Isolamento e identificazione di cellule endoteliali vascolari da depositi adiposi distinti per applicazioni a valle

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione dei depositi adiposi di topo e l'isolamento e la digestione delle rispettive arterie per liberare e quindi identificare la popolazione di cellule endoteliali. Le cellule appena isolate utilizzate nelle applicazioni a valle faranno progredire la comprensione della biologia delle cellule vascolari e dei meccanismi della disfunzione vascolare.

Abstract

Le cellule endoteliali vascolari che rivestono la parete del sistema vascolare svolgono ruoli importanti in una varietà di processi fisiologici, tra cui la regolazione del tono vascolare, le funzioni di barriera e l'angiogenesi. La disfunzione delle cellule endoteliali è un fattore predittivo caratteristico e un importante fattore per la progressione di gravi malattie cardiovascolari, ma i meccanismi sottostanti rimangono poco compresi. La capacità di isolare ed eseguire analisi su cellule endoteliali da vari letti vascolari nella loro forma nativa fornirà informazioni sui processi delle malattie cardiovascolari. Questo protocollo presenta la procedura per la dissezione dei tessuti adiposi sottocutanei e mesenterici del topo, seguita dall'isolamento della rispettiva vascolarizzazione arteriosa. Le arterie isolate vengono quindi digerite utilizzando uno specifico cocktail di enzimi digestivi focalizzati sulla liberazione di cellule endoteliali funzionalmente vitali. Il tessuto digerito viene valutato mediante analisi citometrica a flusso utilizzando cellule CD31+/CD45− come marcatori per l'identificazione positiva delle cellule endoteliali. Le cellule possono essere selezionate per saggi funzionali immediati a valle o utilizzate per generare linee cellulari primarie. La tecnica di isolamento e digestione delle arterie da diversi letti vascolari fornirà opzioni per i ricercatori per valutare le cellule vascolari appena isolate dalle arterie di interesse e consentire loro di eseguire una vasta gamma di test funzionali su specifici tipi di cellule.

Introduzione

Le cellule endoteliali sono ben note per i loro ruoli importanti in una varietà di processi fisiologici, tra cui le funzioni di barriera, l'angiogenesi e la regolazione del tono vascolare ^1,2. Sebbene la disfunzione delle cellule endoteliali sia ben documentata nel promuovere l'aterosclerosi, l'ipertensione, il diabete, ecc., I meccanismi sottostanti alla guida della disfunzione endoteliale rimangono poco conosciuti e probabilmente differiscono tra letti vascolari distinti ^2,3,4. Lo sforzo di svelare questi meccanismi patologici della disfunzione delle cellule endoteliali è messo in discussione dal limitato accesso a una popolazione pura di cellule endoteliali dai tessuti e/o dai cambiamenti fenotipici delle cellule endoteliali in coltura ^5,6. Pertanto, essere in grado di isolare ed eseguire analisi su cellule endoteliali da vari letti vascolari nella loro forma nativa darà informazioni sui processi delle malattie cardiovascolari.

Questo protocollo presenta la procedura per sezionare i tessuti adiposi sottocutanei e mesenterici dai topi, seguita dall'isolamento della rispettiva vascolarizzazione arteriosa. Le cellule endoteliali funzionalmente vitali che rivestono le pareti arteriose vengono liberate utilizzando uno specifico cocktail di enzimi. Particolare attenzione è stata posta nell'ottimizzare le condizioni del protocollo di digestione per ottenere una resa sufficiente di cellule endoteliali da <1 mg di tessuto di partenza, mantenendo intatti i marcatori biomolecolari per l'analisi. Le cellule endoteliali isolate vengono successivamente identificate utilizzando la citometria a flusso. La presenza di CD31 (PECAM) viene utilizzata principalmente per identificare le cellule endoteliali. A causa dell'espressione di CD31 in altri tipi cellulari, tra cui diversi di origine ematopoietica che esprimono anche CD45, la purezza delle cellule endoteliali isolate è stata ulteriormente aumentata dall'esclusione di cellule che esprimono sia CD31 che CD45 5,6,7,8. Inoltre, a seconda della domanda di ricerca e delle applicazioni a valle da impiegare, i ricercatori dovrebbero prendere in considerazione la selezione di un ampio pannello di marcatori di selezione positivi e negativi per ottimizzare la purezza della popolazione cellulare di interesse.

