Tomografia optoacustica multispettrale per l'imaging funzionale nella ricerca vascolare

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'acquisizione di immagini optoacustiche multispettrali di vascolarizzazione cutanea umana in vivo . Questi includono la quantificazione dell'emoglobina e della melanina, considerati cromofori di interesse per l'analisi funzionale.

Abstract

La compromissione del microcircolo è stata riconosciuta in vari processi patologici, alla base di questo tema crescente all'interno della ricerca vascolare. Negli ultimi anni, lo sviluppo di sistemi di live imaging ha impostato il ritmo (analitico) sia nella ricerca di base che clinica, con l'obiettivo di creare nuovi strumenti in grado di fornire endpoint quantificabili in tempo reale con interesse clinico e applicazione. La spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS), la tomografia ad emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata (CT) e la risonanza magnetica (MRI) sono disponibili, tra le altre tecniche, ma costo, risoluzione dell'immagine e contrasto ridotto sono riconosciuti come sfide comuni. La tomografia optoacustica (OT) offre una nuova prospettiva sull'imaging funzionale vascolare, combinando capacità di assorbimento ottico e risoluzione spaziale all'avanguardia (dalla risoluzione acustica micrometrica alla risoluzione acustica millimetrica) con la profondità del tessuto. In questo studio, abbiamo testato l'applicabilità della tomografia optoacustica multispettrale (MSOT) per l'imaging funzionale. Il sistema utilizza un oscillatore ottico parametrico sintonizzabile (OPO) pompato da un laser Nd: YAG, che fornisce impulsi di eccitazione rilevati da una sonda 3D a lunghezze d'onda da 680 nm a 980 nm. Le immagini ottenute dall'avambraccio umano sono state ricostruite attraverso uno specifico algoritmo (fornito all'interno del software del produttore) basato sulla risposta di specifici cromofori. L'emoglobina ossigenata massima (Max HbO 2) e l'emoglobina deossigenata (Max Hb), l'emoglobina totale (HbT) e la saturazione media di ossigeno (mSO₂) alla densità vascolare (μVu), le distanze medie interunitarie (ζAd) e il volume ematico capillare (mm³) possono essere misurati utilizzando questo sistema. Il potenziale di applicabilità trovato con questo sistema OT è rilevante. Gli sviluppi software in corso miglioreranno sicuramente l'utilità di questo sistema di imaging.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari sono le principali cause ricorrenti di morte in tutto il mondo e rappresentano un onere enorme per qualsiasi sistema sanitario ^1,2. La tecnologia ha contribuito in modo determinante all'espansione della nostra comprensione della fisiopatologia cardiaca e vascolare fondamentale, fornendo strumenti diagnostici più precisi e la possibilità di una diagnosi precoce della malattia e di una gestione più efficace. Le tecniche di imaging offrono la possibilità di misurare non solo le prestazioni cardiache e dei vasi maggiori, ma anche, su scala molto più piccola, di calcolare la densità capillare, la perfusione locale e il volume e la disfunzione endoteliale, tra le altre caratteristiche. Queste tecnologie hanno offerto le prime intuizioni quantitative sulla biologia vascolare con applicazione clinica diretta. I cambiamenti nella densità capillare, la riduzione della perfusione locale o l'occlusione corrispondono probabilmente a una condizione ischemica, che aiuta a spiegare il ruolo crescente dell'imaging, diventando uno strumento indispensabile nella ricerca e nella pratica cardiovascolare ^3,4,5.

