Studiare il rilassamento dello stress e le risposte al fallimento nella trachea

Riepilogo

Il presente protocollo determina le proprietà di rilassamento dello stress di trazione e di rottura delle trachee suine. I risultati di tali metodi possono aiutare a migliorare la comprensione delle soglie viscoelastiche e di rottura della trachea e contribuire a far progredire le capacità dei modelli computazionali del sistema polmonare.

Abstract

Le proprietà biomeccaniche della trachea influenzano direttamente il flusso d'aria e contribuiscono alla funzione biologica dell'apparato respiratorio. Comprendere queste proprietà è fondamentale per comprendere il meccanismo di lesione in questo tessuto. Questo protocollo descrive un approccio sperimentale per studiare il comportamento stress-rilassamento della trachea suina che è stata pre-allungata allo 0% o al 10% di deformazione per 300 s, seguita da carico di trazione meccanica fino al cedimento. Questo studio fornisce dettagli sul disegno sperimentale, l'acquisizione dei dati, le analisi e i risultati preliminari dei test biomeccanici delle trachee suine. Utilizzando i passaggi dettagliati forniti in questo protocollo e il codice MATLAB di analisi dei dati, studi futuri possono indagare il comportamento viscoelastico dipendente dal tempo del tessuto tracheale, che è fondamentale per comprendere le sue risposte biomeccaniche durante condizioni fisiologiche, patologiche e traumatiche. Inoltre, studi approfonditi sul comportamento biomeccanico della trachea aiuteranno in modo critico a migliorare la progettazione di dispositivi medici correlati come gli impianti endotracheali che sono ampiamente utilizzati durante gli interventi chirurgici.

Introduzione

Nonostante il suo ruolo critico nelle malattie polmonari, la più grande struttura delle vie aeree, la trachea, ha studi limitati che dettagliano le sue proprietà viscoelastiche¹. Una comprensione approfondita del comportamento viscoelastico dipendente dal tempo della trachea è fondamentale per la ricerca sulla meccanica polmonare poiché la comprensione delle proprietà del materiale specifiche delle vie aeree può aiutare a far progredire la scienza della prevenzione delle lesioni, della diagnosi e dell'intervento clinico per le malattie polmonari, che sono la terza causa di morte negli Stati Uniti ^2,3,4.

Studi di caratterizzazione tissutale disponibili hanno riportato le proprietà di rigidità della trachea 5,6,7,8. Le risposte meccaniche dipendenti dal tempo sono state minimamente studiate nonostante la loro importanza nel rimodellamento tissutale, che è anche alterato dalla patologia ^9,10. Inoltre, la mancanza di dati di risposta dipendenti dal tempo limita anche le capacità predittive dei modelli computazionali di meccanica polmonare che attualmente ricorrono all'utilizzo delle leggi costitutive generiche. È necessario colmare questa lacuna eseguendo studi di rilassamento dello stress che possano fornire le caratteristiche materiali richieste per informare gli studi biofisici della trachea. L'attuale studio offre dettagli sui metodi di test, l'acquisizione dei dati e le analisi dei dati per studiare il comportamento di rilassamento dello stress della trachea suina.

Protocollo

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Drexel University. Tutti gli animali cadaverici sono stati acquistati da una fattoria approvata dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) situata in Pennsylvania, negli Stati Uniti. Per il presente studio è stato utilizzato un cadavere di un maiale maschio dello Yorkshire (3 settimane).