Sebbene la tecnica di sezionare e isolare le arterie adipose dei depositi sia stata utilizzata nelle precedenti pubblicazioni 9,10,11,12,13^, un protocollo dettagliato che descrive l'isolamento delle arterie incorporate deve ancora essere presentato. Dimostrare la tecnica per l'isolamento e la digestione delle arterie da diversi letti vascolari di una determinata specie di interesse fornirà opzioni per i ricercatori per valutare le cellule vascolari appena isolate dalle arterie di interesse e consentire loro di eseguire una vasta gamma di test funzionali su specifici tipi di cellule. I test possono includere, ma non sono limitati a, citometria a flusso per il selezione cellulare e l'espressione proteica di membrana^5,8, elettrofisiologia per l'attività dei canali ionici⁹, profilazione molecolare (proteomica / analisi genomica^, ecc.) ^14,15, e la generazione di linee cellulari primarie per lo screening farmacologico in vitro^16,17.

Protocollo

L'uso di animali in questi studi è stato approvato dall'Università del Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (# 1372).

1. Dissezione e pulizia dei tessuti

NOTA: nel protocollo video vengono utilizzati topi C57BL/6J di età compresa tra 10 e 12 settimane. Fare riferimento alla Figura 1 per lo schema e il risultato desiderato della dissezione tissutale e della pulizia delle arterie e fare riferimento alla Tabella dei materiali per l'elenco dei materiali di consumo e le informazioni sul produttore.