Negli ultimi anni, l'imaging funzionale ha costantemente dettato il passo nell'innovazione tecnologica, con la spettroscopia a ultrasuoni (US) nel vicino infrarosso (NIRS), la tomografia ad emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata (CT) e la risonanza magnetica (MRI) come alcuni esempi ben noti. Tuttavia, molteplici preoccupazioni limitano la loro applicazione, dal costo e dalla sicurezza del paziente (nonché dal comfort) al contrasto dell'immagine e alla risoluzione ^6,7. La tomografia optoacustica (OT) è recentemente emersa come una nuova direzione nella ricerca vascolare basata sull'ottica. Questa tecnologia, incentrata sulla rilevazione di onde ultrasoniche generate dall'espansione termoelastica del tessuto impattato con impulsi laser ultracorti, è nota da tempo ^6,8. Questa reazione fisica di sviluppo del calore e di espansione tissutale evoca un segnale acustico rilevato da un trasduttore ad ultrasuoni. L'uso di impulsi di luce dal visibile al vicino infrarosso e l'assenza di un segnale acustico di fondo favoriscono la profondità di risoluzione. Il contrasto rilevato deriva dai cromofori più importanti presenti (emoglobina o melanina). Rispetto ad altre tecnologie, OT ha i vantaggi di (1) non aver bisogno di contrasto (imaging label-free), (2) contrasto e risoluzione migliori con meno artefatti rispetto all'ecografia e (3) prezzo inferiore e acquisizione più rapida e facilità d'uso 6,9,10,11.

La tomografia optoacustica multispettrale (MSOT) è tra gli strumenti OT di più recente generazione. Costruita con un oscillatore parametrico ottico sintonizzabile (OPO) pompato da un laser Nd: YAG che fornisce impulsi di eccitazione, un'immagine 3D viene acquisita da segnali risolti nel tempo rilevati da impulsi di eccitazione ultrasonica ad alta frequenza a lunghezze d'onda da 680 nm a 980 nm con una frequenza di ripetizione fino a 50 Hz¹². La piattaforma di imaging optoacustico fornisce la quantificazione di diversi cromofori in profondità (fino a 15 mm). Variabili come HbO₂, Hb e melanina sono facilmente accessibili. Sono disponibili anche altre variabili di interesse, come l'emoglobina ossigenata massimale (Max HbO₂) e l'emoglobina deossigenata (Max Hb). Gli algoritmi di ricostruzione del software del produttore consentono il calcolo di altre variabili come la densità vascolare (μVu), la distanza media tra unità (ζAd) e il volume capillare (mm³).

Il presente studio esplora gli aspetti operativi essenziali di questo nuovo sistema per comprendere meglio i suoi aspetti pratici e le potenziali applicazioni nella ricerca preclinica cardiovascolare.

Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato precedentemente approvato dal Comitato Etico della Scuola di Scienze della Salute dell'Università (EC. ECTS/P10.21). Procedure pienamente rispettate dei principi di buona pratica clinica definiti per la ricerca sull'uomo¹³. Un campione conveniente di sei partecipanti sani di entrambi i sessi (n = 3 per sesso) con un'età media di 32,8 ± 11,9 anni è stato scelto dalla comunità universitaria. I partecipanti selezionati dovevano essere normotensi, non fumatori e privi di qualsiasi farmaco o integrazione alimentare. Sono stati registrati anche la pressione sanguigna, la frequenza cardiaca e l'indice di massa corporea. Tutti i partecipanti sono stati precedentemente informati degli obiettivi e della durata dello studio e hanno fornito il consenso scritto informato.

NOTA: Questo studio è stato eseguito utilizzando MSOTAcuity (vedi Tabella dei materiali), d'ora in poi indicato come piattaforma di imaging optoacustico.

1. Preparazione per l'acquisizione

NOTA: nella descrizione sperimentale che segue, i comandi dello schermo sono in grassetto.

1. Caricamento delle informazioni sul soggetto: accendere l'apparecchiatura di imaging optoacustico. Mentre l'attrezzatura si sta riscaldando, introdurre le informazioni sui partecipanti. La finestra di benvenuto principale del software si apre sulla panoramica della scansione. Introdurre i dati (inclusi nome, denominazione dello studio, dati personali e qualsiasi osservazione pertinente) dopo aver fatto clic su ID paziente e completare l'applicazione premendo Seleziona.
2. Selezione preimpostata: assicurarsi che il messaggio Laser is Ready appaia sullo schermo dell'apparecchiatura. Dopo il tempo di riscaldamento, la barra di stato del laser sullo schermo dell'apparecchiatura deve cambiare da Laser Standby a Laser is Ready. Per questo protocollo, il preset è progettato per cromofori Hb, HbO₂ e melanina. Dopo aver selezionato il preset corretto, verrà testata la potenza del laser.
3. A questo punto, assicurati che ci sia un messaggio sullo schermo che ricordi a tutti i partecipanti nella stanza di applicare i google di sicurezza laser. Premere il pedale dell'interruttore laser (alimentazione) e attendere l'autocontrollo della potenza laser. Dopo alcuni secondi, viene visualizzata una finestra con lo stato laser corrente con un rapporto di controllo. Rilasciare questa finestra premendo il pulsante OK disponibile.
   NOTA: La piattaforma di imaging optoacustico utilizza un laser Nd:YAG, considerato un laser di classe 4 particolarmente pericoloso per l'occhio umano. Pertanto, questo laser deve essere maneggiato con cura adeguata.
   ATTENZIONE: Nessuna acquisizione dovrebbe avvenire senza garantire che tutte le procedure di sicurezza, compresa un'adeguata protezione degli occhi, siano in atto.

