Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Caenorhabditis elegans funge da eccellente sistema modello con metodi robusti e a basso costo per il rilevamento della durata della salute, della durata della vita e della resilienza allo stress.

Abstract

La scoperta e lo sviluppo di Caenorhabditis elegans come organismo modello è stato influente in biologia, in particolare nel campo dell'invecchiamento. Molti studi storici e contemporanei hanno identificato migliaia di paradigmi che alterano la durata della vita, tra cui mutazioni genetiche, espressione genica transgenica e ormesi, un'esposizione benefica e di basso grado allo stress. Con i suoi numerosi vantaggi, tra cui una breve durata, una manutenzione facile e a basso costo e un genoma completamente sequenziato con omologia a quasi i due terzi di tutti i geni umani, C. elegans è stato rapidamente adottato come modello eccezionale per la biologia dello stress e dell'invecchiamento. Qui, vengono esaminati diversi metodi standardizzati per misurare la durata della vita e la durata della salute che possono essere facilmente adattati a quasi tutti gli ambienti di ricerca, in particolare quelli con attrezzature e fondi limitati. L'incredibile utilità di C. elegans è caratterizzata, evidenziando la capacità di eseguire potenti analisi genetiche nella biologia dell'invecchiamento senza la necessità di ampie infrastrutture. Infine, i limiti di ciascuna analisi e gli approcci alternativi sono discussi per la considerazione.

Introduzione

Fin dai tempi della pubblicazione di "The genetics of Caenorhabditis elegans", uno degli articoli più influenti di Sydney Brenner nel 1974, questo verme microscopico è stato considerato un eccezionale sistema modello per studiare i misteri biologici¹. Nel 1977, Michael R. Klass pubblicò il metodo per misurare la durata della vita di C. elegans e stabilì questo sistema modello per studiare l'invecchiamento². L'indagine per comprendere la relazione tra stress e longevità è iniziata con l'identificazione di una singola mutazione nel gene age-1, che ha portato a un'estensione della durata della vita in C. elegans³. Inoltre, studi contemporanei hanno identificato altre mutazioni che aumentano la durata della vita, che hanno rivelato vermi mutanti longevi che mostrano una maggiore resistenza allo stress ^4,5,6. Con i suoi numerosi vantaggi tra cui una breve durata della vita, una facile manutenzione, un genoma completamente sequenziato contenente omologia a circa due terzi di tutti i geni umani che causano malattie, disponibilità e facilità di utilizzo delle librerie di interferenza dell'RNA (RNAi) e somiglianza fisiologica con gli esseri umani ^7,8,9, C. elegans è stato rapidamente adottato come modello eccezionale per la biologia dello stress e dell'invecchiamento.

Forse le maggiori utilità di C. elegans sono il suo costo estremamente basso di manutenzione, la facilità di sperimentazione e la varietà di strumenti genetici disponibili per gli studi. C. elegans sono tipicamente coltivati su un terreno di agar solido con una fonte di cibo E. coli. Due ceppi di E. coli comunemente usati sono OP50 standard, un ceppo B che è forse il¹⁰ più comunemente usato, e HT115, un ceppo K-12 che viene utilizzato principalmente per gli esperimenti RNAi^11,12. Il ceppo HT115 K-12 porta una delezione nella RNAIII RNasi, una mutazione essenziale per i metodi RNAi, in cui vengono utilizzati plasmidi che esprimono dsRNA corrispondenti ai singoli geni C. elegans. I vettori di alimentazione dsRNA consentono un robusto abbattimento dei geni di C. elegans senza la necessità di incroci complessi o di editing del genoma, poiché i batteri che trasportano questi plasmidi possono essere alimentati direttamente ai nematodi. Migliaia di questi vettori RNAi batterici esistono nello sfondo HT115, tra cui la più popolare libreria Vidal RNAi con > 19.000 singoli costrutti RNAi¹³ e la libreria Ahringer RNAi con 16.757 costrutti RNAi¹⁴. Tuttavia, le diete batteriche OP50 e HT115 hanno grandi differenze nel profilo metabolico, comprese le differenze nella vitamina B12^15,16. Pertanto, si raccomanda di eseguire tutti gli esperimenti su una singola fonte batterica, se possibile, per evitare interazioni gene-dieta che possono introdurre più fattori confondenti come descritto in precedenza 17,18,19. A causa della sua facilità, gli animali sono mantenuti su OP50 per tutte le condizioni sperimentali qui descritte, ma tutti gli esperimenti vengono eseguiti su HT115 come precedentemente descritto²⁰. In breve, gli animali vengono mantenuti a OP50 e trasferiti alla post-sincronizzazione HT115 (dopo lo sbiancamento) per coerenza tra esperimenti RNAi e non RNAi. In alternativa, un ceppo OP50 competente per l'RNAi che porta una delezione simile di RNAIII RNasi trovato nel ceppo E. coli K12 HT115 può anche essere usato²¹.

Forse una delle principali limitazioni agli esperimenti RNAi in C. elegans è la preoccupazione dell'efficienza di abbattimento. Mentre l'efficienza di abbattimento può essere convalidata tramite qPCR o western blotting, questi richiedono attrezzature e reagenti costosi e sono limitati all'analisi di massa. Questo è ancora più preoccupante guardando a cellule specifiche, come i neuroni, che sono refrattarie (meno sensibili) all'RNAi. Mentre l'efficienza dell'RNAi in cellule specifiche può essere migliorata attraverso la sovraespressione di SID-1, la proteina transmembrana essenziale per l'assorbimento del dsRNA²², questo è ancora limitato ai modelli di espressione specifici del tipo cellulare dei promotori utilizzati per questi costrutti, e quindi i knockout e le mutazioni geniche sono i mezzi più infallibili per esaurire le funzioni geniche. Oltre al knockdown mediato da RNAi, C. elegans è anche altamente suscettibile all'editing del genoma con strategie basate su CRISPR ^23,24,25 e sovraespressione di costrutti transgenici attraverso microiniezioni, con la possibilità di integrare costrutti transgenici attraverso l'irradiazione o l'integrazione basata su trasposoni 26,27,28,29 . Tuttavia, questi metodi richiedono costose apparecchiature di microiniezione e l'alto costo degli RNA guida o dell'enzima Cas9 può vietare questi metodi in istituti con finanziamenti limitati. Invece, migliaia di linee transgeniche e mutanti sono prontamente disponibili per pochi dollari sia presso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) che presso il National Bioresource Project (NBRP). L'NBRP offre mutanti isolati per un gran numero di geni di C. elegans, inclusi ceppi mutanti pubblicati e quindi verificati, mutanti derivati da progetti pilota e mutanti che devono ancora essere caratterizzati. Al contrario, CGC è un depositario di linee C. elegans per lo più pubblicate e stabilite dalla comunità di ricerca. Entrambi spediscono ceppi in tutto il mondo a prezzi molto ragionevoli e offrono un'ampia varietà di opzioni per coloro che hanno una capacità limitata di sintetizzare ceppi internamente.

Qui, viene offerta una raccolta di metodi curata, che probabilmente sono i metodi più economici per l'analisi della durata della vita e della durata della salute in C. elegans. Tutti i metodi qui presentati richiedono attrezzature e forniture a basso costo e utilizzano solo ceppi prontamente disponibili dal CGC. Forse la cosa più proibitiva per i test di longevità e sopravvivenza in C. elegans è il costo delle piastre di Nematode Growth Media (NGM). Poiché C. elegans sono ermafroditi e si autofecondano, i test di sopravvivenza standard richiedono che gli animali adulti siano continuamente allontanati dalla loro progenie per evitare la contaminazione dalla prole. Non solo questo processo richiede molto tempo, ma può diventare costoso a causa della necessità di circa 100 piastre per condizione per eseguire un singolo test di durata. Qui vengono fornite due alternative: l'utilizzo del mutante senza linea germinale sensibile alla temperatura, glp-4 (bn2) o la sterilizzazione chimica con 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR). glp-4 codifica per una valil amminoacil tRNA sintetasi e il glp-4(bn2) sensibile alla temperatura è carente di riproduzione a temperature restrittive a causa della diminuzione della traduzione proteica^30,31. FuDR è un metodo robusto per sterilizzare chimicamente C. elegans impedendo la replicazione del DNA, inibendo così la riproduzione³². Sebbene il FUDR possa essere proibitivo per alcuni laboratori, è necessaria solo una piccola quantità per sterilizzare chimicamente i vermi e la sua stabilità in polvere può renderlo fattibile per la maggior parte dei gruppi. L'utilizzo del mutante glp-4(bn2) sensibile alla temperatura è certamente l'opzione più economica, in quanto l'unico requisito è un'incubatrice per spostare gli animali ai restrittivi 25 °C; tuttavia, va notato che la crescita a 25 °C può causare un lieve stress termico ^33,34. Indipendentemente dal metodo, l'uso di animali sterili può ridurre significativamente i costi dei materiali di consumo necessari per i test relativi all'età.

