Metodo Digital Droplet PCR per la quantificazione dell'efficienza di trasduzione AAV nella retina murina

Riepilogo

Questo protocollo presenta come quantificare l'efficienza di trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando la PCR a goccia digitale (dd-PCR) insieme alla produzione di AAV su piccola scala, all'iniezione intravitreale, all'imaging retinico e all'isolamento del DNA genomico retinico.

Abstract

Molti laboratori di biologia cellulare retinica ora utilizzano abitualmente virus adeno-associati (AAV) per l'editing genetico e le applicazioni regolatorie. L'efficienza della trasduzione AAV è solitamente critica, il che influisce sui risultati sperimentali complessivi. Uno dei principali determinanti per l'efficienza di trasduzione è il sierotipo o la variante del vettore AAV. Attualmente, sono disponibili vari sierotipi e varianti AAV artificiali con diverse affinità con i recettori di superficie delle cellule ospiti. Per la terapia genica retinica, ciò si traduce in vari gradi di efficienza di trasduzione per diversi tipi di cellule retiniche. Inoltre, la via di iniezione e la qualità della produzione di AAV possono anche influenzare le efficienze di trasduzione AAV retinica. Pertanto, è essenziale confrontare l'efficienza di diverse varianti, lotti e metodologie. Il metodo digital droplet PCR (dd-PCR) quantifica gli acidi nucleici con elevata precisione e consente di eseguire la quantificazione assoluta di un dato target senza alcuno standard o riferimento. Utilizzando la dd-PCR, è anche possibile valutare le efficienze di trasduzione degli AAV mediante quantificazione assoluta dei numeri di copia del genoma AAV all'interno di una retina iniettata. Qui, forniamo un metodo semplice per quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nelle cellule retiniche utilizzando la dd-PCR. Con piccole modifiche, questa metodologia può anche essere la base per la quantificazione del numero di copie del DNA mitocondriale e per valutare l'efficienza dell'editing di base, fondamentale per diverse malattie della retina e applicazioni di terapia genica.

Introduzione

I virus associati all'adeno (AAV) sono ora comunemente usati per una varietà di studi di terapia genica retinica. Gli AAV forniscono un modo sicuro ed efficiente di consegna genica con meno immunogenicità e meno integrazioni del genoma. L'ingresso di AAV nella cellula bersaglio avviene attraverso l'endocitosi, che richiede il legame di recettori e co-recettori sulla superficie cellulare^1,2. Pertanto, l'efficienza di trasduzione degli AAV per diversi tipi di cellule dipende principalmente dal capside e dalle sue interazioni con i recettori delle cellule ospiti. Gli AAV hanno sierotipi e ogni sierotipo può avere tropismi cellulari / tissutali distinti ed efficienze di trasduzione. Esistono anche sierotipi e varianti AAV artificiali generati dalla modifica chimica del capside virale, dalla produzione di capsidi ibridi, dall'inserimento di peptidi, dal rimescolamento del capside, dall'evoluzione diretta e dalla mutagenesi razionale³. Anche piccoli cambiamenti nella sequenza aminoacidica o nella struttura del capside possono avere un'influenza sulle interazioni con i fattori delle cellule ospiti e provocare diversi tropismi⁴. Oltre alle varianti di capside, altri fattori come la via di iniezione e la variazione da lotto a lotto della produzione di AAV possono influenzare l'efficienza di trasduzione degli AAV nella retina neuronale. Pertanto, sono necessari metodi affidabili per il confronto dei tassi di trasduzione per diverse varianti.

La maggior parte dei metodi per determinare l'efficienza di trasduzione AAV si basa sull'espressione genica del reporter. Questi includono imaging fluorescente, immunoistochimica, western blot o analisi istochimica del prodotto del gene reporter^5,6,7. Tuttavia, a causa del vincolo dimensionale degli AAV, non è sempre possibile includere geni reporter per monitorare l'efficienza di trasduzione. L'uso di promotori forti come l'ibrido CMV enhancer/chicken beta-actin o Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) come sequenza di stabilizzatori di mRNA complica ulteriormente il problema delle dimensioni^8. Pertanto, sarà anche utile definire il tasso di trasduzione degli AAV iniettati con una metodologia più diretta.

