다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

요약

이 프로토콜은 마우스 지방 저장소를 해부하고 각 동맥을 분리 및 소화하여 내피 세포 집단을 유리시키고 식별하는 방법을 자세히 설명합니다. 다운스트림 응용 분야에 사용되는 새로 분리된 세포는 혈관 세포 생물학 및 혈관 기능 장애의 메커니즘에 대한 이해를 발전시킬 것입니다.

초록

혈관계의 벽을 감싸는 혈관 내피 세포는 혈관 색조 조절, 장벽 기능 및 혈관 신생을 포함한 다양한 생리적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 내피 세포 기능 장애는 심각한 심혈관 질환의 진행에 대한 특징적인 예측 인자이자 주요 동인이지만 기본 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않고 있습니다. 다양한 혈관 층에서 내피 세포를 원래 형태로 분리하고 분석을 수행 할 수있는 능력은 심혈관 질환의 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 마우스 피하 및 장간막 지방 조직의 해부와 각각의 동맥 혈관의 분리 절차를 제시합니다. 분리 된 동맥은 기능적으로 생존 가능한 내피 세포를 유리시키는 데 초점을 맞춘 소화 효소의 특정 칵테일을 사용하여 소화됩니다. 소화된 조직은 양성 내피 세포 식별을 위한 마커로서 CD31+/CD45- 세포를 사용하는 유세포분석 분석에 의해 평가된다. 세포는 즉각적인 다운스트림 기능 분석을 위해 분류되거나 1차 세포주를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 다른 혈관 층에서 동맥을 분리하고 소화하는 기술은 연구자가 관심있는 동맥에서 새로 분리 된 혈관 세포를 평가하고 특정 세포 유형에 대한 광범위한 기능 테스트를 수행 할 수있는 옵션을 제공합니다.

서문

내피 세포는 장벽 기능, 혈관 신생 및 혈관 색조 조절 ^1,2를 포함한 다양한 생리적 과정에서 중요한 역할로 잘 알려져 있습니다. 내피 세포 기능 장애가 죽상 동맥 경화증, 고혈압, 당뇨병 등을 촉진하는 데 잘 문서화되어 있지만, 내피 기능 장애를 유발하는 기본 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있으며 별개의 혈관 침대 ^2,3,4간에 다를 수 있습니다. 내피 세포 기능 장애의 이러한 병리학적 메커니즘을 밝히기 위한 노력은 조직으로부터의 내피 세포의 순수한 집단에 대한 제한된 접근 및/또는 배양 ^5,6에서 내피 세포의 표현형 변화로 인해 도전을 받습니다. 따라서 다양한 혈관 층에서 내피 세포를 원래 형태로 분리하고 분석을 수행 할 수 있으면 심혈관 질환의 과정에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이 프로토콜은 마우스에서 피하 및 장간막 지방 조직을 해부한 다음 각각의 동맥 혈관구조를 분리하는 절차를 제시합니다. 동맥벽을 감싸는 기능적으로 생존 가능한 내피 세포는 특정 효소 칵테일을 사용하여 유리됩니다. 분석을 위해 생체 분자 마커를 그대로 유지하면서 <1mg의 시작 조직에서 내피 세포의 충분한 수율을 얻기 위해 소화 프로토콜의 조건을 최적화하기 위해 특별한주의를 기울였습니다. 단리된 내피 세포는 다음으로 유세포분석을 사용하여 확인된다. CD31 (PECAM)의 존재는 주로 내피 세포를 확인하는 데 사용됩니다. CD45를 또한 발현하는 몇몇 조혈 기원을 포함하는 다른 세포 유형에서의 CD31의 발현으로 인해, 분리된 내피 세포의 순도는 CD31 및 CD45 둘 다를 발현하는 세포의^배제에 의해 추가로 향상되었다 5,6,7,8. 또한, 연구 질문 및 사용할 다운스트림 응용 분야에 따라 연구자들은 관심 세포 집단의 순도를 최적화하기 위해 양성 및 음성 선택 마커의 광범위한 패널을 선택하는 것을 고려해야 합니다.