2. Posizionamento e acquisizione di immagini

1. Acclimatare il partecipante all'ambiente di laboratorio (21 °C ± 1 °C; 40% -60% di umidità relativa), scegliendo una posizione comoda per ridurre al minimo i movimenti non necessari. Assicurarsi che l'area da scansionare sia stata precedentemente pulita.
   NOTA: si raccomanda la raccomandazione del produttore di pulire l'area da visualizzare con una soluzione di etanolo / acqua al 70%. Inoltre, per una migliore acquisizione dell'immagine, si consiglia la rimozione dei peli (quando applicabile).
2. Portasonda e stabilizzazione dell'immagine
   1. Applicare un sottile strato di gel ad ultrasuoni sulla tazza 3D. La stabilizzazione dell'immagine richiede di tenere la tazza 3D nella posizione di imaging desiderata. Posizionare e stabilizzare un braccio bloccabile per l'area di interesse. Il braccio utilizzato in questo studio è stato progettato internamente e costruito con componenti profilati in alluminio (Figura 1).
   2. Dopo aver posizionato la tazza 3D sull'area di interesse, bloccare parzialmente il blocco del braccio stabilizzatore per l'acquisizione delle immagini.
      NOTA: La qualità e l'applicazione uniforme del gel ad ultrasuoni è fondamentale; La presenza di bolle d'aria può compromettere la definizione dell'immagine.
3. Acquisizione di immagini per condizioni dinamiche, utilizzando la manovra di iperemia reattiva post-occlusiva (PORH), nella scheda del menu Esame .
   1. Acquisire la scansione del controllo di base. Dopo aver trovato un campo visivo per l'imaging, con il bracciale della pressione sanguigna sgonfio in posizione, bloccare saldamente il braccio di posizionamento della tazza 3D.
   2. Applicare una pressione minima al sito di imaging, poiché pressioni più elevate potrebbero compromettere le letture. Spingere i predefiniti Hb, HbO 2 e Melanina preimpostati dal produttore che misurano simultaneamente i cromofori per Hb, HbO₂ e melanina.
      ATTENZIONE: È obbligatorio proteggere gli occhi con occhiali di sicurezza adeguati durante il funzionamento.
      NOTA: i fototipi di pelle da IV a VI (pelle scura) sono soggetti a errori di lettura, richiedendo un'immagine di controllo di base per ulteriori elaborazioni. L'uso di occhiali di sicurezza durante l'acquisizione delle immagini (quando il laser è attivo) consente solo all'occhio umano di riconoscere i colori giallo e blu. I colori possono essere modificati durante l'elaborazione delle immagini.
   3. Selezionare l'area anatomica per l'acquisizione dell'immagine di base. A scopo esplorativo, si raccomanda l'avambraccio ventrale. Procedere premendo il pedale dell'interruttore laser a pedale.
      NOTA: il pulsante touch screen con l'etichetta Visualizza (di colore giallo), che mostra l'immagine live sullo schermo quando viene premuto. Lo stato di stabilità dell'immagine viene visualizzato come una barra grigia al centro del touch screen, che indica la stabilità della sonda 3D.
      1. Quando la stabilità dell'immagine è massimizzata, scattare (o acquisire) un'istantanea dell'area premendo il pulsante Snapshot sul touchscreen. Ogni scansione acquisirà 10-12 fotogrammi ad una profondità acustica di 150 mm per ogni lunghezza d'onda definita all'interno del preset su un tempo di acquisizione di 2 s. Questa scansione di acquisizione di base includerà un totale di 30-36 fotogrammi.
         NOTA: vengono raccolti 10 fotogrammi per ogni cromoforo rilevato (Hb, HbO₂ e melanina) con una profondità massima di 15 mm.
      2. Continuare a premere il pedale dell'interruttore laser per l'acquisizione video continua e prestare attenzione al pulsante Visualizza (di colore giallo) sul touch screen. Apparirà l'immagine stabilizzata. Premere Record (colorato in blu) per iniziare la registrazione delle immagini dal vivo.
      3. Interrompere la registrazione premendo il pulsante Stop (di colore nero). La piattaforma di imaging optoacustico interromperà la registrazione e renderà automaticamente il video in modalità anteprima.
   4. Misurazioni dinamiche (illustrazione PORH): regolare il bracciale di pressione sul braccio del paziente sopra il gomito per illustrare questa manovra. Gonfiare il bracciale con pressione sopra sistolica (~200 mmHg) e procedere secondo i passaggi da 2.3.1 a 2.3.3.1 per acquisire la vascolarizzazione ripresa sotto pressione.
   5. Per acquisire un video per valutare l'impatto del rilascio di pressione sulla vascolarizzazione ripresa, aprire la valvola di pressione mentre si acquisisce il video come in 2.3.3.2. Come prima, segui l'immagine live sullo schermo.
      NOTA: Per eseguire questa manovra, la pressione sovra sistolica deve essere mantenuta per 1-5 minuti; È importante essere consapevoli che questa pressione potrebbe indurre diversi gradi di tolleranza e disagio nel paziente. Questo aspetto dovrebbe essere gestito con attenzione durante gli esperimenti.

