뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

요약

이 프로토콜은 작은 규모의 AAV 생산, 인트라비탈 주사, 망막 이미징 및 망막 게놈 DNA 격리와 함께 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환 효율을 정량화하는 방법을 제시합니다.

초록

많은 망막 세포 생물학 실험실은 지금 일상적으로 유전자 편집 및 규제 응용을 위해 Adeno 관련 바이러스 (AAV)를 이용합니다. AAV 트랜스듀션의 효율성은 일반적으로 중요하며, 이는 전반적인 실험 결과에 영향을 미칩니다. 트랜스듀션 효율을 위한 주요 결정요인 중 하나는 AAV 벡터의 혈청형 또는 변형이다. 현재, 다양한 인공 AAV 혈청형 및 변이체는 세포 표면 수용체를 호스트하기 위해 상이한 친화력으로 사용할 수 있다. 망막 유전자 치료를 위해, 이것은 다른 망막 세포 모형을 위한 transction 효율성의 다양한 정도에서 초래합니다. 또한, 사출 경로 및 AAV 생산의 품질은 또한 망막 AAV 변환 효율성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 다양한 변형, 배치 및 방법론의 효율성을 비교하는 것이 필수적입니다. 디지털 물방울 PCR(dd-PCR) 방법은 핵산을 고정밀으로 정량화하고 표준이나 기준 없이 주어진 표적의 절대 정량화를 수행할 수 있게 한다. dd-PCR을 사용하면 주입된 망막 내에서 AAV 게놈 카피 번호를 절대적인 정량화하여 AAV의 트랜스듀션 효율성을 평가하는 것도 가능하다. 여기서, 우리는 dd-PCR를 사용하여 망막 세포에서 AAV의 변환 속도를 정량화하는 간단한 방법을 제공합니다. 사소한 수정으로, 이 방법론은 또한 미토콘드리아 DNA의 복사 수 정량화뿐만 아니라 여러 망막 질환 및 유전자 치료 응용 프로그램에 중요한 기본 편집의 효율성을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.

서문

Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 지금 일반적으로 망막 유전자 치료 연구의 각종을 위해 이용됩니다. AAV는 면역genicity및 적은 게놈 통합을 가진 유전자 전달의 안전하고 효율적인 방법을 제공합니다. 표적 세포로의 AAV 진입은 세포 표면^1,2에수용체 및 공동 수용체의 결합을 요구하는 내분비증을 통해 발생합니다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 AAV의 변환 효율은 주로 캡시드 및 숙주 세포 수용체와의 상호 작용에 달려 있다. AAV는 혈청형을 가지고 있으며 각 혈청형은 뚜렷한 세포/조직 트로피즘과 전관 효율을 가질 수 있습니다. 또한 바이러스 캡시드의 화학적 변형, 하이브리드 캡시드 생산, 펩타이드 삽입, 캡시드 셔플, 지향진화, 합리적 돌연변이발생^3의화학적 변형에 의해 생성된 인공 AAV 혈청형 및 변이체도 있다. 아미노산 서열 또는 캡시드 구조의 사소한 변화조차도 숙주 세포 인자와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며 다른 트로피4를 초래할 수 있다. 캡시드 변이체 외에도, AAV 생산의 사출 경로 및 배치 간 변화와 같은 다른 요인은 신경 망막에서 AAV의 변환 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 다른 변종에 대한 변환 속도의 비교를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다.

AAV 트랜스듀션 효율을 결정하는 대부분의 방법은 리포터 유전자 발현에 의존한다. 이들은 리포터 유전자^생성물의형광 화상 진찰, 면역히스토케, 서양 얼룩, 또는 화학적 분석을^포함5,6,7. 그러나, AAV의 크기 제약으로 인해, 트랜스듀션 효율을 모니터링하기 위해 기자 유전자를 포함하는 것이 항상 가능하지는 않다. mRNA 안정기 서열로서 하이브리드 CMV 증강제/닭 베타-액틴 또는 우드척 형 간염 조절 원소(WPRE)와 같은 강력한 프로모터를 사용하면 크기 문제를 더욱 복잡하게 만든다^8. 따라서 보다 직접적인 방법론으로 주입된 AAV의 트랜스듀션 속도를 정의하는 것도 도움이 될 것이다.