1. Raccolta dei tessuti

1. Acquisire un cadavere di un maiale da una fattoria approvata ed eseguire gli esperimenti entro 2 ore dall'eutanasia. Tenere il cadavere sul ghiaccio fino al completamento della raccolta dei tessuti per garantire che le proprietà biomeccaniche dei tessuti freschi siano conservate.
   NOTA: Nella letteratura pubblicata, il test dei tessuti freschi negli animali viene comunemente eseguito entro 2 ore dopo l'eutanasia. Per i dettagli, vedere i riferimenti 11,12,13,14,15,16,17,18,19.
2. Posizionare il cadavere in posizione supina, praticare un'incisione verticale della linea mediana lungo il collo ed esporre la cartilagine tiroidea, la cartilagine cricoide e la trachea dall'osso ioide alla tacca soprasternale.
3. Raccogliere la laringe e la trachea a tutta lunghezza usando una lama #10 (Figura 1A).
4. Separare il campione di trachea dalla laringe e quindi tagliare il tubo tracheale longitudinalmente lungo l'intera lunghezza su un lato usando la lama #10 (Figura 1B).
5. Misurare lo spessore della trachea utilizzando l'immagine della sezione trasversale acquisita (ottenuta utilizzando l'immagine J²⁰, vedi Tabella dei materiali) (Figura 1C). Utilizzare lo spessore del tessuto misurato per calcolare l'area della sezione trasversale durante l'analisi dei dati.
6. Tagliare la trachea in due strisce circonferenziali larghe circa 5 mm (prossimalmente) e due strisce longitudinali larghe circa 5 mm (distale), con una lunghezza minima di 25 mm (figura 1D).
7. Ottieni immagini dei quattro campioni (cioè strisce di trachea tagliate) accanto a un righello. Utilizzare queste immagini per fornire misurazioni digitalizzate della larghezza del campione utilizzando l'immagine J (Figura 1E). Quindi, utilizzare questa larghezza misurata per calcolare l'area della sezione trasversale del campione durante l'analisi dei dati.
8. Assicurarsi che tutti i campioni di tessuto siano mantenuti idratati utilizzando una soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) durante tutto lo studio. Conservare i campioni idratati in una garza imbevuta di PBS fino al momento del test. Immergere il tessuto in PBS poco prima di testare per una corretta idratazione.

2. Prove biomeccaniche

1. Fissare ciascun campione ad un morsetto progettato su misura (vedere le relazioni precedenti 11,12,13,14,15,16,17,18,19) in modo che il campione sia tenuto longitudinalmente tra i morsetti (Figura ^1F).
2. Fissare con cura i morsetti (senza indurre alcun allungamento) a una macchina di prova del materiale (vedere Tabella dei materiali), che ha una cella di carico da 50 N collegata all'attuatore superiore (Figura 1G).
3. Misurare la distanza grip-to-grip (cioè morsetto) utilizzando un righello. Utilizzare questa distanza come lunghezza iniziale del tessuto per il calcolo della deformazione.
4. Eseguire il precondizionamento caricando a trazione ciascun campione cinque volte con una velocità di deformazione dell'1%/s all'1% di deformazione.
5. Tenere ogni campione al picco di allungamento dello 0% o del 10% per 300 s per studiare la risposta viscoelastica di stress-rilassamento del tessuto.
6. Dopo il test di rilassamento dello stress, allungare immediatamente il tessuto all'1% / s fino a quando non si verifica un guasto meccanico.
7. Documentare il sito di guasto e verificare che non si sia verificato alcun errore assicurando la presenza di campioni all'interno dei morsetti dopo il test (Figura 1H).

3. Acquisizione dei dati

1. Non acquisire alcun dato durante il precondizionamento.
2. Registra i video di rilassamento dello stress e test di guasto utilizzando qualsiasi fotocamera digitale a un minimo di 30 fotogrammi / s.
3. Acquisire dati di tempo, carico (N) e spostamento (mm) utilizzando un software di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali) a una frequenza di campionamento di 250 campioni/s durante i test di rilassamento dello stress e di guasto.
4. Salvare i dati acquisiti come file .csv e utilizzarli per l'analisi dei dati come descritto nel passaggio 4.
5. Acquisire immagini fisse del tessuto bloccato prima del rilassamento dello stress, dopo il rilassamento dello stress e dopo il fallimento (Figura 2).