3. Protocollo di analisi delle immagini

1. Copiare le scansioni registrate in una cartella selezionata/dedicata per il backup e ulteriori analisi su una workstation separata utilizzando il software analitico dedicato del produttore. Ogni scansione viene memorizzata per tempo di acquisizione e ordinata dal programma in una cartella di studio con un codice in esecuzione.
   NOTA: si consiglia vivamente di eseguire una copia di backup. Lavorare direttamente con i dati grezzi registrati è possibile ma fortemente scoraggiato, poiché qualsiasi potenziale crash del disco rigido potrebbe danneggiare i dati grezzi.
2. Aprire il programma di analisi sul computer workstation. Scegliere il menu del programma > Apri studio per importare i file e accedere alle scansioni di backup. Aprire lo studio e scorrere fino alla fine della cartella (con le scansioni registrate) per trovare i file con un file . NOD estensione. Questo è l'unico tipo di file riconosciuto dal software per aprire uno studio.
   NOTA:. I file NOD sono denominati automaticamente con un numero di esecuzione assegnato a ciascun studio e non contengono informazioni sul paziente nel nome del file.
3. Per la ricostruzione delle immagini, aprire il modulo di analisi delle immagini accedendo al software Menu > elaborazione avanzata.
   1. Assicurarsi che le schede del flusso di lavoro del programma siano visibili (di colore nero) sulla barra dei menu superiore (Figura supplementare 1): Menu; Panoramica della scansione; Ricostruzione; Correzione della fluenza; Unmixing spettrale; Visualizzazione e analisi. Durante l'analisi, qualsiasi scheda del flusso di lavoro attivata viene colorata in blu.
      NOTA: se l'elaborazione avanzata non è aperta, il software mostra solo Panoramica scansione e Visualizzazione e analisi.
4. Ricostruisci l'immagine tramite la scheda Ricostruzione del software. Selezionare le scansioni da ricostruire dal lato sinistro del menu principale del programma. Le scansioni caricate vengono visualizzate sul lato destro dello schermo. Lasciare le sei lunghezze d'onda di emissione optoacustica predefinite (700, 730, 760, 800, 850 e 900 nm), in quanto includono il segnale optoacustico massimo per HbO₂ a 900 nm, per Hb a 760 nm e melanina a 700 nm.
   1. Eseguire la ricostruzione della scansione utilizzando l'icona sul lato destro. Seguire il flusso di lavoro del programma selezionando il predefinito di scansione e Campo visivo (risoluzione). Le informazioni sono presentate nell'angolo in alto a sinistra della schermata principale. Regolare la velocità del suono per regolare la messa a fuoco della scansione (Figura supplementare 2). Il pannello Ricostruzione mostra anche il numero di fotogrammi di ogni scansione acquisita e consente di analizzare (se necessario) la selezione delle ripetizioni.
      NOTA: ogni scansione viene caricata con una velocità predefinita del suono di -90, che deve essere regolata dall'utente. La velocità del suono può anche essere regolata automaticamente con una funzione di messa a fuoco automatica (AF).
5. Premere il pulsante Ricostruisci scansioni nella parte superiore dello schermo per passare alla ricostruzione delle scansioni. Verrà visualizzato un dashboard temporaneo con il messaggio Elaborazione processi. È possibile accedere a questo pannello anche dal menu > Stato elaborazione. Dopo aver terminato la ricostruzione, l'analisi di post-elaborazione dell'immagine deve passare alla correzione della fluenza.