Per studiare l'invecchiamento, i saggi standard della durata della vita sono convenzionali in quanto i paradigmi che alterano la longevità hanno un impatto diretto sull'invecchiamento. Tuttavia, le misurazioni della durata della salute e della tolleranza allo stress presentano ulteriori informazioni sulla salute dell'organismo. Qui, vengono offerti diversi metodi per misurare la durata della salute: 1) fecondità come misura della salute riproduttiva; 2) dimensione della covata come misura della salute dello sviluppo e della vitalità della prole deposta; e 3) comportamento locomotore come misura della funzione muscolare e della motilità, entrambi direttamente correlati con l'invecchiamento. Inoltre, vengono offerti saggi di tolleranza allo stress: sopravvivenza allo stress ER, stress mitocondriale / ossidativo e sopravvivenza allo stress termico. Infatti, gli animali con maggiore resistenza allo stress ER^35,36, allo stress mitocondriale³⁷ e allo stress termico³⁸ mostrano una maggiore durata della vita. Lo stress ER viene applicato esponendo C. elegans alla tunicamicina, che blocca la glicosilazione legata all'N e causa l'accumulo di proteine mal ripiegate³⁹. Lo stress mitocondriale/ossidativo è indotto dall'esposizione al paraquat, che induce la formazione di superossido in particolare nei mitocondri⁴⁰. Lo stress termico viene applicato attraverso l'incubazione di animali a 34-37 °C^33,41. Tutti i test qui descritti possono essere eseguiti con attrezzature e fondi minimi e offrono una varietà di strumenti per studiare l'invecchiamento in diversi gruppi.