지방 저장소 동맥을 해부하고 분리하는 기술이 이전 간행물 9,10,11,12,13에서 사용되었지만 임베디드 동맥의 분리를 설명하는 자세한 프로토콜은 아직 제시되지 않았습니다. 주어진 관심 종의 다른 혈관 층에서 동맥을 분리하고 소화하는 기술을 시연하면 연구자가 관심 동맥에서 새로 분리 된 혈관 세포를 평가하고 특정 세포 유형에 대한 광범위한 기능 테스트를 수행 할 수있는 옵션을 제공 할 수 있습니다. 테스트에는 세포 분류 및 막 단백질 발현^5,8에 대한 유세포 분석, 이온 채널 활성⁹에 대한 전기 생리학^, 분자 프로파일 링 (단백질체학 / 게놈 분석 등)이 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않습니다. 14,15,15,16,17 시험관내 약물 스크리닝을 위한 1차 세포주의 생성.

프로토콜

이 연구에서 동물의 사용은 델라웨어 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#1372)의 승인을 받았습니다.

1. 조직 해부 및 청소

참고: 10-12주 된 C57BL/6J 마우스가 비디오 프로토콜에 사용됩니다. 조직 박리 및 동맥 세척의 개략도와 원하는 결과는 그림 1 을 참조하고 소모품 목록 및 제조업체 정보는 재료 표를 참조하십시오.

1. CO2 질식에 이어 자궁경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다.
2. 해부 핀을 사용하여 마우스를 고정하고 복부 표면에 70 % 에탄올을 뿌립니다.
3. 각 뒷다리에 위치한 피하 지방 조직의 분리
   알림: 해부 도구 필요: 직선 본 가위(9cm)와 뭉툭하고 구부러진 Graefe 집게.
   1. 집게를 사용하여 생식기 바로 위의 피부를 들어 올리고 피부에 작은 (2mm) 절개를하십시오.
   2. 가위 끝을 절개 부위에 삽입하고 초기 절개에서 시작하여 흉골 기저부까지 두개골로 해부하여 4-5cm 정중선 절개를합니다. 복강에 침투하지 않도록주의하십시오.
   3. 앞다리 바로 아래 정중선에서 옆으로 뻗어 1cm 측면 절개를하십시오.
   4. 뒷다리와 생식기 사이에 대각선 1cm 절개를하십시오.
   5. 정중선 피부 절개를 따라 작은 절단을 하여 관련 결합 조직을 벗겨내고 피하 지방 저장소를 노출시킵니다. 피부를 아래로 고정하십시오.
   6. 복강에 수직으로 뻗어있는 "C 자형"피하 지방 조직과 동맥 / 정맥을 확인하십시오.
   7. 생식기 근처의 C 자 모양의 바닥에서 시작하여 지방 조직을 부드럽게 잡고 결합 조직을 노출시킵니다. 피부에서 지방을 분리하기 위해 결합 조직을 약간 자릅니다. 노출 된 혈관계를 방해하지 마십시오.
   8. 피하 지방 조직이 손상되지 않게 제거 될 때까지 결합 조직을 계속 해부하십시오. 노출 된 동맥을 주변 결합 조직과 조심스럽게 분리하십시오.
   9. 관심있는 혈관 층을 분리 할 준비가 될 때까지 분리 된 피하 지방을 얼음 위의 hepes 완충액에 저장하십시오.
   10. 1.3.3.-1.3.5단계를 반복합니다. 나머지 후방 피하 지방 저장소.
4. 장간막 지방 저장소의 분리
   알림: 해부 도구 필요: 스트레이트 본 가위(9cm), 그레이프 집게, #5 겸자, 스트레이트 아이리스 가위, 곡선형 본 가위(9cm).
   1. Graefe 집게를 사용하여 방광 위의 얇은 복막 벽을 들어 올리고 직선 가위로 작은 절개를하십시오.
   2. 관통 된 복강 벽을 천천히 들어 올리고 직선 홍채 가위를 절개 부위에 조심스럽게 삽입하고 방광에서 흉골까지 4-5cm 절개를합니다.
   3. 직선 홍채 가위로 두 개의 1cm 길이의 수평 절개를하여 정중선에서 뒷다리 바로 위와 앞다리 아래까지 측면으로 확장합니다. Graefe 집게를 사용하여 복부 근육계를 벗겨내고 복막 내장을 노출시킵니다.
   4. 1.4.3단계를 반복합니다. 반대편에.
   5. 한 쌍의 #5 집게를 사용하여 내장강에서 장을 들어 올려 장간막 지방을 드러냅니다.
   6. 구부러진 가위와 #5 집게를 사용하여 맹장에서 시작하여 결장이 보이는 곳까지 결장을 따라 지방을 분리합니다.
   7. 맹장으로 돌아가서 구부러진 가위와 #5 집게를 사용하여 소장을 따라 지방을 췌장으로 분리합니다. 장간막 지방을 완전히 분리하기 위해 췌장의 작은 부분을 제거하십시오.
      알림: 장간막 지방과 함께 췌장의 작은 부분을 제거하면 청소하는 동안 안정성을 제공하므로 동맥 청소에 도움이 될 수 있습니다.
   8. 장간막 동맥을 분리 할 준비가 될 때까지 분리 된 장간막 지방을 얼음 위의 hepes 완충액에 보관하십시오.
5. 피하 및 장간막 지방 조직으로부터 각 동맥의 분리
   알림: 해부 도구 필요: 광원이 있는 해부 접시와 입체경, #55 집게 한 쌍, #5 집게 한 쌍.
   1. ~10mL의 차가운 hepes 버퍼를 해부 접시에 넣고 #5 집게를 사용하여 지방 조직을 접시에 옮깁니다.
   2. 1x 배율의 입체경을 사용하여 지방 조직을 보고 배치하여 동맥/정맥 쌍을 노출시킵니다(그림 2).
   3. #55 집게를 사용하여 동맥에서 실질 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 한 번에 작은 지방 조각을 제거하고 스테레오스코프 아래의 동맥/정맥 쌍을 주의 깊게 관찰하여 관심 있는 혈관구조를 식별하고 손상을 방지합니다.
      메모: 그에 따라 배율과 광원을 조정하여 동맥을 청소하십시오. 지방이 제거됨에 따라 동맥을 더 잘 볼 수 있도록 배율과 광도를 높입니다. 동맥의 미세 청소는 4x-5x 배율로 수행해야합니다. 결합 조직 (콜라겐), 정맥 및 동맥을 구별하는 것이 중요합니다. 결합 조직과 콜라겐 섬유는 가지가없는 끈 모양의 모양을 가지고 있으며 줄무늬가 있으며 희끄무레 한 색을 띤다. 콜라겐 섬유 및 결합 조직과 달리 동맥과 정맥은 투명하며 정의 된 내강이있는 여러 가지가 있습니다. 작은 동맥과 정맥은 실질 조직이 없을 때 모양이 비슷하게 보일 수 있습니다. 내강에 혈액이 있으면 정맥에서 동맥을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 정맥은 더 얇은 혈관벽과 더 큰 내강을 가지고 있으며 비슷한 크기의 동맥에 비해 더 많은 혈액을 포함합니다.
   4. 1.5.3단계를 반복합니다. 동맥에 실질 조직 지방 조직이 완전히 없어 질 때까지.
   5. #5 집게를 사용하여 깨끗한 동맥을 신선한 hepes 버퍼가 있는 새 튜브로 옮기고 소화 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오.

