Мультиспектральная оптоакустическая томография для функциональной визуализации в сосудистых исследованиях

Резюме

Настоящий протокол описывает получение мультиспектральных оптоакустических изображений in vivo сосудистой системы кожи человека. К ним относятся количественная оценка гемоглобина и меланина, рассматриваемых как хромофоры, представляющие интерес для функционального анализа.

Аннотация

Микроциркуляторные нарушения были признаны в различных болезненных процессах, лежащих в основе этой растущей темы в сосудистых исследованиях. В последние годы разработка систем визуализации в реальном времени задала (аналитический) темп как в фундаментальных, так и в клинических исследованиях с целью создания новых инструментов, способных предоставлять в режиме реального времени поддающиеся количественной оценке конечные точки с клиническим интересом и применением. Спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона (NIRS), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ) доступны, среди других методов, но стоимость, разрешение изображения и снижение контрастности признаны общими проблемами. Оптоакустическая томография (ОТ) предлагает новый взгляд на функциональную визуализацию сосудов, сочетая современное оптическое поглощение и пространственное разрешение (от микрометрового оптического до миллиметрового акустического разрешения) с глубиной ткани. В этом исследовании мы проверили применимость мультиспектральной оптоакустической томографии (MSOT) для функциональной визуализации. Система использует перестраиваемый оптический параметрический генератор (OPO), накачиваемый лазером Nd: YAG, обеспечивающий импульсы возбуждения, воспринимаемые 3D-зондом на длинах волн от 680 нм до 980 нм. Изображения, полученные с предплечья человека, были реконструированы с помощью определенного алгоритма (поставляемого в программном обеспечении производителя) на основе отклика конкретных хромофоров. С помощью этой системы можно измерить максимальный оксигенированный гемоглобин (Max HbO₂) и дезоксигенированный гемоглобин (Max Hb), общий гемоглобин (HbT) и среднее насыщение кислородом (mSO₂) до плотности сосудов (мкВу), средние расстояния между единицами (ζAd) и объем капиллярной крови (^мм3). Потенциал применимости, обнаруженный в этой системе ОТ, имеет значение. Текущие разработки программного обеспечения, безусловно, улучшат полезность этой системы обработки изображений.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются повторяющимися основными причинами смерти во всем мире и представляют собой огромное бремя для любой системы здравоохранения ^1,2. Технология внесла основной вклад в расширение нашего понимания фундаментальной сердечной и сосудистой патофизиологии, обеспечивая более точные диагностические инструменты и возможность раннего выявления заболеваний и более эффективного управления. Методы визуализации дают возможность измерить не только работу сердца и крупных сосудов, но и, в гораздо меньшем масштабе, рассчитать плотность капилляров, местную перфузию и объем, а также эндотелиальную дисфункцию, среди других характеристик. Эти технологии предложили первое количественное понимание сосудистой биологии с прямым клиническим применением. Изменения плотности капилляров, локальное снижение перфузии или окклюзии, вероятно, соответствуют ишемическому состоянию, что помогает объяснить растущую роль визуализации, становясь незаменимым инструментом в сердечно-сосудистых исследованиях и практике ^3,4,5.

В последние годы функциональная визуализация последовательно задает темп в технологических инновациях, с ультразвуковой (США) ближней инфракрасной спектроскопией (NIRS), позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ), компьютерной томографией (КТ) и магнитно-резонансной томографией (МРТ) в качестве некоторых хорошо известных примеров. Тем не менее, многочисленные проблемы ограничивают их применение, от стоимости и безопасности пациента (а также комфорта) до контрастности изображения и разрешения ^6,7. Оптоакустическая томография (ОТ) в последнее время стала новым направлением в оптических сосудистых исследованиях. Эта технология, основанная на обнаружении ультразвуковых волн, генерируемых термоупругим расширением ткани, пораженной ультракороткими лазерными импульсами, была известна в течение некоторого времени ^6,8. Эта физическая реакция развития тепла и расширения тканей вызывает акустический сигнал, обнаруженный ультразвуковым преобразователем. Использование импульсов света от видимого до ближнего инфракрасного диапазона и отсутствие акустического фонового сигнала улучшают глубину разрешения. Обнаруженный контраст является результатом наиболее важных присутствующих хромофоров (гемоглобин или меланин). По сравнению с другими технологиями, OT имеет преимущества в том, что (1) не требует контрастности (визуализация без меток), (2) лучшей контрастности и разрешения с меньшим количеством артефактов, чем ультрасонография, и (3) более низкой цены, а также более быстрого получения и простоты эксплуатации 6,9,10,11.