Protocollo

1. Crescita e mantenimento di C. elegans

1. Versare piastre di nematodi di crescita (NGM)
   1. Coltiva C. elegans su piastre di agar standard al 2% con nematode Growth Media (NGM) composto da 1 mM CaCl₂, 5 μg / mL di colesterolo, 25 mM KPO₄ (pH 6,0), 1 mM MgSO₄, 0,25% p / v Peptone e 51,3 mM NaCl.
   2. Per 1 L di piastre di NGM-agar, misurare 2,5 g di Peptone, 3,0 g di NaCl e 20 g di agar in un pallone da 1 L con una barra di agitazione.
      NOTA: Si consiglia di standardizzare una specifica fonte di agar, poiché abbiamo visto la variabilità nella rigidità tra le marche, che può influire sulla riproducibilità. Qui, Bacto-Agar è strettamente usato. Inoltre, si consiglia di aggiungere l'agar direttamente nel pallone da autoclavare, poiché l'agar non si dissolve completamente senza riscaldamento e il trasferimento della soluzione contenente agar comporterà la perdita di agar e errori di concentrazione.
   3. Aggiungere dH₂O fino a 970 ml.
      NOTA: 30 ml di additivi liquidi post-sterilizzazione porteranno il volume finale a 1 L. Nelle nostre mani, saranno necessari ~ 951 mL di dH₂O per raggiungere 970 mL del volume finale.
   4. Sterilizzare la soluzione NGM-agar utilizzando un'autoclave standard o uno sterilizzatore a fluido per una sterilizzazione efficiente.
      NOTA: A questo punto, l'NGM-agar sterile può essere conservato per diversi mesi a temperatura ambiente. Se conservato, NGM-agar può essere recuperato in un forno a microonde con impulsi di 15-45 s per evitare che la soluzione bolle o in un bagno d'acqua riscaldato.
   5. Lasciare mescolare la soluzione fino a quando non si raffredda a 60-75 °C. Mescolare durante il raffreddamento è importante per evitare un raffreddamento irregolare, che potrebbe causare la solidificazione di alcuni agar.
   6. Mentre la soluzione si raffredda, riscaldare un bagno d'acqua o un bagno di perline a 65-70 °C.
   7. Una volta che la soluzione si raffredda a 60-75 °C, aggiungere additivi liquidi: 2,0 mL di 0,5 M CaCl₂, 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo, 25 mL di 1 M KPO₄ (pH 6,0) e 0,5 M MgSO₄ (vedere tabella 1 per le ricette per tutti i reagenti) e lasciare che la soluzione si mescoli per ~ 5 minuti per garantire la miscelazione completa.
      NOTA: I farmaci possono anche essere inclusi nelle piastre qui (ad esempio, aggiungere 1 mL di 100 mg / mL di carbenicillina e 1 mL di 1 M IPTG; aggiungere 10 mL di 2,5 mg / mL di tunicamicina; aggiungere 10 mL di 400 mM di paraquat).
   8. Immergere il pallone contenente NGM-agar in un bagno d'acqua a 65-70 °C per evitare che nGM-agar si solidifichi durante il versamento in piastre.
   9. Pipettare 9-11 mL di soluzione in ogni piastra da 60 mm o 20-30 mL di soluzione in ogni piastra da 100 mm.
      NOTA: si consiglia di utilizzare il più piccolo volume di pipetta disponibile per evitare perdite NGM causate dall'espansione dell'aria nella pipetta. Pipettare fino a 1-2 ml di materiale in più di quello che verrà aggiunto a ciascuna piastra per evitare di svuotare completamente la pipetta aiuterà a prevenire la formazione di bolle. In alternativa, le piastre possono essere versate a mano direttamente dalla bottiglia in una piastra, ma il pipettaggio è altamente raccomandato per garantire piastre con lo stesso volume. Piastre di volume uguale sono importanti per garantire concentrazioni simili di soluzioni quando si utilizzano metodi in cui le soluzioni sono applicate direttamente sopra una piastra (vedere punto 1.1.17). Volumi uguali consentono anche una facile microscopia per mantenere un piano focale simile su tutte le piastre.
   10. Riposizionare la pipetta nella soluzione riscaldata per mantenere la temperatura e impedire che NGM-agar si solidifichi.
   11. Ripeti i due passaggi precedenti per tutte le piastre.
   12. Lasciare che le piastre NGM-agar si solidifichino durante la notte.
   13. Dopo che le piastre si sono solidificate, conservare le piastre per un massimo di 3 mesi a 4 °C o passare al punto 1.1.14 per seminare le piastre con batteri. Conservare le piastre in contenitori sigillati per aiutare a trattenere l'umidità per mantenere la qualità della piastra.
   14. Coltivare una coltura di OP50 in brodo di lisogenia (LB) o mezzi equivalenti a scelta per 24-48 ore a temperatura ambiente (~ 22-25 °C) o coltivare una coltura di HT115 in LB + antibiotici (ampicillina / carboidrati + tetraciclina è raccomandata per HT115) con agitazione a 37 ° C per 12-16 ore.
       NOTA: Si raccomanda di coltivare OP50 a temperatura ambiente perché è stata riscontrata una crescita più aggressiva di OP50 a 37 °C, che influisce sulla durata della vita di C. elegans . Al contrario, HT115 ha un tasso di crescita più lento e rende le colture meno dense; pertanto, si raccomanda di coltivare HT115 a 37 °C con agitazione.
   15. Seminare un volume di 100-200 μL di una coltura OP50/HT115 satura su una piastra da 60 mm o 1 mL per una piastra da 100 mm.
   16. Lasciare asciugare le piastre durante la notte su un banco e lasciare asciugare un giorno in più se le piastre sono ancora bagnate. Conservare i piatti in contenitori sigillati a 4 °C per ~2 mesi.
   17. Facoltativo: aggiungere i farmaci direttamente sulle piastre di NGM-agar seminate (ad esempio, 100 μL di soluzione FUDR da 10 mg / mL) per sterilizzare chimicamente i vermi.
2. Mantenimento delle scorte di C. elegans
   1. Etichettare correttamente il fondo di una piastra NGM-agar seminata. Etichettare i bordi sul fondo della piastra per evitare di ostruire il passaggio della luce sui microscopi di dissezione standard.
   2. Utilizzando un microscopio di dissezione standard, raccogliere i batteri di scelta sul plettro C. elegans .
      NOTA: In questo protocollo, è stato utilizzato un plettro composto da un filo di platino/iridio al 90%/10% attaccato all'estremità di una pipetta Pasteur di vetro.
   3. Usando i batteri, raccogli 10-20 uova, animali L1, L2 o L3 e trasferiscili su una piastra NGM-agar appena etichettata.
      NOTA: È meglio raccogliere animali più giovani; nell'esperienza degli autori, per gli animali selvatici standard, lo spostamento di 10-20 uova / animale giovane consentirà alla piastra di crescere a 15 ° C senza fame. Per gli animali transgenici o mutanti con ridotta fecondità, più animali dovrebbero essere spostati nella piastra.
   4. Per gli animali con fecondità selvatica e cresciuti a 15 °C, ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.3 ogni 7 giorni per mantenere uno stock settimanale. Per gli animali cresciuti a 20 °C, ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.3 ogni 4-5 giorni per evitare la fame.
3. Sincronizzazione dei worm via candeggio
   NOTA: una piastra NGM-agar piena da 60 mm (ad esempio, piastre di riserva di 1 settimana coltivate a 15 °C) fornirà un numero sufficiente di animali per la maggior parte dei saggi standard descritti. Generalmente, un adulto gravido (adulto pieno di uova) fornirà 10-15 uova⁴², e una piastra NGM-agar piena da 60 mm ha ovunque da 100-200 adulti gravidi, fornendo ~ 1000-2000 uova.
   1. Per esperimenti su larga scala che richiedono più animali, tagliare un NGM-agar da 60 mm in quattro o sei pezzi uguali e tagliarli su piastre seminate da 100 mm per l'espansione.
      NOTA: Qui, il chunking si riferisce al taglio di un pezzo della piastra NGM-agar contenente vermi e allo spostamento dell'intero pezzo di agar + vermi su una nuova piastra, lato verme verso il basso per consentire ai vermi di strisciare sulla nuova piastra. Come quadro di riferimento, gli animali con fecondità selvatica produrranno una piastra completa di 100 mm se coltivati a 20 ° C per 2-3 giorni dopo la staccatura.
   2. Per iniziare a raccogliere i nematodi, versare una piccola quantità di soluzione M9 (Tabella 1) su piastre contenenti vermi, facendo attenzione a non riempire eccessivamente la capsula di Petri. Ruotare delicatamente la soluzione M9 per allentare i vermi dai prati batterici.
   3. Raccogliere vermi adulti gravidi con una pipetta sierologica, facendo attenzione a non perforare l'agar con la punta della pipetta.
      NOTA: Si raccomandano pipette sierologiche in vetro, poiché C. elegans tende ad aderire alla plastica. Se le pipette di vetro non sono disponibili, si consiglia di iniziare con un numero maggiore di animali del necessario, poiché alcuni andranno persi a causa dell'attaccamento alle pipette di plastica.
   4. Pellet gli animali mediante centrifugazione per 30 s a 1.100 x g. Aspirare il surnatante.
      NOTA: Il pellet C. elegans è molto sciolto, quindi fare attenzione a non agitare o interrompere il pellet durante l'aspirazione del surnatante.
   5. Mentre gli animali stanno centrifugando, preparare 5 ml di soluzione sbiancante per ceppo (vedere tabella 1 per i dettagli della ricetta); per 5 mL di soluzione, mescolare 1,5 mL di ipoclorito di sodio al 6% (candeggina), 0,75 mL di 5 M NaOH o KOH e 2,75 mL di dH₂O.
      ATTENZIONE: L'ipoclorito di sodio e le soluzioni di idrossido ad alta concentrazione sono corrosivi e pertanto si consiglia di indossare guanti e un camice da laboratorio durante la manipolazione.
   6. Aggiungere 5 mL di soluzione sbiancante alla miscela di pellet di vite senza fine/M9.
   7. Controllare i vermi sotto un microscopio sezionante ogni pochi minuti fino a quando tutti i corpi dei vermi adulti sono stati sciolti e solo le uova sono rimaste nel mix. Agitare vigorosamente il mix di vermi/candeggina per accelerare il processo di sbiancamento.
      NOTA: Lasciare le uova all'interno di una miscela di candeggina per lunghi periodi comporterà il danneggiamento delle uova e influenzerà la vitalità degli animali. Per gli animali selvatici, lo sbiancamento di solito richiede 4-6 minuti con agitazione. Pertanto, si consiglia di controllare gli animali al microscopio a intervalli di 30 secondi a partire dal segno di 4 minuti.
   8. Pellet le uova facendo girare la miscela uovo/candeggina per 30 s a 1.100 x g.
      NOTA: circa 15 mL di tubi conici hanno linee di pendenza all'interno del tubo. Per questi tubi, si consiglia di far girare le uova a una velocità maggiore (ad esempio, 30 s a 2.000 x g) per garantire che le uova si depositino sul fondo del tubo e non rimangano su linee di pendenza.
   9. Aspirare la soluzione sbiancante.
      NOTA: un pellet d'uovo è più rigido di un pellet di verme, ma può comunque essere interrotto facilmente. Quindi, fare attenzione a non scuotere il tubo dopo la centrifugazione.
   10. Lavare le uova aggiungendo la soluzione di M9 fino a 15 ml e invertendo il tubo quattro o cinque volte per assicurarsi che le uova siano completamente disperse nella soluzione M9.
   11. Pellet di uova mediante centrifugazione per 30 s a 1.100 x g e aspirazione della soluzione M9.
   12. Ripeti i due passaggi precedenti per un totale di quattro lavaggi per eliminare qualsiasi candeggina dalla miscela di uova.
   13. Risospendare le uova in 100 μL a 2 mL di soluzione M9 (cioè, a seconda del numero totale di vermi sbiancati) dopo il lavaggio finale. Agitare accuratamente le uova per rompere i ciuffi e assicurarsi che il pellet sia completamente risospeso.
   14. In alternativa, gli animali possono essere arrestati L1 per una sincronizzazione temporale più stretta; per l'arresto di L1, aggiungere la soluzione M9 al pellet d'uovo a ~ 10 ml in un tubo conico da 15 ml. Lasciare che i vermi girino in un rotatore per un massimo di 24 ore a 20 °C o temperatura ambiente. Gli animali L1 generalmente impiegano mezza giornata in meno per raggiungere l'età adulta rispetto ai tempi delle uova descritti nel passaggio 1.3.16.
   15. Approssimare la concentrazione di uova (o concentrazione di L1; vedere fase 1.3.14) pipettando 4 μL di miscela di uova/M9 su una piastra NGM seminata con batteri. Conta e calcola quante uova sono presenti per μL placcato. Ripeti il conteggio tre o quattro volte per migliorare l'approssimazione.
       NOTA: l'approssimazione della concentrazione di uova garantirà che siano placcati un numero sufficiente di animali per una dimensione del campione appropriata per gli esperimenti senza sovrapposizione, il che causerà la fame.
   16. Sulla base dell'approssimazione, placcare il numero appropriato di uova su piastre NGM-agar seminate con batteri di scelta. Per le piastre OP50, placcare un massimo di 200 animali su una piastra da 60 mm e 1.000 animali su una piastra da 100 mm. Per le piastre HT115, placcare un massimo di 150 animali su una piastra da 60 mm e 600 animali su una piastra da 100 mm.
       NOTA: questi sono numeri approssimativi basati sulle nostre condizioni di laboratorio e i numeri possono cambiare in base allo spessore del prato batterico. Le uova coltivate a 15 °C impiegheranno ~ 5 giorni per raggiungere il giorno 1 in età adulta (~ 140 ore per raggiungere lo stadio massimo di deposizione delle uova e gravido adulto). Le uova coltivate a 20 °C impiegheranno ~ 4 giorni per raggiungere il giorno 1 in età adulta (~ 96 ore per raggiungere lo stadio massimo di deposizione delle uova, gravido adulto). Le uova coltivate a 25 °C impiegheranno ~ 3,5 giorni per raggiungere il giorno 1 in età adulta (~ 62 ore per raggiungere lo stadio massimo di deposizione delle uova, gravido adulto).
4. Deposizione delle uova come metodo alternativo per sincronizzare le popolazioni di C. elegans
   1. Se i protocolli di sbiancamento non sono fattibili (ad esempio, nessuna centrifuga disponibile), come metodo alternativo per sincronizzare le popolazioni di C. elegans, eseguire una procedura di deposizione delle uova. Tieni presente che questo protocollo è più laborioso e si tradurrà in minori rese di animali.
   2. Per la deposizione delle uova, posizionare 8-12 adulti gravidi su una piastra standard di Agar NGM seminata con batteri di scelta e documentare il numero esatto di animali posti su un piatto.
      NOTA: le procedure di deposizione delle uova devono essere eseguite alla temperatura che verrà utilizzata per la sperimentazione.
   3. Consentire agli animali di deporre le uova per 4-8 ore.
      NOTA: La durata in cui gli animali vengono lasciati sulla piastra può essere regolata quando necessario. Ad esempio, un numero maggiore di animali può essere messo su un piatto per una durata di deposizione delle uova più breve quando è disponibile meno tempo. C. elegans generalmente depone le uova a raffica, che possono essere stimate ad un tasso di circa cinque uova/h per gli animali con fecondità selvatica⁴³. Seguire le raccomandazioni nel passaggio 1.3.16 per evitare di sovrapporre gli animali.
   4. Rimuovere tutti gli animali adulti dal piatto.
      NOTA: Tutti gli animali adulti rimasti sul piatto continueranno a deporre le uova, con conseguente popolazione non sincronizzata.
   5. Metti le uova a 15 °C per ~ 5 giorni o 20 ° C per ~ 4 giorni per raggiungere il giorno 1 in età adulta.