2. 내피 세포의 분리를위한 분리 된 동맥의 소화

참고: 내피 세포의 조직 소화 및 분리의 개략도는 그림 2 를 참조하고 프로토콜에 필요한 전체 소모품 목록은 재료 표를 참조하십시오.

1. 각 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 디스파아제와 엘라스타아제 각각 1mg을 추가합니다. 각 튜브에 2mL의 해리 용액을 추가합니다. 와동시키고 완전히 용해될 때까지 37°C에서 배양한다. #5 집게를 사용하여 세척된 동맥(단계 1.5.5.5)을 각 샘플 튜브로 옮깁니다. 각 효소의 최종 농도는 0.5 mg / mL입니다.
2. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하고 10-15 분마다 반전에 의해 부드럽게 교반하여 동맥이 용액에 현탁되어 효소와 동맥 사이의 일관되고 균일 한 접촉을 유지합니다.
3. 샘플당 1mg의 콜라게나제 유형 I을 칭량하여 새 튜브에 추가합니다.
4. 동맥이 튜브 바닥에 정착하도록하십시오. 동맥을 방해하지 않고 상단에서 500μL의 완충액을 제거하고 콜라게나제가 포함된 지정된 튜브로 옮깁니다. 와동하고 용액을 원래 샘플 튜브의 각 샘플로 되돌립니다. 콜라게나제 유형 I의 최종 농도는 0.5 mg / mL입니다.
5. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 샘플 튜브를 잠시 흔든 후 동맥이 조각으로 분리되는지 확인하십시오. 섭동 후 동맥이 조각으로 분리되지 않으면 동맥 파괴가 보일 때까지 5 분 단위로 배양하십시오.
6. 유리 피펫을 사용하여 소화 된 조직을 10x-15x 격렬하게 분쇄하여 세포를 기계적으로 해리시킵니다.
7. 용액과 소화된 조직을 70μm 세포 스트레이너 또는 유세포분석 튜브 스트레이너에 통과시켜 단세포 현탁액을 얻었다.