1. Eutanasia del topo per asfissia da CO₂ seguita da lussazione cervicale.
2. Fissare il mouse utilizzando perni di dissezione e spruzzare la superficie ventrale con etanolo al 70%.
3. Isolamento dei tessuti adiposi sottocutanei localizzati da ciascun arto posteriore
   NOTA: Strumenti di dissezione necessari: forbici Bonn dritte (9 cm) e pinza Graefe smussata e curva.
   1. Utilizzare una pinza per sollevare la pelle proprio sopra i genitali e fare una piccola incisione (2 mm) nella pelle.
   2. Inserire la punta delle forbici nel sito di incisione e fare un'incisione della linea mediana di 4-5 cm, iniziando dall'incisione iniziale e sezionando cranialmente alla base dello sterno. Fai attenzione a non penetrare nella cavità addominale.
   3. Fai un'incisione laterale di 1 cm, che si estende lateralmente dalla linea mediana immediatamente sotto l'arto anteriore.
   4. Fai un'incisione diagonale di 1 cm tra l'arto posteriore e i genitali.
   5. Fai piccoli tagli lungo le incisioni cutanee della linea mediana per rimuovere il tessuto connettivo associato ed esporre il deposito adiposo sottocutaneo. Appunta la pelle verso il basso.
   6. Identificare il tessuto adiposo sottocutaneo "a forma di C" e l'arteria/vena che corre perpendicolare alla cavità addominale.
   7. Inizia dal fondo della forma a C vicino ai genitali e afferra delicatamente il tessuto adiposo per esporre i tessuti connettivi. Fai piccoli tagli nel tessuto connettivo per separare il grasso dalla pelle. Evitare di disturbare la vascolarizzazione esposta.
   8. Continuare a sezionare il tessuto connettivo fino a quando il tessuto adiposo sottocutaneo può essere rimosso intatto. Separare accuratamente l'arteria esposta dal tessuto connettivo circostante.
   9. Conservare l'adiposo sottocutaneo isolato nel tampone HEPES sul ghiaccio fino al momento di isolare il letto vascolare di interesse.
   10. Ripetere i passaggi 1.3.3.-1.3.5. per il restante deposito adiposo sottocutaneo posteriore.
4. Isolamento del deposito adiposo mesenterico
   NOTA: Strumenti di dissezione necessari: forbici Bonn dritte (9 cm), pinza Graefe, un paio di pinze #5, forbici per iride dritte e forbici Bonn curve (9 cm).
   1. Utilizzare la pinza Graefe per sollevare la sottile parete della cavità peritoneale sopra la vescica urinaria e fare una piccola incisione usando le forbici dritte.
   2. Sollevare lentamente la parete della cavità peritoneale penetrata, inserire con attenzione le forbici dell'iride dritte nel sito di incisione e praticare un'incisione di 4-5 cm dalla vescica urinaria allo sterno.
   3. Fai due incisioni orizzontali lunghe 1 cm con le forbici dell'iride dritte, che si estendono lateralmente dalla linea mediana immediatamente sopra l'arto posteriore e sotto l'arto anteriore. Utilizzare la pinza di Graefe per staccare la muscolatura addominale ed esporre i visceri peritoneali.
   4. Ripetere il passaggio 1.4.3. sul lato opposto.
   5. Usa la coppia di pinze # 5 per sollevare l'intestino dalla cavità viscerale per rivelare l'adiposo mesenterico.
   6. Usa le forbici curve e la pinza #5 per separare l'adiposo lungo il colon, partendo dal cieco fino a dove il colon scende dalla vista.
   7. Tornare al cieco e utilizzare le forbici curve e la pinza #5 per separare l'adiposo lungo l'intestino tenue fino al pancreas. Rimuovere una piccola parte del pancreas per isolare completamente l'adiposo mesenterico.
      NOTA: La rimozione di una piccola parte del pancreas insieme all'adiposo mesenterico può aiutare nella pulizia delle arterie in quanto fornisce stabilità durante la pulizia.
   8. Conservare l'adiposo mesenterico isolato nel tampone HEPES sul ghiaccio fino al momento di isolare le arterie mesenteriche.
5. Isolamento delle rispettive arterie dai tessuti adiposi sottocutanei e mesenterici
   NOTA: strumenti di dissezione necessari: un piatto di dissezione e stereoscopio con una fonte di luce, un paio di pinze #55 e un paio di pinze #5.
   1. Posizionare ~ 10 ml di tampone HEPES freddo nel piatto di dissezione e trasferire il tessuto adiposo al piatto usando la pinza # 5.
   2. Utilizzare lo stereoscopio con ingrandimento 1x per visualizzare e posizionare il tessuto adiposo per esporre la coppia arteria/vena (Figura 2).
   3. Utilizzare la pinza # 55 per rimuovere con cura il parenchimale adiposo dall'arteria. Rimuovere piccoli pezzi di adiposo alla volta e osservare attentamente le coppie arteria/vena sotto lo stereoscopio per identificare ed evitare di danneggiare la vascolarizzazione di interesse.
      NOTA: Regolare l'ingrandimento e la sorgente luminosa di conseguenza per pulire le arterie. Aumentare l'ingrandimento e l'intensità della luce per visualizzare meglio le arterie mentre l'adiposo viene rimosso. La pulizia fine delle arterie deve essere eseguita con un ingrandimento 4x-5x. È importante distinguere tra tessuti connettivi (collagene), vene e arterie. I tessuti connettivi e le fibre di collagene hanno un aspetto simile a una corda senza rami, sono striati e hanno un colore biancastro. A differenza delle fibre di collagene e dei tessuti connettivi, le arterie e le vene sono trasparenti e hanno più rami con un lume definito. Le piccole arterie e vene possono apparire simili nell'aspetto quando sono prive di tessuto parenchimale. La presenza di sangue nel lume può ulteriormente aiutare a identificare le arterie dalle vene. Le vene hanno pareti dei vasi sanguigni più sottili e un lume più grande e contengono più sangue rispetto alle arterie di dimensioni comparabili.
   4. Ripetere il passaggio 1.5.3. fino a quando le arterie sono completamente prive di tessuto adiposo parenchimale.
   5. Utilizzare una pinza #5 per trasferire le arterie pulite in un nuovo tubo con tampone HEPES fresco e tenere sul ghiaccio fino al momento della digestione.

2. Digestione delle arterie isolate per l'isolamento delle cellule endoteliali

NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per lo schema della digestione tissutale e dell'isolamento delle cellule endoteliali e alla Tabella dei materiali per un elenco completo delle forniture necessarie per il protocollo.