4. Analisi dei dati

1. Inserimento dati
   1. Scarica e installa il software di analisi dei dati MATLAB (vedi Tabella dei materiali), inclusi gli strumenti "Ottimizzazione" e "Elaborazione immagini".
   2. Scarica la cartella compressa (Supplementary Coding File 1), che include i codici MATLAB e un set di dati di esempio che verrà utilizzato per spiegare i passaggi di analisi dei dati.
   3. Passare alla cartella compressa scaricata ed estrarne il contenuto.
   4. Apri MATLAB e imposta la cartella decompressa come directory di lavoro. Assicuratevi che nella directory di lavoro siano presenti le seguenti cartelle e i seguenti file etichettati come indicato nella nota riportata di seguito. Assicurarsi che non siano presenti cartelle o file aggiuntivi in questa directory di lavoro poiché potrebbero interferire con il codice e causare un errore.
      NOTA: (1) Fallimento (post-rilassamento), (2) Solo fallimento, (3) Rilassamento, (4) calc_relax_failure.m, (5) main_relax_failure.m, (6) testingDates.xlsx.
   5. Passare alla cartella Solo errori .
      NOTA: I dati contenuti in questa cartella sono derivati dal gruppo di controllo in questo studio, cioè i dati biomeccanici provenienti da campioni tracheali che sono stati sottoposti a guasto meccanico a seguito di un allungamento dello 0%.
   6. Archiviare i dati dei campioni testati in una data specifica in un file di Microsoft Excel utilizzando la seguente convenzione di denominazione dei file: mmggaa. Ad esempio, i dati di tutti i campioni tracheali del gruppo di controllo testati il 30 aprile 2022 devono essere archiviati in Failure Only | 043022.xlsx.
      NOTA: Si noti che, nel presente studio, tutti i test biomeccanici sono stati condotti in un solo giorno; tuttavia, se i dati sono stati derivati da più date di test, creare un nuovo file di Microsoft Excel, denominato nella convenzione descritta, per ciascuna di tali date di test.
   7. Errore aperto solo | 043022.xlsx e riconoscere che esistono più schede del foglio di lavoro, ognuna contenente i dati grezzi di ciascun campione soggetto a guasto meccanico in questa particolare data, ovvero il 30 aprile 2022.
   8. Assicurarsi che i campioni siano etichettati utilizzando la seguente convenzione: [tipo di campione]_[ numero campione]_[inserire livello di deformazione pre-stiramento]%.
      NOTA: Ad esempio, nel presente studio, i campioni tracheali del gruppo di controllo sono stati sottoposti a prove di guasto meccanico sotto carico assiale o circonferenziale senza alcun precedente rilassamento dello stress. Pertanto, questi esempi sono denominati nel seguente formato: TA_1_0% e TC_1_0%, rispettivamente. Lo 0% indica nessun pre-allungamento. I campioni tracheali del nostro gruppo sperimentale sono stati prima tenuti ad allungamento fisso sotto carico assiale o circonferenziale del 10% per valutare la risposta di rilassamento dello stress viscoelastico e quindi sottoposti a guasto meccanico. Pertanto, questi campioni sono denominati nel seguente formato: TA_1_10 % e TC_1_10% (fare riferimento al punto 4.1.16 e al passaggio 4.1.23, che rappresentano rispettivamente le condizioni di carico assiale e circonferenziale).
   9. Selezionare la scheda del foglio di lavoro TA_1_0%. Assicurarsi che le colonne di intestazione dei dati non elaborati siano etichettate esattamente come digitate in grassetto nella nota seguente.
      NOTA: (1) Tempo (sec), (2) Carico (N), (3) Posizione (mm), (4) Diametri (mm) (passo 1.7), (5) Area media della sezione trasversale (spessore x larghezza, mm 2) (ottenuta al passo 1.5 e al passo 1.7), (6) Lunghezza iniziale (mm) (passo^2.3).
   10. Chiudere il file di Microsoft Excel corrente, solo errore | 043022.xlsx.
   11. Tornare alla directory di lavoro del software di analisi dei dati.
   12. Passare alla cartella Relax.