Мультиспектральная оптоакустическая томография (MSOT) является одним из самых последних поколений инструментов OT. Построенный с перестраиваемым оптическим параметрическим генератором (OPO), накачиваемым лазером Nd:YAG, обеспечивающим импульсы возбуждения, 3D-изображение получается сигналами с временным разрешением, обнаруженными из высокочастотных ультразвуковых импульсов возбуждения на длинах волн от 680 нм до 980 нм с частотой повторения до 50 Гц¹². Платформа оптоакустической визуализации обеспечивает количественную оценку различных хромофоров в глубину (до 15 мм). Переменные, такие как HbO₂, Hb и меланин, легко доступны. Другие переменные, представляющие интерес, такие как максимальный оксигенированный гемоглобин (Max HbO₂) и дезоксигенированный гемоглобин (Max Hb), также доступны. Алгоритмы реконструкции из программного обеспечения производителя позволяют рассчитывать другие переменные, такие как плотность сосудов (мкВу), среднее расстояние между единицами (ζAd) и объем капилляров (мм³).

В настоящем исследовании исследуются основные операционные аспекты этой новой системы, чтобы лучше понять ее практические аспекты и потенциальные применения в сердечно-сосудистых доклинических исследованиях.

протокол

Экспериментальный протокол был ранее одобрен Комитетом по этике Школы медицинских наук университета (EC. ECTS/P10.21). Процедуры полностью соответствовали принципам надлежащей клинической практики, определенным для исследований на людях¹³. Удобная выборка из шести здоровых участников обоих полов (n = 3 на пол) со средним возрастом 32,8 ± 11,9 лет была выбрана из университетского сообщества. Отобранные участники должны были быть нормотензивными, некурящими и свободными от каких-либо лекарств или пищевых добавок. Также были зарегистрированы артериальное давление, частота сердечных сокращений и индекс массы тела. Все участники были предварительно проинформированы о целях и продолжительности исследования и предоставили информированное письменное согласие.

ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование проводилось с использованием MSOTAcuity (см. Таблицу материалов), отныне упоминаемой как платформа оптоакустической визуализации.

1. Подготовка к приобретению

ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном ниже экспериментальном описании команды экрана выделены жирным шрифтом.

1. Загрузка информации о предмете: Включите оптоакустическое оборудование для визуализации. Пока оборудование разогревается, представьте участнику информацию. В главном окне приветствия программного обеспечения откроется обзор сканирования. Введите данные (включая имя, деноминацию исследования, личные данные и любые соответствующие наблюдения) после нажатия на идентификатор пациента и завершите заявку, нажав Выбрать.
2. Предустановленный выбор: убедитесь, что на экране оборудования отображается сообщение Laser is Ready . По истечении времени прогрева строка состояния лазера на экране оборудования должна измениться с Laser Standby на Laser is Ready. Для этого протокола пресет предназначен для хромофоров Hb, HbO₂ и меланина. После выбора правильной предустановки мощность лазера будет проверена.
3. В этот момент убедитесь, что на экране есть сообщение, которое напоминает каждому участнику в комнате о применении лазерной безопасности Googles. Нажмите на ножную педаль лазерного (силового) переключателя и дождитесь самопроверки мощности лазера. Через несколько секунд появляется окно с текущим состоянием лазера с отчетом о проверке. Отпустите это окно, нажав доступную кнопку OK .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа оптоакустической визуализации использует лазер Nd:YAG, считающийся лазером класса 4, особенно опасным для человеческого глаза. Таким образом, с этим лазером необходимо обращаться с надлежащей осторожностью.
   ВНИМАНИЕ: Никакое приобретение не должно происходить без обеспечения соблюдения всех процедур безопасности, включая надлежащую защиту глаз.