1. Aggiungere 1 mg ciascuno di dispasi ed elastasi a ciascuna provetta da 2 mL di microcentrifuga. Aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione a ciascuna provetta. Vortice e incubare a 37 °C fino a completa dissoluzione. Utilizzare una pinza #5 per trasferire le arterie pulite (passo 1.5.5.) alle rispettive provette. La concentrazione finale di ciascun enzima è di 0,5 mg/ml.
2. Incubare a 37 °C per 1 ora agitando delicatamente per inversione ogni 10-15 minuti, in modo tale che le arterie siano sospese in soluzione per mantenere un contatto costante e uniforme tra gli enzimi e le arterie.
3. Pesare 1 mg di collagenasi di tipo I per campione e aggiungerlo a nuovi provette.
4. Lasciare che le arterie si depositino sul fondo del tubo. Rimuovere 500 μL del tampone dalla parte superiore senza disturbare le arterie e trasferirlo in tubi designati contenenti collagenasi. Vortex e riportare la soluzione ai rispettivi campioni nelle provette originali. La concentrazione finale di collagenasi di tipo I è di 0,5 mg/ml.
5. Incubare a 37 °C per 15 min. Assicurarsi che le arterie si separino in pezzi dopo un breve scuotimento della provetta. Se le arterie non si separano in pezzi dopo la perturbazione, incubare con incrementi di 5 minuti fino a quando la rottura arteriosa è visibile.
6. Utilizzando una pipetta di vetro, triturare vigorosamente il tessuto digerito 10x-15x per dissociare meccanicamente le cellule.
7. Far passare la soluzione e il tessuto digerito attraverso un filtro cellulare da 70 μm o un filtro a tubo per citometria a flusso per ottenere sospensioni unicellulari.

3. Colorazione delle cellule endoteliali prima della citometria a flusso

NOTA: La colorazione e il trattamento delle cellule endoteliali vengono effettuati su ghiaccio per migliorare la vitalità cellulare, se non richiesto. I tubi a fondo tondo in polistirene da 5 mL vengono centrifugati a 1.163 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).

1. Centrifugare le sospensioni monocellulari a 1.163 x g per 3 minuti a RT.
2. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di PBS + 5% BSA per 30 minuti a RT.
   NOTA: I ricercatori dovrebbero prendere in considerazione il blocco dei recettori FC a seconda del tipo di cellula, del bersaglio di interesse e dell'anticorpo utilizzato^18,19.
3. Aggiungere 1 μL di colorazione di vitalità cellulare (eccitazione 405 nm) (Tabella dei materiali) e incubare al buio per 30 minuti a RT.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.163 x g per 3 minuti a RT. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di PBS + 1% BSA.
5. Ai campioni, aggiungere anticorpi primari coniugati a CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/campione) e CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/campione) e incubare su un bilanciere in frigorifero per 15 minuti dopo aver coperto i campioni con un foglio di alluminio.
   NOTA: Per identificare e/o ottenere una popolazione pura di cellule endoteliali, sondare sia CD31 che CD45 utilizzando anticorpi primari coniugati CD31 e CD45 con fluorescenza di eccitazione/emissione distinta e cellule gate/sort con un profilo di espressione ^CD31+CD45⁻. Può essere richiesto un risarcimento a seconda dei fluorofori utilizzati 18,20,21.
6. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di PBS + 1% BSA direttamente alla sospensione cellulare.
7. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.163 x g per 3 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e risospendere in 200 μL di formaldeide all'1% con BSA allo 0,1%. Conservare in frigorifero coperto con un foglio di alluminio fino al momento della citometria a flusso.
   NOTA: La resa delle celle viene migliorata riducendo le fasi di lavaggio e centrifugazione. Questi potrebbero dover essere modificati a seconda dell'approccio di risultato. Il campione in fissativo deve essere analizzato entro 24 ore.

Risultati

Uno schema del flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1. Lo schema evidenzia i passaggi del protocollo descritti in modo più dettagliato nel testo del protocollo. La Figura 2 mostra immagini di adiposo sottocutaneo (Figura 2A, a sinistra) dopo la dissezione e una galleria di arterie sottocutanee (Figura 2A, a destra) dopo la pulizia del tessuto parenchimale. La Figura 2 mostra anche l'adiposo mesenterico (Figura 2B, a sinistra) dopo la dissezione e l'arcata arteriosa mesenterica (Figura 2B, a destra) dopo la pulizia del tessuto parenchimale.