La PCR a goccia digitale (dd-PCR) è una potente tecnica per quantificare il DNA bersaglio da piccole quantità di campioni. La tecnologia dd-PCR dipende dall'incapsulamento del DNA bersaglio e dalla miscela di reazione PCR da parte di goccioline d'olio. Ogni reazione dd-PCR contiene migliaia di goccioline. Ogni goccia viene elaborata e analizzata come reazione PCR indipendente⁹. L'analisi delle goccioline consente di calcolare il numero assoluto di copie delle molecole di DNA bersaglio in qualsiasi campione semplicemente utilizzando l'algoritmo di Poisson. Poiché l'efficienza di trasduzione degli AAV è correlata al numero di copie dei genomi AAV nella retina neuronale, abbiamo usato il metodo dd-PCR per quantificare i genomi AAV.

Qui, descriviamo una metodologia dd-PCR per calcolare l'efficienza di trasduzione di vettori AAV dal DNA genomico retinico^6,10. In primo luogo, gli AAV che esprimono il reporter tdTomato sono stati generati utilizzando il protocollo su piccola scala e titered dal metodo dd-PCR¹¹. In secondo luogo, gli AAV sono stati iniettati per via intravitreale nella retina neuronale. Per dimostrare l'efficienza di trasduzione, abbiamo prima quantificato l'espressione di tdTomato utilizzando la microscopia fluorescente e il software ImageJ. Questo è stato seguito dall'isolamento del DNA genomico per la quantificazione dei genomi AAV nelle retine iniettate utilizzando la dd-PCR. Il confronto dei livelli di espressione di tdTomato con i genomi AAV trasdotti quantificati dalla dd-PCR ha mostrato che il metodo dd-PCR ha quantificato accuratamente l'efficienza di trasduzione dei vettori AAV. I nostri protocolli hanno dimostrato una descrizione dettagliata di una metodologia basata su dd-PCR per quantificare le efficienze di trasduzione AAV. In questo protocollo, mostriamo anche il numero assoluto di genomi AAV che vengono trasdotti dopo iniezioni intravitreali semplicemente utilizzando il fattore di diluizione dopo l'isolamento del DNA genomico e i risultati della dd-PCR. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo potente, che sarebbe un'alternativa all'espressione del reporter per quantificare le efficienze di trasduzione dei vettori AAV nella retina.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati accettati dal comitato etico dell'Università Sabanci e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la dichiarazione di "The Association for Research in Vision and Ophthalmology" per l'uso di animali nella ricerca

1. Produzione AAV su piccola scala¹²

1. Colture di cellule HEK293T utilizzando piastre da 15 cm in 10 ml completi di DMEM/10% FBS fino al 70-80% di confluenza.
2. Preparare la miscela di trasfezione con 20 μg di plasmide helper (pHGT1-Adeno1), 7 μg di plasmide capside e 7 μg di vettore AAV2-CBA-tdTomato-WPRE e 136 μL di soluzione di PEI (1 mg/mL) in 5 mL di DMEM.
3. Aggiungere la miscela di trasfezione preparata da 5 mL in una capsula di coltura cellulare contenente 10 mL di terreno di coltura e incubare le cellule trasfettate per 48-60 ore a 37 °C.
4. Raccogliere il fluido a 48-60 ore dopo la trasfezione e digerirlo con DNasi I ad una concentrazione finale di 250 U/mL per 30 min a 37 °C.
5. Centrifugare il mezzo digerito a 4000 x g,4 °C per 30 minuti e quindi filtrarlo con un filtro a siringa da 0,22 μm nella membrana di cellulosa rigenerata pre-bagnata per 100 kDa.
6. Centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata a 4000 x g,4 °C per 30 min ed eliminare il mezzo.
7. Lavare e centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata con PBS contenente 0,001% Pluronic F-68 tre volte a 4000 x g,4 °C per 30 min. Scartare il PBS ad ogni passaggio.
8. Raccogliere AAV concentrati dalla parte superiore della membrana di cellulosa rigenerata e aliquota per ulteriori usi.
9. Digerire 5 μL di AAV appena fatto con DNasi I (0,2U/μl) per 15 min a 37 °C per la titolazione. Segue un'incubazione di 10 minuti a 95 °C sia per inattivare la DNasi I che per degradare i capsidi virali.
10. Preparare una diluizione seriale di 10 volte da AAV digeriti utilizzando lo 0,05% di Pluronic F-68. Utilizzare i primer AAV2-ITR e WPRE per la titolazione (Tabella 1). I titoli sono stati calcolati moltiplicando i risultati della dd-PCR con i fattori di diluizione. I risultati sono stati convertiti in copia del genoma / mL (GC / mL).
    NOTA: le concentrazioni di AAV per la produzione di AAV su piccola scala dovrebbero essere di circa 1 x 10¹² GC / mL. Questo protocollo non è applicabile per i ceppi AAV che non rilasciano in modo efficiente AAV in supporti come AAV2¹³.