       NOTA: I dati contenuti in questa cartella sono derivati dal gruppo sperimentale in questo studio, cioè dati biomeccanici da campioni tracheali che sono stati sottoposti a prove di rilassamento da sforzo ad un allungamento fisso del 10% per 300 s.
   13. Memorizzare i dati dei campioni di gruppo sperimentali testati in una data specifica in un file di Microsoft Excel utilizzando la seguente convenzione di etichettatura: mmggaa.
       NOTA: Ad esempio, i dati di tutti i campioni tracheali sperimentali di gruppo testati il 30 aprile 2022 devono essere archiviati in Relaxation | 043022.xlsx. Fare riferimento alla nota al punto 4.1.6 per ulteriori dettagli.
   14. Open Relax | 043022.xlsx e riconoscere che esistono più schede del foglio di lavoro, ciascuna contenente i dati grezzi di rilassamento del carico di ciascun campione nel gruppo sperimentale che è stato testato in questa particolare data, ovvero il 30 aprile 2022.
   15. Mettere in pausa e notare che ciascuno degli esempi, come indicato dalle schede del foglio di lavoro incluse in questo file di Microsoft Excel, è stato successivamente sottoposto a guasti meccanici sotto carico meccanico di trazione.
       NOTA: i dati di errore corrispondenti per ciascuno dei campioni presenti devono essere memorizzati nella cartella Failure (Post-Relaxation), ulteriormente descritta al punto 4.1.20.
   16. Assicurarsi che i campioni siano etichettati utilizzando la convenzione descritta al punto 4.1.8.
   17. Passare da una scheda del foglio di lavoro all'altra presente nel file di Microsoft Excel corrente e fare riferimento al passaggio 4.1.9 per assicurarsi che i dati di rilassamento del carico non elaborati per ogni campione, indicati da una determinata scheda del foglio di lavoro, siano formattati correttamente.
   18. Salvare e chiudere il file corrente di Microsoft Excel, Relaxation | 043022.xlsx.
   19. Tornare alla directory di lavoro del software di analisi dei dati.
   20. Passare alla cartella Errore (post-rilassamento).
   21. Assicurarsi che esista uno o più file di Microsoft Excel con la stessa data (fare riferimento al passaggio 4.1.6 per informazioni dettagliate sulla denominazione dei file di Microsoft Excel corrispondenti a ciascuna data di test) presente nella cartella Relax.
       NOTA: i dati contenuti nella cartella corrente, Failure (Post-Relaxation), sono i corrispondenti dati grezzi di guasto meccanico provenienti da campioni tracheali sottoposti a prove di rilassamento da sforzo ad un allungamento fisso del 10% per 300 s.
   22. Fallimento aperto (post-rilassamento) | 043022.xlsx e riconoscere più schede del foglio di lavoro, ognuna delle quali contiene dati grezzi di guasti meccanici dagli stessi campioni presenti in Relaxation | 043022.xlsx.
   23. Assicurarsi che i campioni siano etichettati utilizzando la convenzione menzionata al punto 4.1.8 e che le etichette corrispondano a quelle in Relaxation | 043022.xlsx.
       NOTA: ad esempio, i dati nel file Microsoft Excel corrente per il TA_1_10% rappresentano dati grezzi di guasto meccanico per il campione tracheale #1 sotto carico assiale precedentemente sottoposto a test di rilassamento sotto sforzo al 10 % di allungamento fisso per 300 s.
   24. Passare da una scheda all'altra di ogni foglio di lavoro e fare riferimento al passaggio 4.1.9 per assicurarsi che la colonna di intestazione per i dati di guasto meccanico non elaborati per ogni campione sia formattata correttamente.
   25. Chiudere il file corrente di Microsoft Excel, Errore (dopo il rilassamento) | 043022.xlsx.
   26. Tornare alla directory di lavoro del software di analisi dei dati.
   27. Ripetere i passaggi da 4.1.5 a 4.1.26 per ulteriori date di prova, se applicabili.
   28. Aprire il file di Microsoft Excel, testingDates.xlsx, che indirizzerà il codice per analizzare le date di test specificate dall'utente.
   29. Elencare le date dei test nella prima colonna nel seguente formato: gg/mm/aa.
