portare il volume a 500 mL con 50 mM di acetato di sodio/acido acetico e misurare il valore del pH con una striscia di pH.
  2. Preparare soluzioni di controllo qualità (QC) per un test di idoneità del sistema.
    1. Riempire le bottiglie di solvente HPLC con acqua fresca ultrapura (solvente A) ed etanolo (solvente B). Innescare la pompa HPLC e caricare il programma HPLC con una portata di 1 mL/min composta per il 30% da solvente A e per il 70% da solvente B (v/v).
    2. Creare una soluzione di controllo (soluzione vuota) per il controllo qualità. Aggiungere 5 mL di cloruro di sodio allo 0,9% in un flaconcino di vetro da 20 mL. Aggiungere 0,15 ml di cloruro di sodio al 23,4% nella soluzione di cui sopra. Aggiungere 6 mL di fase mobile HPLC semipreparante preparata nella fase 1.1.3 (10% di etanolo in 50 mM di acetato di sodio/acido acetico, pH 5,5) al flaconcino di vetro.
    3. Preparare 1 μg/mL di L-FETrp non irradiato e 5 μg/mL di miscele racemiche L-FETrp e D-FETrp (soluzioni standard).
    4. Costruire una curva di calibrazione utilizzando soluzioni standard L-FETrp (0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL).
    5. Impostare la sequenza HPLC. Assicurarsi che la sequenza includa una serie della soluzione campione in bianco, due serie di L-FETrp standard (1 μg/mL), una serie delle miscele racemiche L-FETrp e D-FETrp (5 μg/mL) e una corsa del radiofarmaco finale.
    6. Eseguire la sequenza HPLC parziale per testare l'idoneità del sistema prima di analizzare i campioni radioattivi utilizzando una colonna HPLC analitica (250 x 4,6 mm).
      1. Eseguire un campione vuoto e assicurarsi che il cromatogramma del campione vuoto non mostri picchi o insignificanti tra il volume vuoto e 10 minuti del cromatogramma.
      2. Eseguire due repliche della soluzione standard (contiene 1 μg/mL di L-FETrp). Assicurarsi che le aree di L-FETrp nelle due repliche siano entro ±5% del valore medio.
      3. Eseguire un campione delle miscele L-FETrp e D-FETrp (5 μg/mL di L-FETrp e D-EFTrp, rispettivamente). Assicurarsi che L-FETrp e D-FETrp possano essere identificati sul cromatogramma e che il basale sia risolto.
  3. Preparare le soluzioni di radioelabazione e altri materiali di consumo.
    1. Aggiungere le seguenti soluzioni a cinque flaconcini a forma di V da 1,5 ml, rispettivamente. Flaconcino 1: 1 mL di soluzione di carbonato di potassio (K2CO3)/K222 (5 mg/mL K222 e 1 mg/mL K2CO3 in una soluzione di acqua/acetonitrile, 1/99, v/v) per l'eluizione di [18F]fluoruro; Flaconcino 2: 0,4 mL di acetonitrile anidro per l'essiccazione al fluoruro [18F]; Flaconcino 3: precursore radioetichettatore in acetonitrile anidro (1-2 mg in 0,5 mL di acetonitrile anidro) per incorporazione di [18F]fluoruro; Flaconcino 4: acido cloridrico (2 M, 0,25 mL) in acetonitrile (0,25 mL) per acidolisi; Flaconcino 5: idrossido di sodio 2 M (0,25 mL) per la neutralizzazione delle miscele di reazione.
    2. Attivare una cartuccia luminosa di metilammonio quaternario (QMA) passando prima attraverso 10 mL di soluzione satura di bicarbonato di sodio, seguita da 10 mL di acqua ultrapura, quindi sciacquando la cartuccia con un flusso di azoto. Condizionare una cartuccia C8 leggera e una cartuccia di ossido di alluminio neutro passando attraverso 10 ml di etanolo, seguiti da 10 ml di acqua ultrapura.
    3. Aggiungere 0,15 mL di cloruro di sodio al 23,4% e 5 mL di cloruro di sodio allo 0,9% a un flaconcino di formulazione sterile da 30 mL per regolare la tonicità e diluire la frazione HPLC.
    4. Preparare una soluzione (1 mL di tampone acetato di sodio/acido acetico, 50 mM, pH = 5,5 preparato nella fase 1.1.1, 1 mL di etanolo e 0,5 mL di acqua [totale 2,5 mL]) in una siringa per il risciacquo del recipiente di reazione; caricare in un flaconcino sterile da 10 ml.