2. Iniezione intravitreale di AAV

1. Preparazione dell'attrezzatura
   1. Prima di iniziare, preparare una microsiringa da 10 μL con un ago smussato da 36 G. Risciacquare cinque volte con etOH al 70%, cinque volte in ddH₂O e infine cinque volte con PBS.
   2. Caricare la quantità appropriata di AAV nella microsiringa per ogni iniezione.
   3. Preparare l'ago chirurgico (sutura, seta, 6/0), nastro, pinza e forbici.
2. Iniezione intravitreale
   1. Applicare 1 goccia di tropicamide allo 0,5% e al 2,5% di fenilefrina cloridrato (ad es. Midfrina) contenente collirio prima dell'anestesia per dilatare le pupille.
   2. Anestetizzare i topi con isoflurano 5% (1 L/min) e continuare con isoflurano all'1,5% (1 L/min) durante la procedura. Una piccola camera isoflurano viene utilizzata per la prima induzione.
   3. Verificare la profondità dell'anestesia con la perdita del riflesso di raddrizzamento, il riflesso di astinenza e la risposta al pizzico della coda.
   4. Applicare 0,3% di tobramicina e 0,1% di desametasone soluzione oftalmica sterile su ciascun occhio prima della procedura di iniezione. L'applicazione del collirio previene la secchezza ed esercita effetti antinfiammatori e antibatterici.
   5. Utilizzare il gancio chirurgico per stabilizzare la palpebra superiore. Tirare leggermente indietro per esporre la parte dorsale dell'occhio. Fissare il gancio alla panca per tenerlo in posizione.
   6. Rimuovere la congiuntiva (meno di 1 mm²) con le forbici dell'iride curva per esporre la sclera dell'occhio sotto il microscopio di dissezione. Utilizzare una siringa da insulina fresca e sterile (30 G) per perforare la sclera.
   7. Inserire l'ago della microsiringa attraverso la stessa puntura utilizzando un micromanipolatore. Posizionare la punta dell'ago dietro la lente al centro della oculare.
   8. Iniettare 1 μL di AAV2/BP2 e AAV2/PHP. Vettori S con concentrazioni di 1,63 x^{10 12} GC/mL e 1,7 x 10¹² GC/mL lentamente nel vitreo dell'occhio. Il controllo del volume di iniezione viene eseguito manualmente. Lasciare l'ago in posizione per 1 minuto e prelevare lentamente l'ago.
   9. Rilasciare la palpebra e applicare un trattamento topico anti-infiammatorio e antibatterico con gel contenente lo 0,3% di tobramicina e lo 0,1% di desametasone sul oculare. Monitorare e valutare i topi nei giorni successivi in base al foglio di punteggio in termini di aspetto (occhi luminosi, pelo curato, curvatura), comportamento (attività, immobilizzazione, automutilazione) e peso corporeo su una scala da 0 a 3. Ogni condizione ha un punteggio da 0-3 e un punteggio totale di 3 o superiore è un criterio di terminazione.
   10. Metti gli animali nella gabbia dopo il recupero.