2. Misurare la longevità in C. elegans

1. Durata standard
   1. Preparare piatti NGM-agar seminando piastre con 100 μL di batteri di scelta. Per coerenza, assicurarsi che gli stessi batteri vengano utilizzati in tutte le repliche. Poiché i vermi vengono spostati ogni giorno durante le fasi di deposizione delle uova dell'età adulta, seminano da cinque a sette serie di piastre NGM-agar per tutta la durata della vita e da due a quattro piastre per ceppo per far crescere gli animali fino all'età adulta (cioè, se si usano otto piastre di 15 animali per tutta la durata della vita, è necessario seminare 40-56 piastre per condizione).
   2. Lasciare asciugare le piastre durante la notte prima della conservazione.
      NOTA: Si raccomanda di conservare le piastre a 4 °C e di rimuovere quotidianamente il numero richiesto di piastre dalla cella frigorifera per evitare che i batteri creino prati spessi che possono rendere difficile lo spostamento / conteggio della durata della vita. Assicurarsi che le piastre siano riscaldate prima di placcare i vermi.
   3. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4.
   4. Spostare 10-15 giorni 1 animali adulti su 8-12 piatti ciascuno. Per una durata di vita standard, inizia con ~ 120 animali per assicurarti che le dimensioni del campione non scendano troppo al di sotto di 100 dopo eventi di censura (ad esempio, otto piastre di 15 animali = 120 animali; 12 piastre di 10 animali = 120 animali).
      NOTA: Nel caso attuale, 10-15 animali sono un numero gestibile per la maggior parte degli investigatori, sebbene sei piastre di 20 animali siano anche fattibili per ridurre il costo dei materiali di consumo.
   5. Per i primi 7-8 giorni o fino a quando la progenie non è più visibile, allontana gli animali adulti dalla loro progenie ogni 1-2 giorni.
      NOTA: gli animali possono essere spostati a giorni alterni per risparmiare materiali, ma bisogna fare attenzione a garantire che le uova / animali larvali non vengano trasferiti con l'adulto per prevenire la contaminazione delle popolazioni adulte con la progenie. In questo studio, il metodo più semplice è quello di spostare gli animali ogni giorno dai giorni 1-3 quando la deposizione delle uova è al massimo, e quindi passare a spostare gli animali a giorni alterni per giorni 5-8 quando la deposizione delle uova è minima. Con questo metodo, non è imperativo impedire il trasferimento di uova / animali larvali durante i giorni 1-3 poiché gli adulti verranno spostati ogni giorno e le uova / larve non possono svilupparsi fino all'età adulta in 1 giorno.
   6. Dopo che gli animali hanno smesso di produrre progenie, segna la durata della vita a giorni alterni fino a quando tutti gli animali sono stati valutati come morti o censurati. Rimuovi tutti gli animali morti o censurati dal piatto per evitare confusione e raccontando lo stesso animale.
      NOTA: la morte viene segnata come animali che non mostrano alcun movimento quando vengono toccati delicatamente con un plettro. La censura è segnata come animali che sono insaccati, mostrano sporgenze vulvari / intestinali o strisciati fino ai lati del piatto dove si disidratano.
2. Durata della vita con sterilizzazione chimica tramite FUDR
   1. Preparare piatti NGM-agar seminando piastre con 100 μL di batteri di scelta. Per coerenza, assicurarsi che gli stessi batteri vengano utilizzati in tutte le repliche. Semina 8-12 piastre per ceppo per esperimenti di durata della vita e da due a quattro piastre per ceppo per far crescere gli animali fino all'età adulta. Lasciare asciugare le piastre durante la notte.
   2. Aggiungere 100 μL di FUDR da 10 mg / mL al centro del prato batterico per le 8-12 piastre che verranno utilizzate per il test della durata della vita. Ricorda di lasciare da due a quattro piastre senza FUDR come piastre di avviamento per consentire agli animali di crescere fino all'età adulta. Lasciare asciugare i piatti durante la notte.
      ATTENZIONE: FUDR blocca la sintesi del DNA, e quindi si consiglia di indossare guanti durante la manipolazione.
   3. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4.
      NOTA: questi animali devono essere coltivati su piastre senza FUDR, poiché il FUDR causerà l'arresto / morte degli animali.
   4. Spostare 10-15 giorni 1 animali adulti su 8-12 piastre ciascuna, contenenti FUDR. Per una durata di vita standard, inizia con ~ 120 animali per assicurarti che le dimensioni del campione non scendano troppo al di sotto di 100 dopo eventi di censura (ad esempio, otto piastre di 15 animali = 120 animali; 12 piastre di 10 animali = 120 animali).
      NOTA: Gli animali possono anche essere spostati su FUDR allo stadio L4 se è imperativo evitare completamente la formazione della progenie, ma gli animali non devono essere spostati troppo presto in quanto ciò causerà un rischio maggiore di protrusioni vulvali / intestinali e aumenterà la censura.
   5. Segna la durata della vita a giorni alterni fino a quando tutti gli animali non sono stati valutati come morti o censurati. Rimuovi tutti gli animali morti o censurati dal piatto per evitare confusione e raccontando lo stesso animale.
      NOTA: per la durata della vita fudr, qualsiasi progenie può essere ignorata in quanto si arresterà allo stadio L1 e alla fine morirà.
3. Durata della vita con mutanti sterili sensibili alla temperatura
   1. Preparare piatti NGM-agar seminando piastre con 100 μL di batteri di scelta. Per coerenza, assicurarsi che gli stessi batteri vengano utilizzati in tutte le repliche. Semina 8-12 piastre per ceppo per esperimenti di durata della vita e 2-4 piastre per ceppo per far crescere gli animali fino all'età adulta. Lasciare asciugare i piatti durante la notte.
   2. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4. Ricordarsi di coltivare animali alla temperatura restrittiva di 25 °C per assicurarsi che gli animali siano sterili.
   3. Spostare 10-15 giorni 1 animali adulti su 8-12 piatti ciascuno. Per una durata di vita standard, inizia con ~ 120 animali per assicurarti che le dimensioni del campione non scendano troppo al di sotto di 100 dopo eventi di censura (ad esempio, otto piastre di 15 animali = 120 animali; 12 piastre di 10 animali = 120 animali).
   4. Segna la durata della vita a giorni alterni fino a quando tutti gli animali non sono stati valutati come morti o censurati. Rimuovi tutti gli animali morti o censurati dal piatto per evitare confusione e raccontando lo stesso animale.
      NOTA: Quando si tratta di ceppi di breve durata, si consiglia di valutare la durata della vita ogni giorno poiché la durata della vita a 25 °C è molto più breve e quindi la gamma dinamica è limitata. Nell'esperienza degli autori, gli animali possono essere riportati a 20 °C dopo il giorno 2 e gli animali rimarranno sterili se è preferibile segnare la durata della vita a 20 °C.