2. Assemblare le forniture di radioetichettatura e radiosintetizzare L-[18F]FETrp

  1. Assemblare i materiali di alimentazione per la radioetichettatura.
    1. Accendere l'alimentazione del modulo, l'anidride carbonica, l'aria compressa, le linee di argon e l'alimentazione del controllore logico programmabile (PLC). Fare clic sul pulsante mod_pscf18 per attivare il programma del sistema di sintesi radiochimica. Inizializza l'MVP di input, output e formulazione e assicurati che gli MVP si trovino rispettivamente nelle posizioni 4, 1, 1.
    2. Assicurarsi che il loop HPLC sia in posizione Diject e che la cartuccia luminosa QMA nella posizione di intrappolamento del fluoruro [18F].
    3. Installare il flacone di fase mobile HPLC semipreparatore (contenente la soluzione preparata al punto 1.1.3). Equilibrare il sistema HPLC facendo passare la fase mobile attraverso la colonna HPLC chirale (250 x 10 mm) e la colonna C18 (100 x 10 mm) a una portata di 2 mL/min per almeno 30 min, quindi commutare la valvola di deviazione, lasciare che il cellulare HPLC passi solo attraverso la colonna HPLC chirale e aumentare la portata a 3 mL/min.
    4. Installare la cartuccia luminosa QMA nella linea di intrappolamento/rilascio del fluoruro [18F]. Installare le cartucce di allumina/C8 impilate tra la posizione MVP di ingresso 6 e il flaconcino intermedio, che è un flaconcino a forma di V da 10 mL collegato al loop di campionamento HPLC. Installare un flaconcino vuoto da 10 mL (flaconcino di sfiato) nella posizione MVP di uscita 4 con un altro ago attaccato al flaconcino come sfiato. Installare i flaconcini del reagente 1-5 nelle posizioni MVP di ingresso 1-5, rispettivamente.
    5. Installare il flaconcino contenente la soluzione di risciacquo preparata al punto 1.3.4 nella posizione MVP di uscita 6.
    6. Installare una bottiglia da 500 ml (per raccogliere i rifiuti HPLC passando attraverso entrambe le colonne chirali e C18) alla formulazione MVP posizione 1. Installare un'altra bottiglia da 500 ml (per raccogliere i rifiuti HPLC che passano attraverso la colonna chirale) all'estremità di raccolta dei rifiuti della valvola a due posizioni a quattro porte.
    7. Collegare il flaconcino di raccolta delle frazioni (soluzione preriempita preparata al punto 1.3.3) alla formulazione MVP posizione 2. Collegare l'uscita MVP posizione 3 (linea del gas) e la linea di consegna del prodotto finale alla formulazione MVP posizione 2 fiale per recuperare il prodotto finale formulato. Installare un flaconcino sterile vuoto da 10 mL nella formulazione MVP posizione 3, che verrà utilizzato come flaconcino di backup per la raccolta della frazione target.
    8. Installare la colonna corta C18 tra la valvola di deviazione a quattro porte e due posizioni e la formulazione MVP.
      NOTA: durante l'installazione del reagente e dei flaconcini di formulazione, assicurarsi che l'alimentazione di argon nel pannello di controllo sia disattivata e che la pressione dell'argon sia pari a zero per evitare qualsiasi trasferimento imprevisto di liquido durante l'assemblaggio del flaconcino. Ricontrollare tutte le connessioni degli aghi, le posizioni dei flaconcini e le posizioni MVP per la radiosintesi riproducibile.
  2. Radiosintesi di L-[18F]FETrp
    1. Ricevere e rilevare [18F]fluoruro.
      1. Quando si riceve la soluzione di fluoruro [18F] (15 ± 3 gigabecquerel (GBq) all'inizio della sintesi, vedere la tabella dei materiali), esaminare la scatola di piombo sulla superficie e a 1 m per registrare i tassi massimi di esposizione alle radiazioni. Fai un test di pulizia per assicurarti che la scatola di spedizione non sia contaminata. Registrare la dose e il tempo di [18F]fluoruro.
    2. Trasferire [18F]fluoruro.
      1. Trasferire la radioattività al sistema di sintesi radiochimica.