디지털 물방울 PCR (dd-PCR)은 미세한 양의 샘플에서 표적 DNA를 정량화하는 강력한 기술입니다. dd-PCR 기술은 오일 방울에 의한 표적 DNA 및 PCR 반응 혼합물의 캡슐화에 의존한다. 각 dd-PCR 반응에는 수천 개의 물방울이 포함되어 있습니다. 각 액적은 독립적인 PCR 반응^9로처리되고 분석된다. 물방울의 분석은 푸아송 알고리즘을 사용하여 모든 샘플에서 표적 DNA 분자의 절대 복사 수를 계산할 수 있습니다. AAV의 트랜스듀션 효율은 뉴런 망막에서 AAV 게놈의 카피 수와 상관관계가 있기 때문에 DD-PCR 방법을 사용하여 AAV 게놈을 정량화했습니다.

여기서, 우리는 망막 게놈 DNA^{6,10로부터}AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 계산하기 위해 dd-PCR 방법론을 설명한다. 먼저, tdTomato 리포터를 표현하는 AAV는 소규모 프로토콜을 사용하여 생성되었고, dd-PCR^{방법(11)에}의해 적발되었다. 둘째, AAV는 신경 망막에 주입되었습니다. 트랜스듀션 효율을 입증하기 위해, 우리는 먼저 형광 현미경 검사법과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 tdTomato 발현을 정량화했습니다. 이것은 dd-PCR를 사용하여 주입된 망막에 있는 AAV 게놈의 정량화를 위한 게놈 DNA의 격리에 선행되었습니다. dd-PCR에 의해 정량화된 변환된 AAV 게놈과 tdTomato 발현 수준을 비교한 결과 dd-PCR 방법은 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 정확하게 정량화한 것으로 나타났다. 당사의 프로토콜은 AAV 변환 효율성을 정량화하기 위해 dd-PCR 기반 방법론에 대한 자세한 설명을 보여 주어. 이 프로토콜에서, 우리는 또한 단순히 게놈 DNA 격리 및 dd-PCR 결과 후에 희석 인자를 사용하여 인트라비티리얼 주사 후에 유도되는 AAV 게놈의 절대 수를 보여줍니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 망막에서 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율성을 정량화하기 위한 기자 표현의 대안이 될 강력한 방법을 제공한다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 사반치 대학 윤리위원회에 의해 받아들여졌으며 연구에 동물을 사용하기위한 '비전 및 안과 연구 협회'의 성명에 따라 실험을 수행했습니다.

1. 소규모 AAV 생산¹²

1. 문화 HEK293T 세포는 DMEM/10% FBS의 완전한 10mL에서 15cm 플레이트를 사용하여 70-80% 수렴성까지.
2. 도우미 플라스미드(pHGT1-Adeno1), 캡시드 플라스미드 7μg, AAV2-CBA-tdTomato-WPRE 벡터 7μg, 5mL의 PEI 용액 136μL(1 mg/mL)로 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다.
3. 5mL 준비된 형질혼합물을 배양 배지 10mL를 함유한 세포 배양접시에 넣고 37°C에서 48-60h의 전감염된 세포를 배양한다.
4. 48-60 h에서 미디어를 수집하고 37 °C에서 30 분 동안 250 U / mL의 최종 농도에서 DNase I로 소화하십시오.
5. 소화된 매체를 4000 x g,4°C에서 30분 동안 원심분리한 다음 0.22 μm 주사기 필터로 100kDa의 미리 습식 재생셀룰로오스 멤브레인에 걸레로 넣습니다.
6. 원심분리기는 4000 x g,4°C에서 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 30분 동안 제거하고 미디어를 폐기한다.
7. PBS로 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 세척 및 원심분리하여 4000 x g에서3회, 4°C에서 30분 동안 0.001% 플루론 F-68을 함유한다. 각 단계에서 PBS를 폐기합니다.
8. 재생된 셀룰로오스 멤브레인의 상부에서 농축 된 AAV를 수집하고 추가 용도로 사용할 수 있습니다.
9. DNase I (0.2U/μl)로 갓 만든 AAV의 5 μL을 37 °C에서 15 분 동안 소화하십시오. 이것은 DNase I를 비활성화하고 바이러스 성 capsids를 저하 둘 다에 대한 95 °C 인큐베이션에서 10 분 뒤에.
10. 0.05% 플루론 F-68을 사용하여 소화된 AAV에서 10배 의 직렬 희석을 준비합니다. 적정(표 1)에대한 AAV2-ITR 및 WPRE 프라이머를 사용합니다. 티터는 희석 계수와 함께 dd-PCR 결과를 곱하여 계산했습니다. 결과는 게놈 카피/mL(GC/mL)으로 변환되었다.
    참고: 소규모 AAV 생산을 위한 AAV 농도는 약 1 x 10¹² GC/mL일 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜은 AAV2^13과같은 미디어로 AAV를 효율적으로 방출하지 않는 AAV 균주에는 적용되지 않습니다.