3. Misurazione della durata della salute in C. elegans

1. Misurazioni del comportamento locomotore tramite thrashing
   1. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4.
   2. Spostare una piccola colonia di vermi adulti del giorno 1 su una piastra NGM-agar sotto un cannocchiale di dissezione su 10-20 μL di soluzione M9. 10-15 animali sono raccomandati come un numero gestibile di animali da contare.
   3. Concentrandosi su un verme alla volta, contare il numero di volte in cui il campione passa da una formazione concava a una convessa in 15 s. Utilizzare un contatore manuale e un timer in modo che l'attenzione possa essere posizionata sul verme per tutta la durata del test.
      NOTA: è possibile registrare un video della lastra per un'analisi più approfondita / più semplice. Ad esempio, gli accessori per oculari per microscopio standard sono disponibili per la maggior parte degli smartphone e delle fotocamere digitali ($ 15- $ 30), e questi sono un'ottima opzione per il video thrashing a basso costo.
   4. Ripetere il passaggio 3.1.3 per gli altri vermi nel liquido, con una media di un tasso di motilità totale per 10-15 vermi. Per una dimensione del campione più elevata, ripetere i passaggi 3.1.2-3.1.4.
   5. Invecchiare i vermi all'età desiderata. Metodi simili per i saggi di durata della vita descritti nei passaggi 2.1-2.3 possono essere utilizzati per l'invecchiamento dei vermi. Ripetere i passaggi 3.1.2-3.1.4 per analizzare il thrashing all'età desiderata.
      NOTA: un metodo alternativo per il passaggio 3.1.2 consiste nell'aggiungere ~30 μL o più di soluzione M9 su un gruppo di vermi su una piastra. Ciò consentirà di risparmiare tempo dal dover trasferire manualmente i vermi, anche se a causa della possibilità casuale di dove si trovano i vermi su una singola piastra, non vi è alcuna garanzia che un gruppo di vermi rimanga in un singolo punto della piastra.
2. Misurazioni della fecondità (conteggio delle uova) in C. elegans
   1. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4. I test per la conta delle uova iniziano nella fase L4, che è ~ 1 giorno prima del giorno 1 età adulta (~ 3 giorni a 15 ° C o ~ 2 giorni a 20 ° C dopo l'arresto di L1).
   2. Individua i vermi L4 su piastre NGM-agar separate seminate con batteri di scelta. Si raccomanda di utilizzare ~ 10-15 animali per un test di fecondità.
      NOTA: Si raccomanda di diluire i batteri di scelta del 50% (cioè non una coltura satura) per migliorare la visibilità delle uova nel prato batterico.
   3. Permettere agli animali di crescere durante la notte a 20 °C. Assicurarsi che un nuovo lotto di piastre seminate sia pronto per il giorno successivo.
   4. Il giorno 1 dell'età adulta, trasferire i vermi adulti su piastre fresche di NGM-agar seminate con i batteri diluiti di scelta.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare piastre appena seminate o di conservare piastre a 4 °C fino all'uso per evitare prati batterici spessi.
   5. Contare il numero totale di uova deposte su ogni piastra NGM-agar.
      NOTA: Per facilitare la scansione della piastra, una griglia può essere disegnata sul coperchio di una piastra e posizionata sotto la piastra che viene segnata per le uova. La piastra può quindi essere scansionata lungo le linee della griglia per mantenere l'orientamento mentre la piastra viene spostata e impedire il riconteggio di eventuali uova.
   6. Ripetere i passaggi 3.2.4-3.2.5 per 7-8 giorni o fino a quando le uova non sono più visibili sulla piastra.
      NOTA: per i giorni 1-3 in cui i tassi di deposizione delle uova sono elevati, si consiglia di spostare gli animali almeno ogni 12 ore e di testare i conteggi delle uova due volte al giorno. Tuttavia, ciò aumenta la quantità di lavoro e i costi dei materiali di consumo, e quindi lo spostamento degli animali e le misurazioni possono essere limitati a una volta al giorno, ma è necessario prestare attenzione per garantire che tutte le uova e gli animali nati siano contati correttamente. Tutti gli animali nati sono conteggiati come uova ai fini di questo test.
3. Misurazione della dimensione della covata (sviluppo) della progenie di C. elegans
   1. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4. I test per le dimensioni della covata iniziano allo stadio L4, che è ~ 1 giorno prima del giorno 1 età adulta (~ 3 giorni a 15 ° C o ~ 2 giorni a 20 ° C dopo l'arresto di L1).
   2. Individua i vermi L4 su piastre NGM-agar separate seminate con batteri di scelta. Si raccomanda di utilizzare ~ 10-15 animali per un test di fecondità.
   3. Permettere agli animali di crescere durante la notte a 20 °C. Assicurarsi che un nuovo lotto di piastre seminate sia pronto per il giorno successivo.
   4. Il giorno 1 dell'età adulta, trasferire i vermi adulti su piastre fresche di NGM-agar seminate con batteri di scelta.
   5. Ogni 12-24 ore (2 volte al giorno o 1 volta al giorno), trasferire i vermi adulti su piastre fresche di NGM-agar seminate con batteri di scelta per 7-8 giorni o fino a quando la progenie non è più visibile. Conservare tutte le piastre contenenti uova a 20 °C.
   6. Ripetere il passaggio 3.3.5 per 7-8 giorni o fino a quando la progenie non è più visibile. Conservare tutte le piastre contenenti uova a 20 °C.
      NOTA: le piastre di progenie possono anche essere conservate a 15 °C per prolungare il tempo prima che debbano essere valutate.
   7. Due giorni dopo il trasferimento dei vermi, contare la progenie sviluppata sui piatti. Conta i vermi in via di sviluppo allo stadio L4 (cioè 2 giorni dopo la schiusa a 20 ° C) o prima per garantire che la generazione F2 (cioè la progenie della progenie) non confonda i risultati. Conta tutti i vermi che sono vivi.
      1. Rimuovere tutti i vermi dalla piastra mentre vengono contati. Mantenere le piastre per altri 1-2 giorni prima di segnarle di nuovo per garantire che non vengano persi animali con schiusa / sviluppo ritardati.
   8. Ripetere il passaggio 3.3.7 per ogni piastra di deposizione delle uova raccolta.
      NOTA: i saggi delle dimensioni della covata possono essere condotti in combinazione con il test del conteggio delle uova (fase 3.2) per ridurre al minimo la manodopera e i costi dei materiali di consumo raccogliendo due serie di dati da un esperimento. Ciò consentirà anche un confronto diretto tra le dimensioni della covata e il numero di uova all'interno degli stessi animali.

4. Misurare la resilienza allo stress in C. elegans

1. Misurazioni della sensibilità allo stress ER utilizzando tunicamicina
   1. Preparare le piastre di NGM-agar seminando piastre contenenti tunicamicina (vedere punto 1.1.7, NOTA) con 100 μL di batteri di scelta.
      ATTENZIONE: I guanti devono essere indossati quando si maneggia la tunicamicina.
   2. Per coerenza, assicurarsi che gli stessi batteri vengano utilizzati in tutte le repliche. Semina 8-12 piastre di tunicamicina per ceppo per i saggi di sopravvivenza e da due a quattro piastre senza tunicamicina per ceppo per far crescere gli animali fino all'età adulta. Lasciare asciugare i piatti durante la notte.
   3. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4.
      NOTA: Gli animali devono essere coltivati su piatti senza tunicamicina fino al giorno 1 dell'età adulta, poiché gli animali arresteranno / moriranno con tunicamicina.
   4. Spostare 10-15 giorni 1 animali adulti su 8-12 piatti ciascuno. Per un test di sopravvivenza standard, inizia con ~ 120 animali per assicurarti che la dimensione del campione non scenda troppo al di sotto di 100 dopo eventi di censura (ad esempio, otto piastre di 15 animali = 120 animali; 12 piastre di 10 animali = 120 animali).
      NOTA: Simile ai saggi FUDR, i test di sopravvivenza alla tunicamicina possono essere eseguiti senza spostare gli animali, poiché la tunicamicina provoca la morte / arresto degli animali L1. Tuttavia, quando si esegue un controllo DMSO, la progenie si svilupperà su piastre DMSO, quindi gli animali devono essere spostati quotidianamente o sarà necessaria una tecnica di sterilizzazione (metodi identici utilizzati nella sezione 2 per la durata della vita possono essere utilizzati per i saggi di sopravvivenza).
   5. I saggi di sopravvivenza sono valutati in modo simile alla durata della vita. Rimuovi tutti gli animali morti o censurati dal piatto per evitare confusione e raccontando lo stesso animale.
      NOTA: Sebbene sia possibile segnare gli animali a giorni alterni, poiché la morte si verifica rapidamente con la tunicamicina, si raccomanda di segnare saggi di sopravvivenza ogni giorno.
2. Misure di sensibilità allo stress mitocondriale/ossidativo mediante paraquat
   1. Preparare le piastre NGM-agar seminando piastre contenenti paraquat (vedere punto 1.1.7; NOTA) con 100 μL di batteri di scelta.
      ATTENZIONE: I guanti devono essere indossati quando si maneggia il paraquat in quanto è un pericolo ambientale. Verificare con la salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione i requisiti di rigetto, poiché molti istituti di ricerca richiederanno istruzioni specifiche per lo scarto per i rischi ambientali.
   2. Per coerenza, assicurarsi che gli stessi batteri vengano utilizzati in tutte le repliche. Semina 8-12 piastre per ceppo per i test di sopravvivenza e da due a quattro piastre senza paraquat per ceppo per far crescere gli animali fino all'età adulta. Lasciare asciugare le piastre durante la notte.
   3. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4.
      NOTA: Ricordarsi di coltivare animali su piatti senza paraquat fino al giorno 1 dell'età adulta; tuttavia, è necessario eseguire una tecnica di sterilizzazione o allontanare gli adulti dalla progenie, poiché alcuni animali possono svilupparsi fino all'età adulta su piastre di paraquat (vedere i passaggi 2.2-2.3).
   4. Spostare 10-15 giorni 1 animali adulti su 8-12 piatti ciascuno. Per un test di sopravvivenza standard, inizia con ~ 120 animali per garantire che la dimensione del campione non scenda troppo al di sotto di 100 dopo eventi di censura (ad esempio, otto piastre di 15 animali = 120 animali; 12 piastre di 10 animali = 120 animali).
   5. I saggi di sopravvivenza sono valutati in modo simile alla durata della vita. Rimuovi tutti gli animali morti o censurati dal piatto per evitare confusione e raccontando lo stesso animale.
      NOTA: Sebbene sia possibile segnare gli animali a giorni alterni, poiché la morte avviene rapidamente sul paraquat, si consiglia di valutare saggi di sopravvivenza ogni giorno. Ciò è particolarmente vero quando si utilizzano animali glp-4 (bn2) cresciuti a 25 ° C poiché la morte avverrà molto rapidamente.
3. Misurazioni della sensibilità allo stress termico (termotolleranza) utilizzando temperature elevate
   1. Raccogliere una popolazione sincronizzata di C. elegans utilizzando un test di sbiancamento standard come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4.
   2. Preriscaldare le piastre NGM-agar a 37 °C prima di spostare gli animali sulle piastre posizionando le piastre in un'incubatrice a 37 °C per almeno 1 ora.
   3. Sposta 10-15 giorni 1 animali adulti su quattro o sei piatti preriscaldati ciascuno. Per una termotolleranza standard, inizia con ~ 60 animali (ad esempio, quattro piastre di 15 animali = 60 animali; sei piastre di 10 animali = 60 animali)
   4. Metti gli animali in un'incubatrice a 37 °C e segna per la morte ogni 2 ore. La morte è definita come animali che non mostrano alcun movimento quando vengono toccati delicatamente con un piccone. Rimuovi tutti gli animali morti o censurati dal piatto per evitare confusione e raccontando lo stesso animale.
   5. Assicurarsi che le piastre vengano rimosse dall'incubatore a 37 °C per il minor tempo possibile, poiché le piastre lasciate a temperatura ambiente per lunghi periodi durante il punteggio altereranno i risultati della termotolenziazione.
      NOTA: Si consiglia di estrarre solo un ceppo alla volta per segnare, poiché la temperatura dell'agar non dovrebbe cambiare drasticamente nel tempo necessario per segnare un ceppo.
   6. La termotolleranza mediana è generalmente realizzata in 7-9 ore; quindi, garantire un test adeguato a 7 h, 9 h e 11 h.
      NOTA: mentre 1-5 ore possono essere saltate, a causa della variabilità degli incubatori, dello spessore delle piastre e di altri fattori confondenti in ogni laboratorio, è importante che i tempi siano titolati attentamente in ogni laboratorio se si prevede di saltare i timepoint. Cfr. riferimento ⁴⁴ per una guida completa sulla termotolenzianza.
   7. In alternativa, eseguire il test di termotolleranza a 34 °C anziché a 37 °C.
      NOTA: la termotolleranza mediana a 34 °C si verifica molto più tardi (10-14 ore in questo studio), il che consente di preparare saggi di termotolleranza a tarda notte (collocati in un incubatore a 34 °C) e di iniziare il punteggio presto il giorno successivo. Ciò consente circa 8 ore di punteggio continuo piuttosto che il tipico periodo di 12 ore richiesto per un test di termotolleranza a 37 °C.