      2. Collegare la linea di argon con un ago corto e la linea di trasferimento del fluoruro [18F] con un ago lungo al flaconcino di fluoruro [18F]. Chiudere la porta a vetri a celle calde e la porta di piombo.
        ATTENZIONE: utilizzare un morsetto lungo per spingere verso il basso entrambi gli aghi; assicurarsi che la punta lunga dell'ago si trovi sul fondo del flaconcino di fluoruro [18F] in modo che tutto il fluoruro [18F] possa essere trasferito. In genere, viene richiesto un flaconcino a forma di V per la somministrazione di [18F]fluoruro.
    3. Trappola, eluire e azeotropicamente secco [18F] fluoruro.
      1. Fare clic su Ar Supply per attivare la linea di alimentazione dell'argon, aumentare la pressione dell'argon, attivare la linea di spinta del fluoruro [18F] e spingere il fluoruro acquoso [18F] attraverso la cartuccia luminosa QMA. Dopo che tutta la radioattività è intrappolata nella cartuccia luminosa QMA e la lettura del rilevatore di radioattività è costante, aumentare la pressione dell'argon e soffiare l'argon attraverso la cartuccia per altri 5 minuti per rimuovere l'acqua in eccesso.
      2. Spegnere la linea di spinta del fluoruro [18F], ridurre la pressione dell'argon a zero, commutare la valvola a due posizioni a sei porte dalla posizione di intrappolamento del fluoruro [18F] alla posizione di eluizione. Aprire il flaconcino di reazione, accendere la linea di argon MVP posizione 1 in ingresso, spingere la soluzione K222/K2CO3 nel flaconcino mvp posizione 1 in ingresso attraverso la cartuccia luminosa QMA per eluire la radioattività nel flaconcino di reazione. Commutare la posizione di eluizione del fluoruro [18F] nella posizione di intrappolamento.
      3. Fare clic sul pulsante Calore per riscaldare il reattore a 110 °C, attivare la linea di argon MVP posizione 4 di uscita (linea di spazzamento) che si collega al reattore ed evaporare il solvente nel flaconcino di uscita MVP posizione 4.
      4. Fare clic sul pulsante Freddo per raffreddare il reattore a temperatura ambiente con anidride carbonica compressa, spegnere la linea di spazzamento, commutare la posizione MVP di ingresso 1 in posizione 2 e aggiungere l'acetonitrile anidro nel flaconcino 2. Accendere la linea di spazzamento e il riscaldatore al fluoro azeotropicamente secco [18F] a 110 °C.
    4. Aggiungere il precursore della radioetichettatura e incorporare [18F]fluoruro.
      1. Raffreddare il reattore a temperatura ambiente, spegnere la linea di spazzamento, commutare la posizione MVP di ingresso 2 in posizione 3 e aggiungere il precursore di radioetichettatura tosilato nel flaconcino 3. Chiudere il reattore e riscaldare le miscele di reazione a 100 °C per 10 minuti.
    5. Evaporare il solvente di reazione e acidolisi.
      1. Raffreddare e aprire il reattore, accendere la linea di spazzamento ed evaporare il solvente di reazione a 100 °C.
      2. Raffreddare il reattore, spegnere la linea di spazzamento, commutare la posizione MVP di ingresso 3 alla posizione 4 e aggiungere la miscela acido cloridrico/acetonitrile (0,5 mL, 1/1, v/v). Riscaldare la reazione a 100 °C per 10 minuti per deproteggere i gruppi di protezione terz-butile e terz-butilossicarbonile nel precursore della radioetichettatura.
    6. Neutralizzare la reazione.
      1. Raffreddare il reattore a temperatura ambiente e commutare la posizione MVP di ingresso 4 in posizione 5 per aggiungere idrossido di sodio 2 M per neutralizzare la miscela di reazione. Disattivare la linea di argon MVP di ingresso.
    7. Trasferire la miscela di reazione al flaconcino intermedio.
      1. Fare clic sul pulsante F nell'MVP di uscita per passare l'MVP di uscita dalla posizione di sfiato 4 alla posizione 5, quindi fare clic sul pulsante F nell'MVP di ingresso per passare l'MVP di ingresso dalla posizione 5 alla posizione 6. Attivare la linea di argon MVP di uscita. Spingere la miscela di reazione attraverso le cartucce di ossido di alluminio neutro e C8 impilate fino al flaconcino intermedio installato prima del ciclo di campionamento HPLC.