2. AAV의 인트라비티리얼 주입

1. 장비 준비
   1. 시작하기 전에 36 G 무딘 바늘로 10 μL 현미경 을 준비하십시오. 5회 70%의 EtOH, ddH₂O에서 5회, 그리고 PBS로 5번 을 기록했다.
   2. 각 주사에 대한 현미경 주사에 AAV의 적절한 금액을로드합니다.
   3. 수술 바늘 (봉합사, 실크, 6/0), 테이프, 집게 및 가위를 준비합니다.
2. 인트라비티리얼 주입
   1. 1방울의 열대지방과 2.5% 페닐레프린 염산염(예: 마이드프린)을 발라 마취 전에 눈방울을 함유하여 동공을 증식합니다.
   2. 이소플루란5%(1 L/분)를 가진 마우스를 마취하고 시술 도중 1.5% 이소플루란 (1 L/min)으로 계속합니다. 작은 이소플루란 챔버는 첫 번째 유도에 사용됩니다.
   3. 오른쪽 반사, 철수 반사 및 꼬리 핀치 응답의 손실에 의해 마취의 깊이를 확인합니다.
   4. 주입 시술 전에 각 눈에 0.3%의 토브라마이신과 0.1% 덱사메타손 멸균 안과 용액을 적용하십시오. 안약의 적용은 건조를 방지하고 항염증 및 항균 효과를 발휘합니다.
   5. 수술 후크를 사용하여 눈꺼풀 상부를 안정화시하십시오. 눈의 등대 부분을 노출시키기 위해 약간 뒤로 당깁니다. 후크를 벤치에 테이프로 테이프로 고정합니다.
   6. 해부 현미경하에서 눈의 경각증을 노출하기 위해 곡선홍채 가위로 결막(1mm^{미만 2)}제거합니다. 신선하고 멸균된 인슐린 주사기(30G)를 사용하여 clera를 뚫습니다.
   7. 미세 조작기를 사용하여 동일한 구멍을 통해 현미경의 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝을 렌즈 뒤에 안구 중간에 놓습니다.
   8. AAV2/BP2 및 AAV2/PHP의 1 μL을 주입합니다. 1.63 x 10¹² GC/mL 및 1.7 x 10¹² GC/mL 농도를 갖는 S 벡터는 눈의 유리체속으로 천천히 들어간다. 사출 볼륨 제어는 수동으로 수행됩니다. 바늘을 1 분 동안 제자리에 두고 천천히 바늘을 철회하십시오.
   9. 눈꺼풀을 풀어 서 서 항 염증 및 항균 국 소 젤 치료를 적용 하 여 0.3% 토브라마이신과 0.1% 덱사메타손 안구에. 외형(밝은 눈, 손질된 외투, 구칭), 동작(활동, 고정화, 자기 절단), 체중 0~3의 관점에서 점수시트에 따라 다음 날에 마우스를 모니터링하고 평가한다. 각 조건은 0-3의 점수를 가지며 총 점수는 3 이상이며 종료 기준입니다.
   10. 복구 후 동물을 케이지에 놓습니다.