3. Imaging a fluorescenza e fondo oculare

1. Filtrare il topo e dilatare la pupilla posizionando gocce di 0,5% di tropicamide e 2,5% di fenilefrina cloridrato in ciascun occhio.
2. Anestetizzare l'animale con la procedura di cui sopra con isoflurano. Valutare attentamente la profondità dell'anestesia pizzicando le zampe.
3. Posizionare il mouse sullo stadio di imaging e verificare la corretta dilatazione controllando attraverso la fotocamera del fondo oculare. Applicare gel topico (0,2% carbomer 980) sulla superficie degli occhi per proteggere gli occhi dalla disidratazione in anestesia e per utilizzarlo come gel di accoppiamento per l'imaging.
4. Manipolare la fase di imaging per allinearla con il nasello dell'obiettivo. Regolare lo stage in base alle esigenze per centrare l'occhio del mouse. Una volta che l'occhio è centrato, sposta lentamente l'obiettivo fino a quando non entra in contatto con l'occhio.
5. Eseguire l'imaging del fondo e della fluorescenza su entrambi gli occhi per seguire l'espressione di tdTomato a 1 settimana e 2 settimane dopo l'iniezione intravitreale (Figura 3B)¹⁴. Prendi immagini di fondo e fluorescenza con impostazioni identiche per il confronto dell'espressione del reporter.

4. Isolamento della retina

1. Eutanasia degli animali dopo l'imaging del fondo e della fluorescenza mediante inalazione di CO₂ per la raccolta della retina a 2 settimane di tempo.
2. Sposta il bulbo oculare in avanti con l'aiuto di una pinza splitter da 13,5 cm.
3. Rimuovere la lente insieme al vitreo rimanente applicando una leggera pressione con la pinza.
4. Tagliare la connessione del bulbo oculare al nervo ottico con pinze curve di precisione e spremere delicatamente la retina con la stessa pinza curva.
5. Trasferire le retine sezionate in un tubo di microcentrifuga.
6. Snap congelare la retina posizionando i tubi nell'azoto liquido.

5. Isolamento del DNA genomico tissutale

1. Isolare il DNA genomico con un kit di DNA genomico tissutale basato sulla digestione della proteinasi K commercializzato.
2. Digerire la retina a 55 °C, 200 x g per 30 minuti con la Proteinasi K, già fornita nel kit.
3. Eseguire la fase di incubazione della RNasi, le fasi di lavaggio con tampone di lavaggio I e II e infine la fase di eluizione secondo il protocollo del produttore.
4. Aggiungere un ulteriore passaggio di centrifuga dopo l'ultimo lavaggio per rimuovere l'etanolo residuo.
5. Misurare la concentrazione di DNA genomico e conservare i campioni a -20 °C.

6. Analisi PCR digitale a goccia di campioni di retina di topo per la quantificazione dei genomi virali

1. Diluire i DNA genomici dalle retine iniettate in soluzione di F-68 pluronico allo 0,05% per raggiungere una concentrazione finale di 1 ng/μL per ciascun campione.
2. Eseguire reazioni separate per WPRE e 18S utilizzando primer specifici target con una concentrazione finale di 125 nM per ciascun primer.
3. Eseguire la generazione di goccioline in un mix di reazione PCR da 20 μL, tra cui 1 ng di DNA genomico, 125 nM primer e 2x evagreen supermix.
4. Caricare la miscela di campioni nella parte centrale della cartuccia per la generazione di goccioline.
5. Dopo aver effettuato il caricamento del campione sulla cartuccia, aggiungere 70 μL di olio di generazione di gocce nella fila inferiore della cartuccia.
6. Mettere la guarnizione sopra la cartuccia e posizionarla nel generatore di gocce. Assicurarsi che non vi sia spazio tra la guarnizione e la cartuccia.
7. Prelevare delicatamente circa 40 μL di goccioline che vengono generate nel pozzetto superiore. Aggiungere la soluzione di goccioline alla piastra di reazione PCR semi-gonna a 96 pozzetti.
8. Sigillare la piastra PCR con il sigillante a piastre PCR utilizzando un foglio di tenuta in alluminio.
9. Posizionare la piastra PCR in un termociclatore termosaldato a 96 pozzetti. Utilizzare il protocollo PCR; 95 °C per 5 min, 40 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 1 min, 4 °C per 5 min, 90 °C per 5 min e 4 °C di tenuta infinita. Applicare una velocità di rampa di 2 °C/s ad ogni ciclo per garantire che le goccioline raggiungano la temperatura corretta per ogni passo durante il ciclo
10. Posizionare la piastra PCR nel lettore di gocce per quantificare le goccioline utilizzando il software dd-PCR. Un modello viene configurato utilizzando impostazioni specifiche per evagreen.
11. Analizza i dati utilizzando un grafico grafico 1D con ciascun campione per l'intensità di fluorescenza rispetto al numero di goccioline. Il valore di soglia è disposto in modo che le goccioline sopra la soglia siano assegnate come positive e quelle inferiori come negative. Segue l'applicazione dell'algoritmo di Poisson per determinare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio in unità di copie/μL. Il rapporto tra WPRE e 18S viene calcolato per misurare l'efficienza di trasduzione AAV.