3. 유세포분석 전 내피세포 염색

참고: 내피 세포의 염색 및 처리는 지시되지 않는 한 세포 생존력을 향상시키기 위해 얼음에서 수행됩니다. 5mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브는 실온(RT)에서 3분 동안 1,163 x g 로 원심분리됩니다.

1. 단일 세포 현탁액을 RT에서 3분 동안 1,163 x g로 원심분리합니다.
2. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 PBS + 5% BSA에 RT에서 30분 동안 재현탁시킨다.
   참고: 연구자들은 세포 유형, 관심 대상 및 사용된 항체^18,19에 따라 FC 수용체 차단을 고려해야 합니다.
3. 1 μL의 세포 생존율 염색 (405 nm 여기) (재료 표)을 추가하고 RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
4. 세포 현탁액을 RT에서 3분 동안 1,163 x g 로 원심분리하고, 세포 펠릿을 200μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시킨다.
5. 샘플에 CD31(CD31-PE, 0.75μg/샘플) 및 CD45(CD45-FITC, 2.5μg/샘플)에 접합된 1차 항체를 추가하고 샘플을 알루미늄 호일로 덮은 후 냉장고의 로커에서 15분 동안 배양합니다.
   참고 : 내피 세포의 순수한 집단을 확인 및/또는 얻으려면 뚜렷한 여기/방출 형광을 갖는 CD31- 및 CD45-접합된 1차 항체를 사용하여 CD31 및 CD45 모두에 대해 프로브하고 CD31⁺CD45^- 발현 프로필을 갖는 세포를 게이트/정렬합니다. 사용된 형광단(18,20,21)에 따라 보상이 필요할 수 있다.
6. 1mL의 PBS + 1% BSA를 세포 현탁액에 직접 첨가하여 세포를 세척합니다.
7. 세포 현탁액을 RT에서 3분 동안 1,163 x g 로 원심분리한다. 상청액을 제거하고 0.1% BSA와 함께 1% 포름알데히드 200μL에 재현탁시킨다. 유세포 분석 준비가 될 때까지 알루미늄 호일로 덮인 냉장고에 보관하십시오.
   알림: 세척 및 원심분리 단계를 줄임으로써 세포 수율이 향상됩니다. 결과 접근 방식에 따라 변경해야 할 수도 있습니다. 정착액의 샘플은 24 시간 이내에 분석해야합니다.

결과

워크플로의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 회로도는 프로토콜 텍스트에 자세히 설명된 프로토콜 단계를 강조 표시합니다. 그림 2는 해부 후 피하 지방 (그림 2A, 왼쪽)과 실질 조직 세척 후 피하 동맥 아케이드 (그림 2A, 오른쪽)의 사진을 보여줍니다. 그림 2는 또한 해부 후 장간막 지방 (그림 2B, 왼쪽)과 실질 조직 세척 후 장간막 동맥 아케이드 (그림 2B, 오른쪽)를 보여줍니다.