Risultati

C. elegans è un eccellente organismo modello per la ricerca sull'invecchiamento a causa della grande maggioranza dei meccanismi di invecchiamento conservati con gli esseri umani. È importante sottolineare che hanno un costo molto basso in manutenzione e sperimentazione con requisiti minimi per attrezzature e materiali di consumo, rendendoli un sistema modello ambito per le istituzioni con fondi limitati. Inoltre, una pletora di saggi semplici con curve di apprendimento poco profonde li rende un sistema eccellente anche per il ricercatore più giovane con poca o nessuna esperienza. Tutti questi fattori combinati con la potente genetica di C. elegans , tra cui la facilità di modifica del genoma, migliaia di mutanti e animali transgenici disponibili a costi nominali e le librerie RNAi disponibili per l'abbattimento genetico di praticamente ogni gene li rendono un sistema ideale per le istituzioni universitarie. Qui, vengono esaminati alcuni dei metodi più economici per studiare l'invecchiamento in C. elegans , concentrandosi principalmente su saggi con attrezzature minime e costi di consumo, nonché curve di apprendimento poco profonde. In effetti, la totalità dei protocolli e la raccolta dei dati sono stati scritti / eseguiti da ricercatori junior con <5 mesi di esperienza di ricerca, per lo più studenti universitari.

Gli studi sulla longevità in C. elegans sono molto semplici a causa della breve durata della vita degli animali, che va da 14-20 giorni. È importante sottolineare che i saggi di durata della vita sono altamente standardizzati e richiedono solo un incubatore, un microscopio a dissezione standard, un worm pick standard e materiali di consumo per la preparazione di piastre NGM-agar. Forse l'aspetto più proibitivo in termini di costi delle misurazioni della durata della vita in C. elegans sono i materiali di consumo richiesti. Questo perché C. elegans sono ermafroditi che si autofecondano; pertanto, gli adulti monitorati per i test di longevità devono essere allontanati dalla progenie ogni giorno. Tuttavia, gli animali possono essere sterilizzati esponendoli a FUDR o utilizzando mutanti, come il mutante glp-4(bn2) privo di linea germinale sensibile alla temperatura coltivato a 25 °C proibitivi per ridurre la quantità di materiali di consumo richiesti 30,31,32. Qui, i test di durata della vita sono stati eseguiti con FUDR o con i mutanti senza linea germinale glp-4 (bn2), che mostrano risultati simili alle durate di vita standard eseguite su animali non sterili. Mentre la durata della vita selvaggia non è identica a causa degli effetti di FUDR⁴⁵ o della crescita a 25 °C sulla durata della vita², l'animale da abbattimento hsf-1 di breve durata mostra in modo affidabile una significativa diminuzione della durata della vita per tutte le condizioni (Figura 1). hsf-1 codifica il fattore di trascrizione heat-shock factor-1, che è coinvolto nella regolazione della risposta allo stress termico, e il suo abbattimento si traduce in una significativa diminuzione della durata della vita^38,46.

Mentre la longevità è un fattore importante da considerare nella biologia dell'invecchiamento, spesso, la longevità non è correlata con un aumento della salute, anche in C. elegans⁴⁷. Pertanto, come approccio complementare, offriamo diversi metodi per misurare la salute dell'organismo, tra cui la salute riproduttiva, il comportamento locomotore e la resilienza allo stress. La salute riproduttiva può essere misurata in uno dei due modi. In primo luogo, le misurazioni del conteggio delle uova forniranno una misurazione diretta di quante uova vengono deposte da un singolo ermafrodita autofecondante. Tuttavia, poiché gli animali producono più ovociti che spermatozoi, vengono deposte anche alcune uova non fecondate che non produrrebbero mai progenie vitale⁴⁸. Pertanto, per ottenere una migliore comprensione della vera capacità riproduttiva di un animale, le misurazioni delle dimensioni della covata forniscono una misura di quanti figli vitali vengono prodotti. Spesso, una maggiore resilienza allo stress può effettivamente ridurre la capacità riproduttiva, potenzialmente a causa dell'effetto intrinseco dello stress percepito sulla riproduzione⁴⁹. Allo stesso modo, una significativa diminuzione sia del numero di uova deposte che delle dimensioni della covata si riscontra negli animali da sovraespressione hsf-1 rispetto ai controlli di tipo selvatico (Figura 2A, B). In effetti, alcuni animali da sovraespressione di hsf-1 mostrano una completa sterilità, fornendo la prova che la salute riproduttiva può essere inversamente correlata alla longevità.

Mentre la salute riproduttiva è importante per comprendere la salute della linea germinale, la meiosi funzionale e la capacità riproduttiva, in generale, non esiste una correlazione diretta tra longevità e dimensione della covata⁵⁰. Pertanto, come approccio complementare, il comportamento locomotore è offerto come metodo gold standard per l'analisi della durata della salute di C. elegans durante l'invecchiamento^{di 51 anni}. Esistono molti metodi per misurare il comportamento locomotore, ma la maggior parte dei metodi richiede telecamere sofisticate, software di tracciamento o sostanze chimiche costose. Al contrario, i saggi di thrashing non richiedono praticamente alcuna attrezzatura oltre a quella di cui è dotato un laboratorio standard di C. elegans : microscopio sezionante, plettro a vite senza fine, pipetta e materiali di consumo per la produzione di piastre NGM-agar. I tassi di thrashing forniscono un metodo affidabile per misurare la durata della salute durante l'invecchiamento, misurata da una significativa diminuzione del thrashing negli animali anziani rispetto agli animali giovani (Figura 2C).

Infine, i saggi di sopravvivenza allo stress sono un'ulteriore misura fisiologica della resilienza. La capacità di attivare le risposte allo stress generalmente diminuisce durante il processo di invecchiamento, rendendo gli animali meno resilienti e più sensibili allo stress. Pertanto, la resilienza allo stress può essere utilizzata come proxy affidabile per la salute dell'organismo. Qui, vengono offerti metodi per rilevare la sensibilità a 1) stress ER in risposta all'esposizione alla tunicamicina, un agente chimico che blocca la glicosilazione legata all'N e provoca l'accumulo di proteine mal ripiegate nell'ER; 2) stress mitocondriale/ossidativo attraverso l'esposizione al paraquat, agente chimico che induce la formazione di superossido nei mitocondri; e 3) stress termico attraverso l'esposizione a temperature elevate. Per i test di tunicamicina e paraquat, il farmaco viene incorporato nella piastra NGM-agar durante la produzione di piastre. Per alte concentrazioni di tunicamicina, la progenie generalmente non si sviluppa, e quindi non è necessario utilizzare tecniche di sterilizzazione. Il protocollo qui presentato raccomanda 25 ng/μL come concentrazione finale di tunicamicina, ma per quelli con fondi limitati, 10 ng/μL mostra anche una significativa riduzione della sopravvivenza (Figura 3A). Entrambe le concentrazioni limitano lo sviluppo della progenie, e quindi non sono necessari metodi di sterilizzazione, sebbene il controllo DMSO richieda una tecnica di sterilizzazione o il movimento degli animali su nuove piastre. Questo perché la tossicità della tunicamicina impedisce lo sviluppo della progenie, ma il DMSO è praticamente non tossico, il che consente alla progenie di svilupparsi completamente quando viene coltivata con tunicamicina.