    8. Risciacquare il reattore e trasferire la soluzione.
      1. Commutare la posizione MVP di uscita 5 in posizione 6, spingere la soluzione di risciacquo nel flaconcino di uscita MVP posizione 6 attraverso il flaconcino di reazione e le cartucce al flaconcino intermedio, successivamente. Si noti che il volume della miscela combinata è di circa 3,5 ml. Chiudere il recipiente di reazione.
    9. Caricare la miscela combinata sul circuito HPLC e purificare la miscela.
      1. Commutare il loop HPLC dalla posizione di iniezione alla posizione di carico, attivare la linea di argon MVP in ingresso e caricare le miscele nel loop HPLC da 5 mL. Al termine del carico, impostare il pulsante di caricamento per l'iniezione e fare clic su Inietta HPLC per avviare il cromatogramma HPLC a una portata di 3 ml/min. Fare clic sul pulsante del monitor HPLC per accedere al cromatogramma HPLC in tempo reale.
    10. Deviare la frazione target sulla colonna C18.
      1. Fare clic sul pulsante MVP di deviazione per deviare la frazione HPLC di destinazione sulla colonna C18 corta a circa 12 minuti.
    11. Lavare la colonna HPLC chirale e purificare la frazione nella colonna C18.
      1. Dopo che la radioattività target è stata raccolta nella colonna C18 (e la fase mobile HPLC scorre nella bottiglia di scarico della formulazione MVP posizione 1), commutare la valvola di deviazione a due posizioni a quattro porte nella posizione di raccolta dei rifiuti. Lavare la colonna chirale a 4 mL/min per 6 min per rimuovere l'enantiomero minore D-[18F]FETrp e altre impurità ultraviolette (UV).
      2. Fare clic sul pulsante MVP di deviazione per deviare la fase mobile HPLC verso la posizione MVP 1 della formulazione a una portata di 3 ml / min. Osservate che la fase mobile passa attraverso la colonna chirale e la colonna C18 per purificare L-[18F]FETrp trattenuto nella colonna C18.
    12. Raccogliere la frazione target.
      1. Raccogliere l'eluente a circa 32-34 minuti nel flaconcino di posizione 2 della formulazione MVP.
        NOTA: In genere, viene raccolta una frazione HPLC di 2 minuti e il volume totale più la soluzione di cloruro di sodio preriempita è di 8-15 ml.
    13. Somministrare la dose a un flaconcino sterile del prodotto finale.
      1. Spingere la soluzione nel flaconcino MVP posizione 2 della formulazione attraverso la linea di erogazione e il filtro sterile nel flaconcino della dose finale (tramite l'ago del filtro di sfiato sterile preinstallato).
        NOTA: i passaggi del protocollo 2.2.9-2.2.13 sono passaggi utilizzati per la purificazione HPLC di L-[18F]FETrp.
    14. Analizzare la radioattività e il volume della dose.
      1. Rimuovere il filtro sterile e valutare l'attività e il volume della dose finale.
      2. Lavare il sistema con acqua ultrapura seguita da etanolo a 4 ml/min per almeno 15 minuti ciascuno. Spegnere la pompa HPLC e la scatola PLC; chiudere il programma; arrestare la linea dell'aria compressa, la linea dell'argon e la linea dell'anidride carbonica; e spegnere l'alimentazione principale del modulo.
    15. Prelevare la dose QC ed eseguire i campioni QC.
      1. Prelevare circa 0,1 mL della dose finale in un inserto da 0,2 mL di un flaconcino qc. Eseguire l'esempio a caldo come programma di "sequenza parziale" seguendo il test di idoneità del sistema descritto nel passaggio 1.2.6 .
    16. Analizzare i dati QC e rilasciare la dose.
      1. Calcolare le purezze chimiche e radiochimiche, l'eccesso di valore enantiomerico e l'attività molare; determinare il valore del pH.
      2. Rilasciare la dose se tutti i risultati dei test superano l'intervallo accettabile.