6. Attivare Fluence Correction delle immagini ricostruite nel menu del cruscotto. Le immagini ricostruite devono essere caricate per la correzione della fluenza. Questi vengono visualizzati con un flag accanto a ciascun numero di scansione. I file caricati verranno immediatamente visualizzati sul lato destro dello schermo come Ricostruzioni selezionate. Attivare Fluence Correction interagendo con l'icona sul lato destro dello schermo (Figura 3 supplementare). Premere Save Fluence Correction (s) per progredire.
7. Dopo aver salvato la correzione della fluenza, eseguire la miscelazione spettrale del preset acquisito (Hb, HbO₂ e melanina). Selezionate la scheda Rimescolamento spettrale per aprire l'elenco Ricostruzioni selezionate per la rimozione spettrale. Verrà visualizzato un elenco con ogni scansione dello studio selezionato con la cronologia delle precedenti fasi di elaborazione delle immagini.
8. Caricare i file di correzione della fluenza salvati in precedenza. Le scansioni caricate verranno immediatamente visualizzate sul lato destro dello schermo come Ricostruzioni selezionate (Figura supplementare 4). Attiva la miscelazione spettrale premendo l'icona sul lato destro dello schermo.
   1. Osservare le lunghezze d'onda da non mescolare. Tutte e sei le lunghezze d'onda di emissione optoacustica (700, 730, 760, 800, 850 e 900 nm) prese nella fase di ricostruzione (fase 3.4) vengono scelte automaticamente per la dismiscelazione spettrale. Modificare gli spettri desiderati da elaborare (ad esempio, Spectra: Hb, HbO₂ e melanina) utilizzando l'icona XYZ , se necessario.
   2. Dopo aver confermato i parametri regolati, fare clic su Avvia unmixing spettrale per far progredire l'unmixing spettrale . Viene visualizzata una barra dei menu di elaborazione che mostra lo stato di avanzamento dell'operazione.
      NOTA: durante la dismiscelazione spettrale sono possibili varie regolazioni dei parametri e sono disponibili diversi metodi di smistamento. In questo protocollo, il metodo di regressione lineare viene utilizzato come standard per dismescolare Hb, HbO₂ e melanina.
9. Accedere alla scheda Visualizzazione e analisi . Fare clic su una scansione attivata per visualizzare tutte le informazioni sull'oggetto e i commenti introdotti nel passaggio 1.1 (Figura 5 supplementare).
   NOTA: è possibile visualizzare più scansioni in parallelo.
   1. Premere il pulsante + per creare un'analisi a scansione multipla. In questa finestra, introdurre una vista a scansione multipla e premere il pulsante Salva . Dopo aver salvato il nome della vista, viene visualizzata una nuova dashboard, che include tutte le scansioni dello studio analizzato.
   2. Selezionare ciascuna scansione desiderata da aggiungere (ciascuna) alla vista di analisi salvata. Aggiungi altre scansioni nell'icona nell'angolo in alto a sinistra e verranno visualizzate automaticamente nella vista Analisi.
10. All'interno della vista di analisi, impostare le tabelle di ricerca dei colori appropriate per preparare l'immagine per l'analisi. Fai clic su Altre opzioni di controllo immagine nella barra dei menu in alto e attiva l'icona Proiezione massima intensità . Attribuire i colori ai livelli premendo l'icona disponibile nell'angolo inferiore destro della visualizzazione dell'immagine, accanto alla visualizzazione dell'immagine 2D+.
11. Selezionare Altro per modificare i colori di tutti i canali contemporaneamente. Questo menu mostra tutti i cromofori non miscelati e consente la selezione di più livelli per la visualizzazione.
    NOTA: spostando il mouse sulle icone del software viene visualizzato il loro nome in grigio come visualizzato nel protocollo.
12. Regola l'intensità del colore di ogni livello con gli strumenti disponibili nella parte inferiore sinistra dello schermo.
    NOTA: la regolazione con interpolazione min/max per ciascun canale produce generalmente buoni risultati.