여기에 제시된 프로토콜은 a) 기초 과학 접근법 및/또는 질병 모델에서 별개의 지방 저장소 혈관계 층을 비교하고, b) 다운스트림 적용을 위해 관심 있는 혈관 세포를 분리하기 전에 혈관 층의 소화, c) 관심 있는 혈관 세포를 식별하기 위한 유세포분석의 사용에 잠재적으로 관심이 있는 연구자를 돕기 위해 고안되었습니다(그림 3 ) 여기에서 수행된 단백질 발현 분석을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 응용 분야에 사용됩니다(그림 4). 그림 3은 유세포 분석을 사용하여 소화된 마우스 동맥에서 내피 세포를 식별하는 접근 방식의 예를 자세히 설명합니다. 소화된 피하(도 3A) 또는 장간막(도 3B) 지방 동맥으로부터 수득된 세포 제제를 다른 곳에서 유사하게 수행된 바와 같이, 유동 세포분석을 사용하여 생존 가능한 CD31+CD45-내피 세포의 고정 및 동정하기 전에 CD31-PE, CD45-FITC 및 세포 생존율 염료로 염색하였다⁸. 세포 생존율 염색은 고정 전에 분리 및 소화 프로토콜에서 살아남은 생존 가능한 세포만을 식별할 수 있게 했습니다. 이 방법을 사용하면 연구자가 관심있는 생존 가능한 혈관 세포의 발현 또는 기능을 평가할 수 있습니다.

별개의 지방 데포 혈관구조로부터 분리된 내피 세포가 막 단백질 발현의 차이를 나타내는지 확인하기 위해, 분리된 세포는 지방산 트랜스로카제, CD36(도 4)에 대해 프로브를 수행했는데, 이는 이 막 단백질이 최근 조직으로의 내피 매개 지방산 분포에 필수적인 것으로 나타났기 때문이다.²² . 따라서, 예를 들어, 별개의 혈관 층에서 막 CD36 사이의 상대적 발현 차이를 결정하는 것은 a) 상이한 조직 간의 지방산 이용에 대한 차별적 선호도에 관한 기존 데이터를 뒷받침하고/하거나 b) 건강 및 질병에서 지방산의 조직 분포에서 잠재적인 신규한 차이를 밝힐 수 있다. 도 3에 예시된 소화된 혈관 세포의 동일한 제제로부터, CD31+CD45-CD36+ 내피 세포는 피하(도 4A) 및 장간막(도 4B) 지방에서 확인되었고, CD36 발현은 각 혈관층의 이 집단에서 정량화되었다. 도 4C 및 도 4D는 CD36을 발현하는 내피 세포의 백분율 및 CD36 발현의 강도 둘 모두가 장간막 내피 세포에서 관찰된 것과 비교하여 피하 내피 세포에서 더 컸다는 것을 보여준다. 이러한 예비 결과는 혈관 침대 간의 뚜렷한 차이점을 식별하기 위해 우리의 방법론을 사용하는 것을 뒷받침합니다.

그림 1: 다운스트림 적용을 위해 피하 및 내장 지방 조직에서 내피 세포를 분리하는 작업 계획 . (A)10-12주령의 C57BL/6J 마우스를 안락사시키고, 이 절차를 시연하기 위해 사용하였다. (바이) 먼저, 피하 지방이 제거됩니다. (비이) 그런 다음 장간막 (내장) 지방 조직이 연속적으로 제거됩니다. 흰색 점선은 해부 및 제거 후 피하 (왼쪽) 및 장간막 (오른쪽) 지방 저장소의 위치를 나타냅니다. 각 동맥은 다운스트림 적용을 위해 격리됩니다. (C) 이 프로토콜에서, 분리된 동맥은 기능적으로 생존 가능한 내피 세포를 유리시키는 제1 단계로서 특정 효소 칵테일을 사용하여 다음으로 소화된다. (D) 분리된 내피 세포는 유세포분석 전에 접합된 항체를 사용하여 CD31+ 및 CD45- 세포를 프로빙함으로써 확인된다. CD31⁺/CD45^- 의 발현 프로필을 갖는 세포는 추가 분석을 위해 관심 있는 내피 세포이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 분리 된 피하 및 내장 지방 조직과 각 동맥. (A) 왼쪽: 뒷다리에서 분리된 "C자형" 피하 지방 조직. 화살표 (1)로 표시된 피하 지방 동맥의 주요 분지는 실질 실질 지방이 제거 될 때 드러납니다. 오른쪽: 분리된 피하 지방 동맥. (B) 왼쪽: 장간막(내장) 지방 조직이 장에서 분리됩니다. 오른쪽: 각 동맥 아케이드는 실질 조직을 제거하여 분리됩니다. 지방 (5mm)과 동맥 (1mm)의 사진 사이에 다른 비늘이 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 유세포분석을 통한 동맥 조직 소화 후 내피 세포 식별. 분리된 (A) 피하 또는 (B) 장간막 지방 동맥으로부터 유리된 세포를 보여주는 대표적인 플롯. 세포는 고정 전에 CD31 (PE) 및 CD45 (FITC)의 세포외 에피토프를 표적으로 하는 접합된 항체에 노출되었다. 유세포분석은 CD31+CD45-내피 세포 집단을 확인하기 위해 사용되었다. 세포 생존율 염색을 사용하여 후속 분석을 위해 분리 및 소화 프로토콜에서 살아남은 세포만 선택했습니다. 또한, 이 단계에서 적절한 게이팅은 관심 세포 유형의 크기가 알려진 경우 의도된 세포 집단을 오염 세포로부터 추가로 분리할 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 유세포분석을 통한 피하 대 장간막 지방 동맥 내피 세포에서 CD36 막 발현 분석. (A) 피하 또는 (B) 장간막 지방 동맥에서 내피 CD36 (APC) 막 발현을 보여주는 대표적인 인구 플롯 및 히스토그램. (C) 피하 대 장간막 EC에서 CD36을 발현하는 내피 세포 (EC)의 비율 (n = 5, 남성 3 명, 여성 2 명; * p < 0.05 학생의 t- 검정). (D) 피하 대 장간막 지방 동맥에서 표준화 된 EC 막 CD36 발현 (n = 5, 남성 3 명, 여성 2 명; * p < 0.05 학생의 t- 검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