Risultati

La produzione di AAV su piccola scala è un metodo veloce ed efficiente che fornisce vettori per iniezioni intravitreali (Figura 1). La produzione di AAV su piccola scala di solito fornisce titoli nell'intervallo 1 x 10¹² GC / ml che è sufficiente per rilevare l'espressione del reporter nella retina (Figura 2). Il titering di AAV utilizzando dd-PCR dà risultati coerenti. I primer specifici ITR2 e WPRE vengono utilizzati di routine e la concentrazion...

Discussione

In questo protocollo, abbiamo generato due vettori AAV che hanno diverse proteine del capside e poi li abbiamo titolati di conseguenza. Uno dei passaggi più cruciali di questo protocollo è quello di produrre quantità sufficienti di AAV che produrranno un'espressione reporter rilevabile dopo la trasduzione^12,13.

Il titering degli AAV è anche un fattore importante per regolare i dosaggi di AAV per le iniezioni intravitreali. Una v...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates	BioRad	12001925	ddPCR
Amicon Filter	Millipore	UFC910096	AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS	BioRad	1851197	ddPCR
C57BL/6JRj mice strain	Janvier	C57BL/6JRj	Mice
DG8 gaskets	BioRad	1863009	ddPCR
DG8 Cartridges	BioRad	1864008	ddPCR
DMEM	Lonza	BE12-604Q	AAV
DPBS	PAN BIOTECH	L 1825	AAV
Droplet generation oil eva green	BioRad	1864006	ddPCR
Droplet reader oil	BioRad	1863004	ddPCR
FBS	PAN BIOTECH	p30-3306	AAV
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer	BioRad	1814040	ddPCR
Insulin Syringes	BD Medical	320933	Intravitreal injection
Isoflurane	ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET	N01AB06	anesthetic
Microinjector MM33	World Precision Instruments	82-42-101-0000	Intravitreal injection
Micron IV	Phoenix Research Labs	Micron IV	Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)	Alcon	S01FB01	pupil dilation
Nanofil Syringe 10 μl	World Precision Instruments	NANOFIL	Intravitreal injection
Needle RN G36, 25 mm, PST 2	World Precision Instruments	NF36BL-2	Intravitreal injection
PEI-MAX	Polyscience	24765-1	AAV
Penicillin-Streptomycin	PAN BIOTECH	P06-07100	AAV
Plasmid pHGT1-Adeno1	PlasmidFactory	PF1236	AAV
Pluronic F-68	Gibco	24040032	AAV
PX1 PCR Plate Sealer system	BioRad	1814000	ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	BioRad	1864034	ddPCR
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator	BioRad	1864001	ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM	endostall medical	EJN-160-0155	Retina isolation
Steril Syringe Filter	AISIMO	ASF33PS22S	AAV
Tissue Genomic DNA Kit	EcoSpin	E1070	gDNA isolation
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)	Alcon	S01CA01	anti-inflammatory / antibiotic
Tropamid (% 0.5 tropicamide)	Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.	S01FA06	pupil dilation
Turbonuclease	Accelagen	N0103L	AAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g)	Bausch+Lomb	S01XA20	lubricant eye drop