Il protocollo qui presentato è progettato per aiutare i ricercatori potenzialmente interessati a) a confrontare distinti letti vascolarizzari di deposito adiposo in approcci scientifici di base e / o modelli di malattia, b) la digestione dei letti vascolari prima dell'isolamento delle cellule vascolari di interesse per l'applicazione a valle e c) l'uso della citometria a flusso per identificare le cellule vascolari di interesse (Figura 3 ) per una varietà di applicazioni, tra cui, ma non solo, le analisi dell'espressione proteica qui eseguite (figura 4). La Figura 3 descrive un esempio del nostro approccio per identificare le cellule endoteliali dalle arterie di topo digerite utilizzando la citometria a flusso. I preparati cellulari ottenuti da arterie adipose sottocutanee digerite (Figura 3A) o mesenteriche (Figura 3B) sono state colorate con CD31-PE, CD45-FITC e un colorante di vitalità cellulare prima della fissazione e dell'identificazione di cellule endoteliali vitali CD31 + CD45− utilizzando la citometria a flusso, come eseguito in modo simile altrove⁸. La colorazione di vitalità cellulare ha permesso l'identificazione solo di quelle cellule vitali che sono sopravvissute al protocollo di isolamento e digestione prima della fissazione. L'uso di questo metodo consentirà ai ricercatori di valutare l'espressione o la funzione delle cellule vascolari vitali di interesse.

Per determinare se le cellule endoteliali isolate da distinte vascolarizzazioni adipose mostrassero differenze nell'espressione proteica di membrana, sono state sondate cellule isolate per la translocasi degli acidi grassi, CD36 (Figura 4), poiché questa proteina di membrana ha recentemente dimostrato di essere essenziale nella distribuzione endoteliale-mediata degli acidi grassi ai tessuti²² . Pertanto, determinare le differenze di espressione relativa tra CD36 di membrana, ad esempio, in letti vascolari distinti può a) supportare i dati esistenti riguardanti la preferenza differenziale per l'utilizzo degli acidi grassi tra i diversi tessuti e / o b) svelare potenziali nuove differenze nella distribuzione tissutale degli acidi grassi in salute e malattia. Dalle stesse preparazioni di cellule vascolari digerite esemplificate nella Figura 3, le cellule endoteliali CD31 + CD45-CD36 + sono state identificate in adiposo sottocutaneo (Figura 4A) e mesenterico (Figura 4B) e l'espressione di CD36 è stata quantificata in questa popolazione in ciascun letto vascolare. La Figura 4C e la Figura 4D rivelano che sia la percentuale di cellule endoteliali che esprimono CD36 che l'intensità dell'espressione di CD36 erano maggiori nelle cellule endoteliali sottocutanee rispetto a quella osservata nelle cellule endoteliali mesenteriche. Questi risultati preliminari supportano l'uso della nostra metodologia per identificare differenze distinte tra i letti vascolari.

Figura 1: Schema di lavoro per isolare cellule endoteliali da tessuti adiposi sottocutanei e viscerali per applicazioni a valle . (A) Topi C57BL/6J di 10-12 settimane sono stati sottoposti a eutanasia e utilizzati per dimostrare questa procedura. (Bi) In primo luogo, l'adiposo sottocutaneo viene rimosso. (Bii) Quindi, il tessuto adiposo mesenterico (viscerale) viene successivamente rimosso. Le linee tratteggiate bianche indicano le posizioni dei depositi adiposi sottocutanei (a sinistra) e mesenterici (a destra) dopo la dissezione e la rimozione. Le rispettive arterie sono isolate per applicazioni a valle. (C) In questo protocollo, le arterie isolate vengono successivamente digerite utilizzando uno specifico cocktail enzimatico come primo passo nella liberazione di cellule endoteliali funzionalmente vitali. (D) Le cellule endoteliali isolate sono identificate sondando le cellule CD31+ e CD45− utilizzando anticorpi coniugati prima dell'analisi della citometria a flusso. Le cellule con un profilo di espressione di CD31⁺/CD45⁻ sono le cellule endoteliali di interesse per ulteriori analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Tessuti adiposi sottocutanei e viscerali isolati e rispettive arterie. (A) A sinistra: tessuto adiposo sottocutaneo isolato "a forma di C" dagli arti posteriori. Un ramo importante dell'arteria adiposa sottocutanea, indicato con la freccia (1), si rivela quando viene rimosso l'adiposo parenchimale. A destra: arterie adipose sottocutanee isolate. (B) A sinistra: il tessuto adiposo mesenterico (viscerale) è isolato dall'intestino. A destra: la rispettiva arcata arteriosa viene isolata rimuovendo il tessuto parenchimale. Diverse scale sono utilizzate tra le immagini di adiposo (5 mm) e arterie (1 mm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Identificazione delle cellule endoteliali dopo la digestione del tessuto arterioso tramite citometria a flusso. Grafici rappresentativi che mostrano cellule liberate da arterie adipose sottocutanee isolate (A) o (B). Le cellule sono state esposte ad anticorpi coniugati che hanno preso di mira epitopi extracellulari di CD31 (PE) e CD45 (FITC) prima della fissazione. La citometria a flusso è stata utilizzata per identificare la popolazione di cellule endoteliali CD31 + CD45−. Una macchia di vitalità cellulare è stata utilizzata per selezionare solo le cellule sopravvissute ai protocolli di isolamento e digestione per le analisi successive. Inoltre, un gating appropriato in questa fase separerà ulteriormente una popolazione cellulare prevista dalle cellule contaminanti se la dimensione del tipo di cellula di interesse è nota. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'espressione della membrana CD36 nelle cellule endoteliali dell'arteria adiposa sottocutanea vs. mesenterica tramite citometria a flusso. Grafici e istogrammi rappresentativi della popolazione che mostrano l'espressione della membrana endoteliale CD36 (APC) nelle arterie adipose (A) sottocutanee o (B). (C) Percentuale di cellule endoteliali (CE) che esprimono CD36 nelle EC sottocutanee vs. mesenteriche (n = 5, 3 maschi, 2 femmine; *p < 0,05 dopo il t-test di Student). (D) Espressione normalizzata di CD36 della membrana EC nelle arterie adipose sottocutanee vs. mesenterica (n = 5, 3 maschi, 2 femmine; *p < 0,05 dopo il t-test di Student). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