내피 기능 장애는 죽상 동맥 경화증, 고혈압 및 뇌졸중 ^3,23의 발병을 유발할 수있는 심각한 질병 상태의 전조입니다. 주어진 병리학 적 상태에서 내피 기능 장애의 기저에 확인 된 메커니즘은 많지만, 별개의 혈관 층은 병리학 적 상태 ^4,24에 의해 차별적으로 영향을받을 가능성이 있습니다. 또한, 상이한 심혈관 위험 인자 (예를 들어, 비만, 고혈압, 이상 지질 혈증, 흡연, 당뇨병)는 다양한 별개의 메커니즘을 통해 기능 장애를 유도한다^23,25. 따라서 확립된 질병 동물 모델 또는 접근 가능한 인간 조직으로부터 내피 세포 집단을 분리하고 생체 내 환경에서 즉시 제거된 세포에 대한 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 방식으로 세포를 분리하는 것은 배양으로 유도된 표현^{형 변화가 없다는} 점에서 배양에서 세포를 연구하는 것보다 독특한 이점이 있습니다^5,6. 더욱이, 생체내에서 관찰된 바와 같이 이질적인 내피 세포 집단을 포함하여 ^26,27 (유동 보조 세포 분류를 사용하여 추가로 분리될 수 있음), 살아있는 유기체로부터 생체내 환경을 더 잘 알려준다. 마지막으로, 이 방법은 수많은 동물 모델 및 잠재적으로 인간 조직의 조사에 적용할 수 있으며 그러한 필요성이 보증되는 경우 일차 세포 배양 라인을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 중요한 단계, 그리고 여기에 제시되지 않은 상이한 혈관 층 또는 세포 유형에 대해 가장 조정이 필요한 단계는 혈관 조직의 소화이다. 이 단계는 세포 수율을 감소시키지 않고 세포 건강에 최적화되어야 합니다. 사용된 특정 효소와 분해 기간은 다운스트림 분석을 적절하게 수행할 수 있도록 세포 건강과 수율을 최적화하는 데 중요합니다. 피하 및 장간막 내피 세포에서 유세포 분석에 의해 검출 된 CD36의 막 발현의 확인을 위해 (그림 4), 원래 패치 클램프 전기 생리학⁽²⁸ )을 위해 설계된 소화 프로토콜의 수정 된 버전이 개발되었습니다. 여기에는 콜라겐 분해 효소 I 분해 시간을 30분으로 연장하여 유세포분석의 요구 사항과 패치 클램프 연구에 필요한 요구 사항을 더 잘 충족하기 위해 세포 수율을 높이는 것이 포함되었습니다. 이 변형은 세포 건강에 어느 정도 영향을 미칠 수 있으므로 유세포 분석 분석에 세포 생존율 염색을 사용하여 이 프로토콜에 따라 생존 가능한 내피 세포만 평가했는지 확인했습니다(그림 3). 혈관 조직에서 세포를 분리하기위한 연구에는 원하는 접근법을 평가하기 전에 세포 생존율에 대한 마커가 포함되어야합니다.