Per i test di paraquat, è necessaria una tecnica di sterilizzazione o il movimento di animali poiché il trattamento con paraquat non impedisce alla progenie di svilupparsi fino all'età adulta. Alti livelli di paraquat (4 mM) riducono significativamente la durata della vita, mentre bassi livelli di paraquat (0,25 mM) aumentano la durata della vita a causa di un effetto ormetico (Figura 3B), in linea con i risultati precedentemente pubblicati⁵². Infine, i saggi di termotolleranza richiedono solo un incubatore che può raggiungere i 30-37 °C e non sono necessari reagenti aggiuntivi. La sovraespressione di hsf-1 aumenta la termotolleranza a 37 °C (Figura 3C) come precedentemente pubblicato⁵³. Tuttavia, come altri hanno dimostrato in precedenza e dai dati attuali, il problema principale con i saggi di termotolleranza è la loro variabilità. Molti fattori possono contribuire alla variabilità all'interno dei saggi di termotolleranza, comprese le differenze tra gli incubatori e il tempo che gli animali trascorrono al di fuori dell'incubatrice mentre segnano la termotolleranza ogni ora. Per una linea guida completa sulla termotolleranza, fare riferimento al riferimento ⁴¹.

Figura 1: Confronto delle misurazioni della durata della vita con e senza sterilizzazione. (A) Durata della vita dei nematodi N2 selvatici coltivati su piastre NGM-agar seminate con batteri RNAi vettori vuoti (ev) o hsf-1 a 20 °C. Gli animali sono stati allontanati dalla progenie nei giorni 1, 3, 5 e 7 dell'età adulta. (B) Durata della vita dei nematodi N2 selvatici coltivati su piastre NGM-agar-FUDR seminate con batteri RNAi vettori vuoti (ev) o hsf-1 a 20 °C. Gli animali sono stati coltivati fino all'età adulta su piastre standard ev o hsf-1 RNAi, e poi spostati in piastre FUDR il giorno 1 dell'età adulta. (C) Durata della vita degli animali mutanti glp-4(bn2) coltivati su piastre NGM-agar seminate con vettore vuoto (ev) o hsf-1 RNAi a 25 °C. Per tutte le condizioni, gli animali sono stati valutati per la morte ogni 2 giorni fino a quando tutti gli animali sono stati registrati come morti o censurati. Gli animali con insaccamento, sporgenza o esplosione della vulva, o quelli che strisciavano sui lati delle piastre e essiccati venivano censurati. Tutte le statistiche sono state eseguite utilizzando il test Log-Rank Mantel-Cox e possono essere trovate nella Tabella 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Conteggio delle uova, dimensione della covata e thrashing come misurazioni dell'intervallo di salute. (A) I saggi di Thrashing sono stati eseguiti su animali mutanti glp-4 (bn2) cresciuti su piastre di Agar NGM seminate con vettore vuoto a 25 ° C il giorno 1 (blu), il giorno 4 (rosso) e il giorno 9 (verde) animali. Il thrashing è stato segnato in animali collocati in soluzione M9 su una piastra NGM-agar, video registrato utilizzando una fotocamera standard per smartphone montata su un oculare di un cannocchiale di dissezione standard e thrashing segnato al rallentatore per la precisione. n = 15 animali per condizione. (B) La conta delle uova è stata misurata in animali selvatici N2 (blu) e sur-5p::hsf-1 (rosso). Gli animali sono stati cresciuti a 20 °C e spostati su piatti freschi, e le uova sono state contate ogni 12 ore. Il numero totale di uova deposte è stato sommato. n = 7 animali per wildtype e 9 animali per sur-5p::hsf-1. (C) I saggi di covata sono stati misurati sugli stessi animali della lettera B) in cui le uova sono state coltivate a 20 °C per 2 giorni per consentire la schiusa e tutte le uova schiuse sono state contate. = p < 0,001 calcolata utilizzando test di Mann-Whitney non parametrici. Ogni punto rappresenta un singolo animale e le linee rappresentano l'intervallo mediano e interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Resilienza allo stress come proxy per la salute dell'organismo. (A) Saggio di sopravvivenza di animali N2 cresciuti sui batteri RNAi vettori vuoti a 20 °C. Gli animali sono stati spostati in piastre contenenti 1% di DMSO, 10 ng/μL di tunicamicina (TM) o 25 ng/μL di TM il giorno 1 dell'età adulta. (B) Saggio di sopravvivenza di animali N2 cresciuti sul vettore vuoto RNAi batteri a 20 °C. Gli animali sono stati cresciuti dal portello su piastre contenenti acqua, 0,25 mM di paraquat (PQ) o 4 mM di PQ. Per A-B, gli animali sono stati valutati per la morte ogni 2 giorni fino a quando tutti gli animali sono stati registrati come morti o censurati. Gli animali con insaccamento, sporgenza o esplosione della vulva, o quelli che strisciavano sui lati delle piastre e essiccati venivano censurati. Tutte le statistiche sono state eseguite utilizzando il test Log-Rank Mantel-Cox (Tabella 2). (C) Dati aggregati di tutti i saggi di termotolleranza a 37 °C per animali N2 selvatici rispetto alla sovraespressione di hsf-1 (sur-5p::hsf-1). I dati sono rappresentati come percentuale di vita al tempo = 9 ore di un test di termotolleranza, con ogni linea che rappresenta un esperimento abbinato eseguito lo stesso giorno. Gli animali sono stati cresciuti sul vettore vuoto RNAi batteri a 20 °C e spostati a 37 °C il giorno 1 dell'età adulta per il test. n = 60 animali per ceppo per replicazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagente	Ricetta
Soluzione di candeggina	1,8% (v/v) ipoclorito di sodio, 0,375 M KOH
Carbenicillina	100 mg/mL di soluzione madre (1000x) in acqua. Conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi o -20 °C per la conservazione a lungo termine
FUDR ·	10 mg/mL di soluzione in acqua. Conservare a -20 °C.
IPTG ·	1 M di soluzione in acqua.
Brodo di Lisogenesi (LB)	In questo protocollo, è stato utilizzato LB commerciale (vedi Tabella dei materiali), ma tutte le ricette standard LB fatte in casa con Bacto-triptone, estratto di lievito e NaCl sono sufficienti.
Soluzione M9	22 mM KH2PO4 monobasico, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Mezzi di crescita del nematode (NGM)	1 mM CaCl2, 5 μg/mL colesterolo, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (p/v) agar, 0,25% (p/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl
Piastre NGM RNAi	1 mM CaCl2, 5 μg/mL colesterolo, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (p/v) agar, 0,25% (p/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicillina/ampicillina. Conservare a 4°C al buio per un massimo di 3 mesi
NGM RNAi DMSO	1 mM CaCl2, 5 μg/mL colesterolo, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (p/v) agar, 0,25% (p/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicillina/ampicillina; 1% DMSO
(controllo per la tunicamicina)
NGM RNAi TM	1 mM CaCl2, 5 μg/mL colesterolo, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (p/v) agar, 0,25% (p/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL carbenicillina/ampicillina; 1% DMSO, 25 ng/μL tunicamicina
Paraquat	Soluzione da 400 mM in acqua – deve essere preparata fresca
Tetraciclina	10 mg/mL di soluzione madre (500x) in etanolo al 100%. Conservare a -20 °C
Tunicamicina	2,5 mg/mL di soluzione madre in DMSO al 100%. Conservare a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Questa è una soluzione 100x (soluzione di lavoro 25 ng/μL)

Tabella 1. Ricette per reagenti e supporti per protocolli.

Pannello Figura corrispondente	Ceppo, Trattamento		Durata mediana della vita	# Decessi/# Totale	valore p (Log-Rank)
1A	N2, vettore RNAi, 20 °C		17	74/120	--
	N2, hsf-1 RNAi, 20 °C		11	65/120	<0.001
1B	N2, vettore RNAi, FUDR, 20 °C		19	120/120	--
	N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C		11	116/120	<0.001
1C	N2, glp-4(bn2), vettore RNAi, 25 °C		13	115/121	--
	N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C		4	120/120	< 0,001
2A	N2, vettore RNAi, 20 °C, 1% DMSO		19	85/120	--
	N2, vettore RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunicamicina		15	109/120	<0.001
	N2, vettore RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamicina		12	117/120	<0.001
2B	N2, vettore RNAi, 20 °C		19	84/120	--
	N2, vettore RNAi, 20 °C, paraquat 0,25 mM		24	91/120	<0.001
	N2, vettore RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat		6	50/120	<0.001

Tabella 2. Statistiche per la durata della vita e la resilienza allo stress.

Discussione

La durata della vita, più semplicemente definita come la durata della vita, è un chiaro fenomeno binario nella maggior parte degli organismi: o un organismo è vivente o non è. Tuttavia, la longevità non è sempre correlata alla salute di un organismo. Ad esempio, i modelli di ormesi mitocondriale in cui l'esposizione allo stress mitocondriale aumenta drasticamente la durata della vita sono generalmente alcuni degli animali più longevi, ma mostrano una crescita stentata e una ridotta funzione metabolica^37,54. Allo stesso modo, gli animali con risposte allo stress del reticolo endoplasmatico iperattivo mostrano anche determinati comportamenti e fenotipi che possono essere correlati con una diminuzione della salute, nonostante abbiano migliorato notevolmente l'omeostasi proteica e la durata della vita^36,49. Infine, molti paradigmi di longevità negli organismi modello, tra cui l'aumento della funzione HSF-1⁵⁵, l'aumento della funzione XBP-1⁵⁶ e la segnalazione FoxO^{alterata 57}, sono tutti correlati con un aumento del rischio di cancro, ed è indiscutibile che una durata della vita prolungata non è benefica se un organismo è in costante lotta con il cancro e altre malattie di salute. Pertanto, la longevità non può essere una misura autonoma nella biologia dell'invecchiamento.