2. Позиционирование и получение изображений

1. Акклиматизируйте участника к лабораторным условиям (21 °C ± 1 °C; относительная влажность 40%-60%), выбрав удобное положение для минимизации ненужных движений. Убедитесь, что область, подлежащая сканированию, предварительно очищена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется рекомендация производителя очистить область, подлежащую изображению, 70% раствором этанола/воды. Кроме того, для лучшего получения изображения рекомендуется удаление волос (когда это применимо).
2. Держатель зонда и стабилизация изображения
   1. Нанесите тонкий слой ультразвукового геля на 3D-чашку. Стабилизация изображения требует удержания 3D-чашки в нужном положении изображения. Позиционируйте и стабилизируйте запираемый рычаг для интересующей области. Рычаг, использованный в этом исследовании, был спроектирован собственными силами и построен из компонентов алюминиевого профиля (рисунок 1).
   2. После размещения 3D-чашки на интересующей вас области, частично заблокируйте стабилизирующий рычаг для получения изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество и равномерное применение ультразвукового геля имеет решающее значение; наличие пузырьков воздуха может поставить под угрозу определение изображения.
3. Получение изображений для динамических состояний с помощью маневра постокклюзионной реактивной гиперемии (PORH) во вкладке меню «Обследование ».
   1. Получите базовое контрольное сканирование. Найдя поле зрения для визуализации, со спущенной манжетой артериального давления на месте, надежно зафиксируйте 3D-рычаг позиционирования чашки.
   2. Приложите минимальное давление к месту визуализации, так как более высокое давление может поставить под угрозу показания. Нажмите на предустановленные производителем по умолчанию Hb, HbO₂ и Меланин, которые одновременно измеряют хромофоры для Hb, HbO₂ и меланина.
      ВНИМАНИЕ: Во время работы необходимо защищать глаза надлежащими защитными очками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фототипы кожи IV-VI (темная кожа) склонны к неправильному прочтению, что требует базового контрольного изображения для дальнейшей обработки. Использование защитных очков во время получения изображения (когда лазер активен) позволяет человеческому глазу распознавать только желтый и синий цвета. Цвета могут быть отредактированы во время обработки изображения.
   3. Выберите анатомическую область для получения базового изображения. В исследовательских целях рекомендуется вентральное предплечье. Продолжайте, нажав на педаль лазерного ножного переключателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кнопка сенсорного экрана с надписью View (цветной желтый), которая показывает живое изображение на экране при нажатии. Состояние стабильности изображения отображается в виде серой полосы в середине сенсорного экрана, указывающей на стабильность 3D-зонда.
      1. Когда стабильность изображения будет максимальной, сделайте (или захватите) снимок области, нажав кнопку «Снимок» на сенсорном экране. Каждое сканирование будет получать 10-12 кадров на акустической глубине 150 мм для каждой длины волны, определенной в пределах заданного времени в течение времени съемки 2 с. Это базовое сканирование сбора будет включать в общей сложности 30-36 кадров.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 10 кадров для каждого обнаруженного хромофора (Hb, HbO₂ и меланин) собираются с максимальной глубиной 15 мм.
      2. Продолжайте нажимать на педаль лазерного ножного переключателя для непрерывного получения видео и обратите внимание на кнопку View (окрашенную в желтый цвет) на сенсорном экране. Появится стабилизированное изображение. Нажмите кнопку Запись (синий цвет), чтобы начать запись изображения в реальном времени.
      3. Остановите запись, нажав кнопку Стоп (цвет черный). Платформа оптоакустической визуализации прекратит запись и автоматически отобразит видео в режиме предварительного просмотра.
   4. Динамические измерения (иллюстрация PORH): Отрегулируйте манжету давления на руку пациента выше локтя, чтобы проиллюстрировать этот маневр. Надувают манжету с надистолическим давлением (~200 мм рт.ст.) и действуйте в соответствии с этапами 2.3.1-2.3.3.1, чтобы получить изображенную сосудистую систему под давлением.
   5. Чтобы получить видео для оценки влияния сброса давления на изображенную сосудистую систему, откройте клапан давления во время получения видео, как показано в пункте 2.3.3.2. Как и прежде, следите за живым изображением на экране.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения этого маневра супра-систолическое давление следует поддерживать в течение 1-5 мин; важно знать, что это давление может вызвать различную степень толерантности и дискомфорта у пациента. Этим аспектом следует тщательно управлять во время экспериментов.