기술된 프로토콜은 마우스로부터 유래된 ≤1mg 동맥 샘플로부터 분석 및 다운스트림 적용을 위해 생존가능한 내피 세포를 유리시키기에 충분하고; 그러나 관심 동맥이 상당히 다른 동맥 덩어리를 초래할 수 있는 다른 조직 또는 유기체(예: 인간)로부터 분리되어야 하는 경우 관심 세포 집단을 효율적으로 분리하기 위해 소화 효소 함량과 배양 기간을 최적화해야 합니다. 여기에 제시된 피하 및 장간막 층보다 훨씬 적은 양의 출발 조직으로 시작하는 일부 혈관 층 (예를 들어, 관상 동맥)의 경우, 샘플 당 여러 마우스로부터의 동맥 풀링이 필요할 수 있습니다. 실제로, 이것은 결과 접근법이 상대적으로 높은 세포 수율을 요구한다는 점을 감안할 때 임의의 주어진 혈관 층에 필요한 단계일 수 있다. 주요 한계는 샘플 분해당 변동의 특성으로 인해 세포 수율이 동일한 혈관 층에서 나온 경우에도 배치마다 크게 다를 수 있다는 것입니다. 이로 인해 데이터를 분석할 때 문제가 발생할 수 있으며 적절한 경우 정규화를 통해 고려해야 합니다. 예를 들어, CD36 발현은 피하 및 장간막 지방 동맥의 개별 샘플에 걸친 세포 수율의 변화로 인해 원시 데이터에서 매우 가변적이었습니다. 따라서 원시 데이터는 이 방법이 배치 차이를 보정한다는 가정하에 CD31+CD45− 평균 형광 강도로 정규화되었습니다(그림 4). 물론 접근 방식에 따라보다 정교한 통계 분석 및 정규화 방법이 필요할 수 있습니다.

요약하면, 이 논문은 관심 있는 내피 표적의 발현 및/또는 기능을 조사하기 위해 마우스로부터 피하 및 장간막 동맥을 해부, 분리 및 소화하는 방법을 제시한다. 제시된 프로토콜에 대한 변형으로, 상이한 혈관 층 및 세포 유형 (예를 들어, 평활근 세포)이 조사될 수 있다. 이 프로토콜은 사용 가능한 수많은 실험적 접근 방식의 기초로서 혈관 세포 생물학 및 혈관 기능 장애 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue dissection tools
5 forceps (2)	Fine Science Tools	11252-00	For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer
55 forceps (2)	Fine Science Tools	11295-51	For parenchymal adipose removal
Curved Bonn scissors	Fine Science Tools	14061-10	For isolation of mesenteric adipose depot
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot
Straight Bonn scissor	Fine Science Tools	14060-09	For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot
Stereoscope with light source	Laxco	Z230PT40	For parenchymal adipose removal and artery isolation
Digestive enzymes for Artery Digestion
Collagenase Type I	Wothington-BioChem	LS004194
Dispase (Neutral Protease)	Wothington-BioChem	LS02110
Elastase	Wothington-BioChem	LS002292
Solutions Recipes
HEPES Buffer, pH 7.4			Final concentration
Calcium chloride dihydrate	J.T.Baker	1332-1	2 mM
Dextrose (D-glucose) anhydrous	Fisher	D16-500	10 mM
HEPES	Fisher	BP310-500	10 mM
Magnesium Chloride	Fisher	M33-500	1 mM
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	5 mM
Sodium chloride	Oxoid	LP0005	145 mM
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40
Dextrose (D-glucose) anhydrous	Fisher	D16-500	10 mM
HEPES	Fisher	BP310-500	10 mM
Magnesium Chloride	Fisher	M33-500	2 mM
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	56 mM
Sodium chloride	Oxoid	LP0005	55 mM
Sodium L-Glutamate monohydrate	TCI	G0188	80 mM
Flow Cytometry Analyses
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
CD31-PE	Miltenyi Biotec	130-119-653	0.75µg/sample
CD36-APC	R&D Systems	AF2519	2.5µg/ sample
CD45-FITC	BioLegend	103108	2.5µg/ sample
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain)	Invitrogen	L34955	1µL/sample