3. 형광 및 기금 이미징

1. 마우스를 변형시키고 각 눈에 0.5% 열대지방과 2.5%의 페닐프린 염산염을 배치하여 동공을 팽창시다.
2. 이소플루란과 위의 절차로 동물을 마취시화합니다. 발을 꼬집어 마취의 깊이를 신중하게 평가합니다.
3. 이미징 단계에 마우스를 놓고 fundus 카메라를 통해 확인하여 적절한 팽창을 확인합니다. 마취 하에서 탈수로부터 눈을 보호하고 이미징을위한 커플링 젤로 사용하기 위해 눈 표면에 국소 젤 (0.2 % 카보머 980)을 적용하십시오.
4. 이미징 스테이지를 조작하여 목표의 코피스와 정렬합니다. 필요에 따라 스테이지를 조정하여 마우스 눈을 중심으로 합니다. 눈이 중심이 되면 눈과 접촉할 때까지 천천히 목표를 이동합니다.
5. 두 눈에 fundus 및 형광 이미징을 수행하여 인트라비티리얼 주사 후 1주 및 2주에 tdTomato 발현을 추적한다(그림3B)^14. 기자 표현의 비교를 위해 동일한 설정에서 fundus 및 형광 이미지를 가져 가라.

4. 망막 고립

1. 2주 시점에서 망막 수집을 위한 CO₂ 흡입에 의한 fundus 및 형광 화상 진찰 후에 동물을 안락사시합니다.
2. 13.5cm 스플리터 집게의 도움으로 안구를 앞으로 이동합니다.
3. 집게로 부드러운 압력을 가하여 남은 유리체와 함께 렌즈를 제거합니다.
4. 정밀 곡선 집게로 안구의 연결을 시신경과 잘라내고 동일한 곡선 포셉으로 망막을 부드럽게 짜냅니다.
5. 해부된 망막을 미세 원심 분리 튜브로 옮기.
6. 액체 질소에 튜브를 배치하여 망막을 스냅합니다.

5. 조직 유전체 DNA 격리

1. 상용화된 Proteinase K 소화 기반 조직 게놈 DNA 키트로 게놈 DNA를 분리한다.
2. 55°C에서 망막, 30분 동안 200 x g의 다이제스트 망막이 이미 키트에 공급되고 있습니다.
3. RNase 인큐베이션 단계를 수행하고, 세척 버퍼 I 및 II로 단계를 세척하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 마지막으로 용출 단계를 수행합니다.
4. 마지막 세척 후 추가 스핀 스텝을 추가하여 잔류 에탄올을 제거합니다.
5. 유전체 DNA의 농도를 측정하고 샘플을 -20°C에서 저장합니다.

6. 바이러스 게놈의 정량화를 위한 마우스 망막 견본의 물방울 디지털 PCR 분석

1. 주입된 망막에서 유전체 DN을 0.05% 플루론 F-68 용액으로 희석하여 각 시료에 대해 1 ng/μL의 최종 농도에 도달합니다.
2. 각 프라이머에 대해 125nM의 최종 농도를 가진 표적 특정 프라이머를 사용하여 WPRE 및 18S에 대해 별도의 반응을 수행한다.
3. 게놈 DNA 1ng, 125 nM 프라이머 및 2배 회피녹색 슈퍼믹스를 포함한 PCR 반응 믹스의 20 μL에서 액적 생성을 수행합니다.
4. 물방울 생성을 위해 카트리지의 중간 부분에 샘플 믹스를 로드합니다.
5. 카트리지에 샘플 로딩이 완료된 후, 카트리지의 아래쪽 행에 액적 생성 오일의 70 μL을 추가합니다.
6. 개스킷을 카트리지 위에 올려 놓고 물방울 발생기에 넣습니다. 개스킷과 카트리지 사이에 간격이 없는지 확인합니다.
7. 상단에서 잘 생성되는 약 40 μL의 물방울을 부드럽게 가져 가십시오. 세미 스커트 96웰 PCR 반응 플레이트에 액적 용액을 추가합니다.
8. 알루미늄 밀봉 호일을 사용하여 PCR 플레이트 실러로 PCR 플레이트를 밀봉하십시오.
9. PCR 플레이트를 96웰의 열 밀봉 열 사이클러에 넣습니다. PCR 프로토콜을 사용; 95°C 5분, 30초 동안 95°C40사이클, 1분 동안 60°C, 5분 동안 4°C, 5분 동안 90°C, 4°C의 무한홀드. 각 사이클에 2°C/s 경사로 속도를 적용하여 소적이 사이클링 중 각 단계에 대해 올바른 온도에 도달할 수 있도록 합니다.
10. DD-PCR 소프트웨어를 사용하여 액적 을 정량화하기 위해 PCR 플레이트를 방울 판독기에 배치합니다. 템플릿은 회피에 대한 특정 설정을 사용하여 설정됩니다.
11. 형광 강도 대 액적 수에 대한 각 표본과 함께 1 차원 플롯 그래프를 사용하여 데이터를 분석합니다. 임계값은 임계값 위의 액수가 양수로 할당되고 아래 액수가 음수로 할당되도록 정렬됩니다. 이어서 푸아송 알고리즘을 적용하여 사본/μL 단위로 표적 DNA의 시작 농도를 결정한다. WPRE 대 18S의 비율은 AAV 트랜스듀션 효율을 측정하기 위해 계산됩니다.