3. Sistema post-esecuzione pulito

  1. Esaminare il modulo di radioelabazione utilizzando un misuratore di rilevamento Geiger-Mueller (GM) per garantire che la radioattività sia adeguatamente decomposta (almeno 24 ore) prima che il sistema sia pulito.
  2. Accendere il modulo di radioetichettatura di alimentazione e l'alimentazione della scatola PLC; attivare il programma del sistema di sintesi radiochimica; e inizializzare l'MVP di input, l'MVP di output e l'MVP di formulazione. Impostare il selettore di colonne sulla posizione di bypass.
  3. Staccare la luce QMA, l'allumina e le cartucce C8.
  4. Lavare prima tutti i flaconcini e le linee con acqua ultrapura, seguita da etanolo. Asciugare i flaconcini e le linee con argon ad alta purezza.
  5. Sigillare ogni sfiato di linea usando un ago sterile con un cappuccio. Sostituire i flaconcini del reagente e il recipiente di reazione rispettivamente con flaconcini bruciati in forno e recipiente di reazione.
  6. Spegnere la pompa HPLC e la scatola PLC; chiudere il programma; arrestare la linea dell'aria compressa, la linea dell'argon e la linea dell'anidride carbonica; e spegnere l'alimentazione principale del modulo.

Risultati

Lo schema di reazione è mostrato nella Figura 1. La radioetichettatura comprende le seguenti due fasi: 1) la reazione del precursore della radioetichettatura tosilato con il fluoruro [18F] fornisce l'intermedio marcato 18F e 2) la deprotezione dei gruppi terz-butilossicarbonile e terz-butil-protettivo nell'intermedio offre il prodotto finale L-[18F]FETrp. Entrambe le fasi di reazione continuano a 100 °C per 10 minuti.

Discussione

Il triptofano è un aminoacido essenziale per l'uomo. Svolge un ruolo importante nella regolazione dell'umore, della funzione cognitiva e del comportamento. I derivati del triptofano radiomarcati, in particolare il carbon-11-labeled [11C]AMT, sono stati ampiamente studiati grazie al loro ruolo unico nella mappatura della sintesi della serotonina38,39, nel rilevamento e nella classificazione dei tumori40, nella guida della chirur...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non esistono interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dal Diagnostic & Research PET/MRI Center e dai Dipartimenti di Ricerca Biomedica e Radiologia del Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
[18F]Fluoride in [18O]H2OPETNET Solutions Inc.N/A
4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosaneACROS291950010Kryptofix 222 or K222, 98%
Acetic acidACROS22214250099.8%
AcetonitrileSigma-Aldrich271004anhydrous, 99.8%
Agilent 1260 HPLC systemAgilent TechnologiesAgilent 1260Agilent 1260 series
Analytcial chiral HPLC columnSigma-Aldrich12024ASTAstec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm
Carbon dioxide, 60 LBSAirgasREFR744R200S99.99%
D-FETrp standard referenceAffinity Research Chemicals IncN/ACustom synthesis
Empty sterile vialJubilant HollisterStier751520 mm closure, 10 mL
EthanolDecon Labs2716200 proof, USP grade. ≥99.9%
Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterileFisher Scientific09-720-3
Hydrochloric acidSigma-Aldrich30721≥37%
IsopropanolDecon Labs831670%, sterile
L-[18F]FETrp radiolabeling precursorAffinity Research Chemicals IncN/ACustom synthesis
L-FETrp standard referenceAffinity Research Chemicals IncN/ACustom synthesis
Light C8 cartridgeWatersWAT036770Sep-Pak  C8 plus light cartridge
Needle, 20 G x 1Becton-Dickinson & Co.305175
Needle, 20 G x 1 ½Becton-Dickinson & Co.305176
Needle, 21 G x 2Becton-Dickinson & Co.305129
Neutral aluminum oxideWatersWAT023561Sep-Pak alumina N plus light
Nylon membrane (0.20 µm )MilliPoreGNWP0470047 mm
Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filterPall Corporation4907
PETCHEM radiochemistry synthesis systemPETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MIN/ARadiosynthesizer
pH strips 2.0 - 9.0EMD Millipore1.09584.0001
Potassium carbonateSigma-Aldrich36787799.995%
Quaternary methylammonium light cartridgeWaters186004051Sep-Pak QMA light
Semi-preparative C18 HPLC columnPhenomenex00D-4253-N0100 × 10 mm
Semi-preparative chiral HPLC columnSigma-Aldrich12034ASTAstec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm
Sodium chloride injection 23.4%APP Pharmaceutical, LLC18730USP grade
Sodium chloridei injection 0.9%HospiraNDC 0409-4888-10USP grade
Sodium hydroxideHoneywell30657699.99%
Spinal needle, 20 G x 3 ½Becton-Dickinson & Co.405182
Sterile alcohol prep padsBioMed Resource Inc.PC661
Sterile empty vials, 2 mLHollister Stier7505ZA13 mm closure
Sterile empty vials, 30 mLJubilant HollisterStier7520ZA20 mm closure
Syringe PP/PE, 3 mL, Luer LockAir-Tite4020-X00V0
Syringe PP/PE, 5 mL, Luer LockBecton-Dickinson & Co.309646
Syringe,  PP/PE, 10 mL, NORM-JECTAir-Tite4100-000V0
Syringe, 1 mL, Luer SlipBecton-Dickinson & Co.309659
Syringe, 3 mL, Luer-LockBecton-Dickinson & Co.309657
Ultra high purity argonAirgasAR UHP30099.999%
Ultrapure waterMilliporeSigmaZRQSVP300Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system

Riferimenti

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