La disfunzione endoteliale è un precursore di gravi stati patologici, probabilmente guidando lo sviluppo di aterosclerosi, ipertensione e ictus ^3,23. Mentre i meccanismi identificati alla base della disfunzione endoteliale in una data condizione patologica sono molti, è probabile che letti vascolari distinti siano influenzati in modo differenziale da condizioni patologiche ^4,24. Inoltre, diversi fattori di rischio cardiovascolare (ad esempio, obesità, ipertensione, dislipidemia, fumo, diabete) inducono disfunzioni attraverso una varietà di meccanismi distinti^23,25. Pertanto, è fondamentale isolare le popolazioni di cellule endoteliali da modelli animali consolidati di malattia o tessuto umano accessibile ed eseguire saggi su cellule immediatamente rimosse dall'ambiente in vivo. Isolare le cellule in questo modo ha un vantaggio unico rispetto allo studio delle cellule in coltura in quanto sono prive di cambiamenti fenotipici indotti dalla coltura ^5,6. Inoltre, includere una popolazione eterogenea di cellule endoteliali, come osservato in vivo ^26,27 (e che può essere ulteriormente separata utilizzando la selezione cellulare assistita dal flusso), da un organismo vivo informa meglio l'ambiente in vivo. Infine, questo metodo è applicabile allo studio di numerosi modelli animali e tessuti potenzialmente umani e può essere utilizzato per generare linee di coltura cellulare primaria, se tale necessità è giustificata.

Il passo critico in questo protocollo, e il passo che richiederà la maggior parte degli aggiustamenti per diversi letti vascolari o tipi di cellule non presentati qui, è la digestione del tessuto vascolare. Questo passaggio deve essere ottimizzato per la salute delle cellule senza diminuire la resa cellulare. Gli enzimi specifici utilizzati e la durata della digestione sono fondamentali per ottimizzare la salute e la resa cellulare per essere in grado di eseguire adeguatamente i saggi a valle. Per l'identificazione dell'espressione di membrana di CD36, come rilevato dalla citometria a flusso nelle cellule endoteliali sottocutanee e mesenteriche (Figura 4), è stata sviluppata una versione modificata del protocollo di digestione originariamente progettato per l'elettrofisiologia patch-clamp²⁸ . Ciò includeva un'estensione del tempo di digestione della collagenasi I a 30 minuti per aumentare la resa cellulare per soddisfare meglio le esigenze della citometria a flusso rispetto a quanto richiesto per gli studi patch-clamp. Poiché questa modifica può avere un impatto sulla salute delle cellule in una certa misura, nelle analisi di citometria a flusso è stata utilizzata una colorazione di vitalità cellulare per garantire che solo le cellule endoteliali vitali fossero valutate seguendo questo protocollo (Figura 3). Si raccomanda che gli studi volti a isolare le cellule dal tessuto vascolare includano un marcatore per la vitalità cellulare prima di valutare l'approccio desiderato.