결과

소규모 AAV 생산은 인트라비리얼주사(도 1)에대한 벡터를 제공하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 소규모 AAV 생산은 일반적으로 망막에서 리포터 발현을 감지하기에 충분한 1 x^{10 12} GC/ml 범위 내에서 티터를 제공한다(도2). dd-PCR을 사용하여 AAV를 사용하면 일관된 결과가 생성됩니다. ITR2 및 WPRE 특이적 프라이머는 정기적으로 사용되고 각 표적 분자...

토론

이 프로토콜에서, 우리는 다른 capsid 단백질을 가진 2개의 AAV 벡터를 생성하고 그에 따라 그(것)들을 titered. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 변환^12,13후에 감지 가능한 리포터 발현을 산출하는 충분한 양의 AAV를 생성하는 것입니다.

AAV의 Titering 또한 intravitreal 주사에 대 한 AAV의 복용량을 조정 하는 중요 한 요소. 이러한 중?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates	BioRad	12001925	ddPCR
Amicon Filter	Millipore	UFC910096	AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS	BioRad	1851197	ddPCR
C57BL/6JRj mice strain	Janvier	C57BL/6JRj	Mice
DG8 gaskets	BioRad	1863009	ddPCR
DG8 Cartridges	BioRad	1864008	ddPCR
DMEM	Lonza	BE12-604Q	AAV
DPBS	PAN BIOTECH	L 1825	AAV
Droplet generation oil eva green	BioRad	1864006	ddPCR
Droplet reader oil	BioRad	1863004	ddPCR
FBS	PAN BIOTECH	p30-3306	AAV
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer	BioRad	1814040	ddPCR
Insulin Syringes	BD Medical	320933	Intravitreal injection
Isoflurane	ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET	N01AB06	anesthetic
Microinjector MM33	World Precision Instruments	82-42-101-0000	Intravitreal injection
Micron IV	Phoenix Research Labs	Micron IV	Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)	Alcon	S01FB01	pupil dilation
Nanofil Syringe 10 μl	World Precision Instruments	NANOFIL	Intravitreal injection
Needle RN G36, 25 mm, PST 2	World Precision Instruments	NF36BL-2	Intravitreal injection
PEI-MAX	Polyscience	24765-1	AAV
Penicillin-Streptomycin	PAN BIOTECH	P06-07100	AAV
Plasmid pHGT1-Adeno1	PlasmidFactory	PF1236	AAV
Pluronic F-68	Gibco	24040032	AAV
PX1 PCR Plate Sealer system	BioRad	1814000	ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	BioRad	1864034	ddPCR
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator	BioRad	1864001	ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM	endostall medical	EJN-160-0155	Retina isolation
Steril Syringe Filter	AISIMO	ASF33PS22S	AAV
Tissue Genomic DNA Kit	EcoSpin	E1070	gDNA isolation
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)	Alcon	S01CA01	anti-inflammatory / antibiotic
Tropamid (% 0.5 tropicamide)	Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.	S01FA06	pupil dilation
Turbonuclease	Accelagen	N0103L	AAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g)	Bausch+Lomb	S01XA20	lubricant eye drop