   30. Nella seconda colonna, indicare utilizzando un Y (per sì) o N (per no) se i campioni in questa particolare data di prova provenivano dal gruppo sperimentale (rilassamento dello stress seguito da guasto meccanico).
   31. Nella terza colonna, indicare utilizzando un Y (per sì) o N (per no) se alcuni campioni in questa particolare data di prova provenivano dal gruppo di controllo (guasto meccanico diretto).
   32. Ripetere i passaggi 4.1.29-4.1.31 per ulteriori date di test.
   33. Salvare e chiudere il file di Microsoft Excel corrente, testingDates.xlsx.
   34. Tornare alla directory di lavoro del software di analisi dei dati.
   35. Aprire il file di script principale, main_relax_failure.m.
   36. Selezionare la grande freccia verde sull'interfaccia del software per eseguire il codice. In alternativa, digitare run main_calc_relax nella finestra di comando.
   37. Quando richiesto, immettere livelli di allungamento fissi separati da virgole (in %) per i vari gruppi sperimentali e premere OK.
       NOTA: Nel presente studio, è stato utilizzato un solo allungamento del rilassamento dello stress, cioè inserire 10. Non includere 0% per il gruppo di controllo. Tuttavia, se i dati sono stati derivati da più allungamenti, ad esempio 10% e 20%, immettere 10,20.
   38. Quando richiesto, inserire le durate dei test di rilassamento dello stress separati da virgole (in secondi) per i vari gruppi sperimentali e premere OK.
       NOTA: Nel presente studio, i campioni tracheali sono stati mantenuti ad allungamento fisso per 300 s e quindi input 300. Tuttavia, se i dati sono stati derivati da più durate di rilassamento dello stress, ad esempio 90 s e 300 s, immettere 90.300.
2. Risposta al rilassamento dello stress viscoelastico
   1. Utilizzando il codice (main_relax_failure.m), convertire i dati del tempo di carico (Code Line 144) in dati nominali del tempo di sollecitazione utilizzando la seguente equazione¹⁹: , dove σ rappresenta lo stress (mega Pascal [MPa]), F rappresenta il carico circonferenziale o assiale (Newtons [N]) e A₀ rappresenta l'area della sezione trasversale iniziale (millimetri quadrati [mm²]).
   2. Utilizzando il codice (main_relax_failure.m), determinare le grandezze di carico e di sollecitazione di picco (linee di codice 138 e 146) in risposta all'applicazione dell'allungamento fisso del 10% sul campione all'inizio della prova di rilassamento di 300 s.
      NOTA: questi valori sono qui di seguito definiti rispettivamente carico di picco iniziale e sollecitazione di picco iniziale.
   3. Utilizzando il codice (main_relax_failure.m), calcolare la percentuale di riduzione dello stress (o carico) a 300 s (Code Lines 141 e 149) utilizzando la seguente equazione: , dove Rel% rappresenta la percentuale di rilassamento, σ(0⁺) rappresenta lo stress di picco iniziale (o carico di picco iniziale) e σ(300) rappresenta il livello di sollecitazione (o carico) registrato dopo rilassamento oltre 300 s.
   4. Fare riferimento al codice (main_relax_failure.m) per modellare la risposta di rilassamento dello stress viscoelastico (Code Lines 152-161) utilizzando un modello di decadimento esponenziale della serie Prony a due termini. Questo modello è comunemente usato per descrivere il comportamento viscoelastico di vari tessuti biologici, inclusi vari livelli delle vie aeree cartilaginee (trachea, bronchi grandi e piccoli bronchi)^21,22.
      NOTA: i valori di sollecitazione calcolati [σ(t)] sono normalizzati per produrre la seguente funzione di rilassamento ridotta: e G(0) = 1. Per confrontare le risposte viscoelastiche di rilassamento dello stress, G(t) è adattato alla curva usando la regressione non lineare dei minimi quadrati come segue: , dove t è il tempo durante il mantenimento del rilassamento dello stress, g è il coefficiente di rilassamento, τ₁ e τ ₂ e indicano i tempi di rilassamento (in secondi) che descrivono rispettivamente il comportamento a breve (iniziale) e a lungo termine (equilibrio) del tessuto.