Pertanto, il concetto di healthspan è stato un campo in crescita nella biologia dell'invecchiamento. Healthspan, vagamente definito come il periodo della vita in cui si è sani, è più difficile da accertare della longevità. Tuttavia, a differenza della longevità, il concetto di "salute" è complicato, in quanto ci sono molte letture diverse per la salute dell'organismo: a livello di organismo, ci sono funzione / forza muscolare, funzione neuronale / cognitiva, salute riproduttiva, ecc.; a livello cellulare ci sono omeostasi proteica, omeostasi lipidica, omeostasi del glucosio, metabolismo, ecc. Nel 2014, i biologi dell'invecchiamento hanno definitivamente caratterizzato le caratteristiche biologiche dell'invecchiamento con la definizione strutturata che deve essere qualcosa che si rompe naturalmente durante l'invecchiamento e può essere alterato sperimentalmente in modo tale che l'esacerbazione sperimentale dovrebbe accelerare l'invecchiamento e l'intervento sperimentale dovrebbe rallentare l'invecchiamento. Questi nove segni distintivi dell'invecchiamento includono instabilità genomica, attrito dei telomeri, alterazioni epigenetiche, perdita di omeostasi proteica (proteostasi), esaurimento delle cellule staminali, segnalazione intercellulare alterata, disfunzione mitocondriale, rilevamento dei nutrienti deregolati e senescenza cellulare⁵⁸. Da allora, numerosi studi sostengono che dovrebbero essere inclusi altri fattori, tra cui le proteine extracellulari e la fisiologia sistemica come l'immunità e l'infiammazione⁵⁹. In definitiva, la complessa definizione di healthspan impone che la salute dell'organismo sia misurata utilizzando più metodi diversi.

Pertanto, in questo manoscritto, vengono presentati più metodi per misurare vari aspetti della durata della salute utilizzando il modello di nematode, C. elegans. Analizziamo il comportamento locomotore utilizzando saggi di thrashing, la salute riproduttiva usando il conteggio delle uova e le dimensioni della covata e la sensibilità allo stress. In effetti, il comportamento locomotore è un metodo gold standard per misurare la durata della salute, poiché gli organismi mostrano una significativa perdita di motilità e movimento durante l'invecchiamento^{di 51 anni}. La perdita del comportamento locomotore può essere attribuita a molteplici segni distintivi dell'invecchiamento, poiché la funzione muscolare in C. elegans dipende dalla corretta proteostasi⁶⁰, dalla disfunzione mitocondriale⁶¹ e dalla segnalazione neurono-muscolare⁶². Mentre questo manoscritto si concentra su una misurazione del comportamento locomotore, è importante notare che esistono molti altri metodi, tra cui la motilità degli animali su una piastra di agar solida, la risposta al^{tocco 51} e i saggi di chemiotassi⁶³. Tuttavia, questi metodi richiedono generalmente dispositivi di registrazione più sofisticati, l'uso di software di tracciamento dei worm o l'uso di sostanze chimiche costose, pericolose o volatili, che possono essere proibitive in alcune impostazioni di ricerca.

Inoltre, i saggi per la conta delle uova e la dimensione della covata sono presentati come un metodo per misurare la salute riproduttiva e come il metodo più semplice per misurare la divisione cellulare nei vermi adulti, poiché i vermi adulti sono post-mitotici e solo le cellule germinali e gli embrioni subiscono la divisione cellulare all'interno di un verme adulto⁶⁴. Come misura della divisione cellulare, la salute riproduttiva può essere rilevante per i segni distintivi dell'invecchiamento della senescenza cellulare e dell'esaurimento delle cellule staminali. La salute riproduttiva può essere influenzata da molti fattori, tra cui l'infezione patogena⁶⁵ o l'esposizione allo stress⁴⁹, sebbene non vi sia alcuna correlazione diretta tra salute riproduttiva e longevità. In effetti, alcuni animali longevi mostrano una significativa diminuzione della taglia⁴⁹ della covata, ed è persino possibile che esista una correlazione inversa tra longevità e taglia⁵⁰ della covata. Questo non è un fenomeno specifico di C. elegans, poiché gli effetti dannosi della riproduzione sulla longevità sono stati a lungo osservati negli esseri umani⁶⁶, nei cani da compagnia⁶⁷ e nei topi⁶⁸. Tuttavia, forniamo il conteggio delle uova e le dimensioni della covata come metodo affidabile e a basso costo per misurare la salute riproduttiva con l'avvertenza che la salute riproduttiva potrebbe non essere correlata alla longevità o alla durata della salute.

Infine, i saggi di sopravvivenza sono offerti come misura indiretta della salute dell'organismo. È importante sottolineare che le risposte allo stress cellulare, compresa la risposta allo stress termico⁶⁹ e allo stress ER³⁵, diminuiscono rapidamente durante il processo di invecchiamento e hanno rilevanza diretta per il segno distintivo dell'invecchiamento della proteostasi^70,71. Al contrario, le risposte iperattivanti allo stress possono aumentare significativamente la durata della vita promuovendo la resilienza allo stress 35,37,38. Mentre questo studio si concentra sui metodi più semplici e più economici, esiste un gran numero di metodi alternativi per i saggi di resilienza allo stress per la termotolleranza⁴¹ e lo stress ossidativo⁶⁶, ognuno dei quali richiede un diverso set di apparecchiature e materiali di consumo. Oltre ai semplici studi di esposizione ai fattori di stress, possono essere eseguiti altri metodi fisiologici a seconda dell'accesso alle apparecchiature. Ad esempio, un analizzatore di flusso extracellulare può monitorare la funzione mitocondriale e la respirazione cellulare⁷³; microscopi a dissezione fluorescente consentiranno misurazioni di reporter trascrizionali per l'attivazione della risposta allo stress²⁰; e microscopi composti o confocali ad alta risoluzione possono essere utilizzati per misurare la morfologia degli organelli con sonde fluorescenti per i mitocondri⁷⁴, il reticolo endoplasmatico^75,76 e il citoscheletro di actina⁷⁷.

Come ultimo avvertimento per le misurazioni della longevità, mentre i metodi chimici e genetici per sterilizzare i vermi sono offerti per ridurre significativamente i costi, è importante notare che entrambi possono avere un impatto diretto sulla durata della vita. Ad esempio, l'esposizione al FUDR è stata precedentemente segnalata per avere un impatto sia sulla durata della vita che sulla termotolleranza⁴⁵. E mentre il mutante glp-4 (bn2) in sé non ha effetti diretti sulla durata della vita, la crescita a 25 ° C è un lieve stress termico^33,34 e quindi può influire sulla durata della vita². Esistono altri metodi per sterilizzare C. elegans, tra cui la sterilità⁷⁸ mediata dall'auxina o mutanti alternativi sensibili alla temperatura carenti di spermatozoi⁷⁹. Tuttavia, tutti i metodi hanno alcuni avvertimenti e si dovrebbe fare attenzione a utilizzare il test meno dannoso per le esigenze scientifiche di ciascun laboratorio. Un'ultima limitazione degli studi sulla longevità è la potenziale variabilità che può verificarsi a causa di basse dimensioni del campione o semplicemente da un errore oggettivo da parte dello sperimentatore. Questo può essere aggirato in quanto le nuove tecnologie nascono nelle tecnologie di durata della vita automatizzata⁸⁰, ma ancora una volta questi sistemi sono costosi e richiedono alcune attrezzature e competenze ingegneristiche e computazionali. In definitiva, la raccolta di metodi forniti qui è un insieme affidabile di strumenti che possono essere rapidamente adattati e appresi in quasi tutte le istituzioni e fornire una solida base per la biologia dell'invecchiamento.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
APEX IPTG	Genesee	18-242	for RNAi
Bacto Agar	VWR	90000-764	for NGM plates
Bacto Peptone	VWR	97064-330	for NGM plates
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904	for NGM plates
Carbenicillin	VWR	76345-522	for RNAi
Cholesterol	VWR	80057-932	for NGM plates
DMSO	VWR	BDH1115-1LP	solvent for drugs
LB Broth	VWR	95020-778	for LB
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-132	for NGM plates, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride	VWR	97061-566	for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic	VWR	EM-PX1570-2	for NGM plates
Potassium phosphate monobasic	VWR	EM-PX1565-5	for M9
S7E Dissecting Scope	Leica	10450840	Standard dissecting microscope
Sodium Chloride	VWR	EM-SX0420-5	for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite	VWR	RC7495.7-32	for bleach solution
Sodium phosphate dibasic	VWR	71003-472	for M9
Tetracycline hydrochloride	VWR	97061-638	for RNAi
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	for ER stress