3. Протокол анализа изображений

1. Скопируйте записанные сканы в выбранную/выделенную папку для резервного копирования и дальнейшего анализа на отдельной компьютерной рабочей станции с помощью специального аналитического программного обеспечения производителя. Каждое сканирование хранится по времени получения и упорядочивается программой в папке исследования с запущенным кодом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать резервную копию. Работа непосредственно с записанными необработанными данными возможна, но настоятельно не рекомендуется, так как любое потенциальное сбое жесткого диска может повредить необработанные данные.
2. Откройте программу анализа на компьютере рабочей станции. Выберите программу Меню > Открыть исследование , чтобы импортировать файлы и получить доступ к сканированию резервных копий. Откройте исследование и прокрутите папку вниз (с записанными сканами), чтобы найти файлы с . Расширение NOD. Это единственный тип файла, распознаваемый программным обеспечением для открытия исследования.
   ЗАМЕТКА:. Файлы NOD называются автоматически с номером выполнения, присвоенным каждому исследованию, и не содержат информации о пациенте в имени файла.
3. Для реконструкции изображения откройте модуль анализа изображений, обратившись к программному обеспечению Menu > Advanced processing.
   1. Убедитесь, что вкладки рабочего процесса программы видны (окрашены в черный цвет) в верхней строке меню (дополнительный рисунок 1): Меню; Обзор сканирования; Реконструкция; Коррекция флюенса; Спектральное размешивание; Визуализация и анализ. Во время анализа любая активированная вкладка рабочего процесса окрашивается в синий цвет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если предварительная обработка не открыта, программное обеспечение показывает только обзор сканирования и визуализацию и анализ.
4. Восстановите изображение с помощью вкладки Реконструкция программного обеспечения. Выберите сканы для восстановления в левой части главного меню программы. Загруженные сканы отображаются в правой части экрана. Оставьте шесть длин волн оптоакустического излучения по умолчанию (700, 730, 760, 800, 850 и 900 нм), поскольку они включают максимальный оптоакустический сигнал для HbO₂ при 900 нм, для Hb при 760 нм и меланин при 700 нм.
   1. Выполните реконструкцию сканирования с помощью значка с правой стороны. Следуйте рабочему процессу программы, выбрав стиль сканирования и поле зрения (разрешение). Информация представлена в левом верхнем углу главного экрана. Отрегулируйте скорость звука, чтобы настроить фокус сканирования (дополнительный рисунок 2). Панель « Реконструкция » также показывает количество кадров каждого полученного сканирования и позволяет анализировать (при необходимости) выбор повторений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое сканирование загружается со скоростью звука по умолчанию -90, которая должна быть отрегулирована пользователем. Скорость звука также может быть отрегулирована автоматически с помощью функции автофокусировки (AF).
5. Нажмите кнопку Реконструировать сканирование в верхней части экрана, чтобы перейти к реконструкции сканирования. Появится временная панель мониторинга с сообщением Обработка задания. Доступ к этой панели также можно получить из меню > состоянии обработки. После завершения реконструкции анализ постобработки изображения должен перейти к коррекции Флуенса.
6. Активируйте Fluence Correction реконструированных изображений в меню панели мониторинга. Реконструированные изображения должны быть загружены для коррекции флюенса. Они отображаются с флагом рядом с каждым номером сканирования. Загруженные файлы будут немедленно отображаться в правой части экрана как Выбранные реконструкции. Активируйте Fluence Correction , взаимодействуя со значком в правой части экрана (дополнительный рисунок 3). Нажмите кнопку Save Fluence Correction(s) для выполнения.
7. После сохранения коррекции флюенса выполните спектральное размешивание приобретенного пресета (Hb, HbO₂ и меланин). Выберите вкладку Спектральное разминирование , чтобы открыть список Выбранные реконструкции для спектрального разминения. Список с каждым сканированием выбранного исследования будет отображаться с историей предыдущих этапов обработки изображения.
8. Загрузите ранее сохраненные файлы коррекции флюенса. Загруженные сканы будут немедленно отображаться в правой части экрана как Выбранные реконструкции (дополнительный рисунок 4). Активируйте спектральное разминирование, нажав на значок в правой части экрана.
   1. Наблюдайте за тем, чтобы длины волн не были смешаны. Все шесть длин волн оптоакустического излучения (700, 730, 760, 800, 850 и 900 нм), взятые на стадии реконструкции (шаг 3.4), автоматически выбираются для спектрального размешивания. Отредактируйте требуемые спектры для обработки (например, Spectra: Hb, HbO₂ и меланин), используя значок XYZ , если это необходимо.
   2. После подтверждения скорректированных параметров нажмите «Начать спектральную разминку», чтобы спектральное разминирование продолжалось. Появится строка меню обработки, отображающая ход выполнения операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время спектрального размешивания возможны различные корректировки параметров, и доступно несколько методов размешивания. В этом протоколе метод линейной регрессии используется в качестве стандарта для разминения Hb, HbO₂ и меланина.
9. Откройте вкладку Визуализация и анализ . Щелкните активированное сканирование, чтобы отобразить всю информацию о теме и комментарии, представленные на шаге 1.1 (дополнительный рисунок 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько сканирований могут быть визуализированы параллельно.
   1. Нажмите кнопку + , чтобы создать анализ нескольких сканирований. В этом окне введите представление множественного сканирования и нажмите кнопку Сохранить . После сохранения имени представления отображается новая панель мониторинга, включающая все сканы анализируемого исследования.
   2. Выберите каждое требуемое сканирование, чтобы добавить (каждое) в сохраненное представление анализа. Добавьте дополнительные сканы на значок в левом верхнем углу, и они будут автоматически отображаться в представлении анализа.
10. В представлении анализа задайте правильные таблицы поиска цветов, чтобы подготовить изображение к анализу. Щелкните Дополнительные параметры управления изображением в верхней строке меню и активируйте значок Проекция максимальной интенсивности . Присвойте цвета слоям, нажав значок, доступный в правом нижнем углу изображения, рядом с дисплеем изображения 2D+.
11. Выберите Дополнительно , чтобы редактировать цвета всех каналов одновременно. Это меню показывает все хромофоры без смешивания и позволяет выбрать несколько слоев для отображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наведении указателя мыши на значки программного обеспечения их имя отображается серым цветом, как показано в протоколе.
12. Отрегулируйте интенсивность цвета каждого слоя с помощью инструментов, доступных в левом нижнем углу экрана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка с минимальной/максимальной интерполяцией для каждого канала обычно дает хорошие результаты.