Il protocollo descritto è sufficiente per liberare cellule endoteliali vitali per l'analisi e le applicazioni a valle da campioni arteriosi di ≤1 mg derivati da topi; Tuttavia, se le arterie di interesse dovessero essere isolate da diversi tessuti o organismi (ad esempio, gli esseri umani) che si tradurrebbero in masse arteriose significativamente diverse, si dovrebbe ottimizzare il contenuto di enzimi di digestione e la durata dell'incubazione per isolare in modo efficiente la popolazione cellulare di interesse. Per alcuni letti vascolari che iniziano con quantità ancora più piccole di tessuto iniziale rispetto ai letti sottocutanei e mesenterici presentati qui (ad esempio, arterie coronarie), può essere necessario raggruppare le arterie di diversi topi per campione. In effetti, questo può essere un passo necessario per qualsiasi dato letto vascolare dato che l'approccio di esito richiede una resa cellulare relativamente elevata. Una delle principali limitazioni è che, a causa della natura delle variazioni per digestione del campione, le rese cellulari possono talvolta essere significativamente diverse tra i lotti anche quando provengono dallo stesso letto vascolare. Ciò può causare problemi durante l'analisi dei dati e deve essere tenuto in considerazione tramite la normalizzazione quando appropriato. Ad esempio, l'espressione di CD36 era estremamente variabile nei dati grezzi a causa di alterazioni nelle rese cellulari tra i singoli campioni di arterie adipose sottocutanee e mesenteriche. Pertanto, i dati grezzi sono stati normalizzati all'intensità media di fluorescenza CD31+CD45− con l'ipotesi che questo metodo correggesse le differenze di lotto (Figura 4). Naturalmente, a seconda dell'approccio, possono essere necessarie analisi statistiche più sofisticate e metodi di normalizzazione.

In sintesi, questo articolo presenta un metodo per sezionare, isolare e digerire le arterie sottocutanee e mesenteriche dai topi per studiare l'espressione e / o la funzione dei bersagli endoteliali di interesse. Con le modifiche al protocollo presentato, è possibile studiare diversi letti vascolari e tipi di cellule (ad esempio, cellule muscolari lisce). Questo protocollo, come base per una pletora di approcci sperimentali disponibili, ha il potenziale per far progredire la comprensione della biologia delle cellule vascolari e dei meccanismi della disfunzione vascolare.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue dissection tools
5 forceps (2)	Fine Science Tools	11252-00	For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer
55 forceps (2)	Fine Science Tools	11295-51	For parenchymal adipose removal
Curved Bonn scissors	Fine Science Tools	14061-10	For isolation of mesenteric adipose depot
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot
Straight Bonn scissor	Fine Science Tools	14060-09	For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot
Stereoscope with light source	Laxco	Z230PT40	For parenchymal adipose removal and artery isolation
Digestive enzymes for Artery Digestion
Collagenase Type I	Wothington-BioChem	LS004194
Dispase (Neutral Protease)	Wothington-BioChem	LS02110
Elastase	Wothington-BioChem	LS002292
Solutions Recipes
HEPES Buffer, pH 7.4			Final concentration
Calcium chloride dihydrate	J.T.Baker	1332-1	2 mM
Dextrose (D-glucose) anhydrous	Fisher	D16-500	10 mM
HEPES	Fisher	BP310-500	10 mM
Magnesium Chloride	Fisher	M33-500	1 mM
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	5 mM
Sodium chloride	Oxoid	LP0005	145 mM
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40
Dextrose (D-glucose) anhydrous	Fisher	D16-500	10 mM
HEPES	Fisher	BP310-500	10 mM
Magnesium Chloride	Fisher	M33-500	2 mM
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	56 mM
Sodium chloride	Oxoid	LP0005	55 mM
Sodium L-Glutamate monohydrate	TCI	G0188	80 mM
Flow Cytometry Analyses
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
CD31-PE	Miltenyi Biotec	130-119-653	0.75µg/sample
CD36-APC	R&D Systems	AF2519	2.5µg/ sample
CD45-FITC	BioLegend	103108	2.5µg/ sample
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain)	Invitrogen	L34955	1µL/sample