4. Analisi della regione di interesse (ROI)

NOTA: la selezione di una regione di interesse (ROI) è obbligatoria per l'analisi dei dati.

1. Identificare il ROI da analizzare. Circondare il ROI con le forme disponibili (all'interno della barra dei menu) nell'immagine XY tracciando lo stesso ROI all'interno delle viste ortogonali disponibili negli assi XZ e YZ (Figura 6 supplementare).
   NOTA: per l'analisi del ROI corrente è stata utilizzata una forma poligonale.
   1. Seguite la forma ROI negli assi XZ e YZ rimanenti (esempio nella Figura 2) mentre posizionate più livelli poligonali con la funzione Aggiungi interpolazione e Rimuovi sottoregioni . I dati possono essere tracciati dopo aver definito/selezionato il ROI desiderato.
   2. Premere l'icona Importa regione di interesse per la quantificazione e osservare la componente multispettri mostrata sul lato destro dello schermo come dettaglio grafico del ROI selezionato.
   3. Esporta i dati ROI premendo l'icona Excel nella parte inferiore della visualizzazione grafica dei dati ROI. L'intero pacchetto di dati da tutte le regioni viene esportato come pacchetto in un foglio di calcolo per l'analisi successiva. La figura 3 mostra i dati di un partecipante che si è sottoposto a un bracciale a pressione gonfiato a 200 mmHg e la vascolarizzazione è stata analizzata rispetto allo stato di riposo della vascolarizzazione a 0 mmHg.
2. Quantificare più oggetti ROI contemporaneamente seguendo i passaggi 4.1-4.1.3.
3. Esportare le immagini dallo stesso menu dei file TIFF con tutti i dati incorporati e la struttura del ROI incorporata (Figura 2).

Risultati

I dati forniti dall'imaging optoacustico possono essere analizzati in immagini di esportazione post-elaborate (Figura 2) e dati tracciati (Figura 3). Lo scopo qui era quello di introdurre il funzionamento dell'imaging funzionale optoacustico e di esplorare la sua applicazione nella ricerca vascolare più comunemente conosciuta. Per questo, abbiamo confrontato le immagini acquisite durante il riposo e dopo un'occlusione di 200 mmHg di un'arteria principale di ali...

Discussione

Questo protocollo enfatizza le fasi di lavoro considerate come requisiti pratici per il funzionamento di questo nuovo strumento di imaging optoacustico, dal posizionamento adeguato (partecipante, sonda) necessario per la stabilizzazione della sonda a tazza 3D all'acquisizione delle immagini, alla selezione del ROI e alla ricostruzione e analisi delle immagini.

L'approccio sperimentale proposto, utilizzando acquisizioni "istantanee" insieme a immagini ottenute in condizioni dinamiche, illustra ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cuff	PIC	107001
Drapes	Pajunk	021151-1501
Ethanol 70%	Sigma Aldrich	EX0281
Gogless	Univet	559G.00.00.201
Kimwipes	Amoos	5601856202331.00
MSOT	iThera	MSOTAcuity
Stabilizing arm	ITEM		Self designed and assemble
Ultrasound gel	Parker Laboratories	308
Waxing cream	Veet	kkdg08hagd