4. Анализ интересующей области (ROI)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор интересующего региона (ROI) является обязательным для анализа данных.

1. Определите рентабельность инвестиций, подлежащую анализу. Окружите roi фигурами, доступными (в строке меню) в изображении XY, отслеживая ту же рентабельность инвестиций в ортогональных представлениях, доступных в оси XZ и YZ (дополнительный рисунок 6).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для текущего анализа ROI использовалась полигональная форма.
   1. Следуйте за фигурой ROI в оставшейся оси XZ и YZ (пример на рисунке 2), размещая несколько полигональных слоев с помощью функции Add Interpolate и Remove sub-regions . Данные могут быть построены после определения/выбора желаемой рентабельности инвестиций.
   2. Нажмите на значок Импорт области интереса для количественной оценки и наблюдайте за компонентом нескольких спектров, показанным в правой части экрана в качестве графической детали выбранной рентабельности инвестиций.
   3. Экспортируйте данные ROI, нажав значок Excel в нижней части графического представления данных ROI. Весь пакет данных из всех регионов экспортируется в виде пакета в электронную таблицу для последующего анализа. На рисунке 3 показаны данные одного участника, который подавался на манжету давления, раздутую до 200 мм рт.ст., и сосудистая система была проанализирована в сравнении с состоянием покоя сосудистой системы при 0 мм рт.ст.
2. Количественная оценка нескольких объектов ROI одновременно, выполнив шаги 4.1-4.1.3.
3. Экспортируйте изображения из того же меню, что и файлы TIFF со всеми встроенными данными и встроенной структурой ROI (рисунок 2).

Результаты

Данные, предоставляемые оптоакустической визуализацией, могут быть проанализированы в постобработанных экспортных изображениях (рисунок 2) и построенных на графике данных (рисунок 3). Цель здесь состояла в том, чтобы представить операцию оптоакустическ...

Обсуждение

Этот протокол подчеркивает рабочие шаги, рассматриваемые как практические требования для работы этого нового оптоакустического инструмента визуализации, от адекватного позиционирования (участник, зонд), необходимого для стабилизации зонда 3D-чашки, до получения изображения, выбора ROI...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cuff	PIC	107001
Drapes	Pajunk	021151-1501
Ethanol 70%	Sigma Aldrich	EX0281
Gogless	Univet	559G.00.00.201
Kimwipes	Amoos	5601856202331.00
MSOT	iThera	MSOTAcuity
Stabilizing arm	ITEM		Self designed and assemble
Ultrasound gel	Parker Laboratories	308
Waxing cream	Veet	kkdg08hagd