3. Risposta meccanica ai guasti
   1. Utilizzare il codice (main_relax_failure.m) per convertire i dati di carico-spostamento (linee di codice 143-144) registrati dalla macchina di prova di trazione in dati nominali sforzo-deformazione utilizzando le equazioni menzionate nella nota seguente.
      NOTA: , dove σ rappresenta la sollecitazione nominale (MPa), F rappresenta il carico circonferenziale o assiale (N) e A 0 rappresenta l'area della sezione trasversale iniziale (mm²); , dove rappresenta la deformazione risultante, Δ L rappresenta lo spostamento eL ₀ rappresenta la lunghezza iniziale del campione. Per i campioni sottoposti a prova di trazione in caso di rottura a seguito di mantenimento dello stress rilassamento, L₀ rappresenta la lunghezza prestirata del tessuto. Ad esempio, il campione 3 (lunghezza iniziale di 8 mm) è stato pre-allungato al 10% e, pertanto, L₀ è stato considerato 8,8 mm per il calcolo dei valori di deformazione risultanti¹⁹.
   2. Utilizzare la funzione (calc_relax_failure.m) per identificare il carico massimo (cioè il carico di guasto) e lo spostamento di guasto corrispondente, nonché la sollecitazione massima (cioè la sollecitazione di guasto) e la corrispondente deformazione di guasto (linee di codice 33 e 61-63).
   3. Utilizzare la funzione (calc_relax_failure.m) per eliminare i dati di carico-spostamento dopo il carico di guasto (riga 34).
   4. Utilizzare la funzione (calc_relax_failure.m) per tracciare la curva carico-spostamento e, quando richiesto, selezionare manualmente due punti nella regione lineare della curva per approssimare la rigidità del tessuto (N/mm) (linee di codice 37-58).
      NOTA: Poiché la curva carico-spostamento è normalizzata dall'area della sezione trasversale e dalla lunghezza iniziale del campione per ottenere la curva sforzo-deformazione, il codice utilizza le coordinate x e y selezionate dall'utente dalla curva carico-spostamento per calcolare il modulo di elasticità (MPa) utilizzando la seguente equazione¹⁹: , dove E rappresenta il modulo di elasticità, x e y rappresentano le coordinate selezionate sulla curva carico-spostamento, A 0 rappresenta l'area della sezione trasversale, L₀ rappresenta la lunghezza del campione all'inizio del guasto meccanico e Δσ e Δ rappresentano rispettivamente la variazione di sollecitazione e deformazione sulla regione lineare della risposta al guasto.
   5. Ripetere il passaggio 4.3.4 per ogni campione.
4. Output dei dati
   1. Una volta eseguito correttamente il codice, assicurarsi che i risultati calcolati siano disponibili nella directory di lavoro del software di analisi dei dati come file Microsoft Excel nella seguente convenzione di denominazione: relax_failure_results_mmddyy.xlsx, in cui mmddyy verrà sostituito dalla data in cui il codice è stato eseguito.

Risultati

La figura 1 mostra il tessuto guasto vicino al sito di serraggio e la presenza di tessuto all'interno del morsetto, confermando l'assenza di scivolamento durante le prove di trazione. La figura 2 indica vari siti di cedimento, compresi i siti di serraggio superiore o inferiore o lungo la lunghezza del tessuto, che sono stati osservati durante le prove di trazione tra i campioni testati. I risultati dell'analisi dei dati sono riassunti nelle ...

Discussione

Pochissimi studi hanno riportato le proprietà stress-rilassanti della trachea^21,23. Sono necessari studi per rafforzare ulteriormente la nostra comprensione delle risposte dipendenti dal tempo del tessuto tracheale. Questo studio offre passaggi dettagliati per eseguire tali indagini; Tuttavia, devono essere garantite le seguenti fasi critiche all'interno del protocollo per prove affidabili: (1) adeguata idratazione dei tessuti, (2) distribuzione simile del tipo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable safety scalpels	Fine Science Tools Inc	10000-10
eXpert 7600	ADMET Inc.	N/A	Norwood, MA
Forceps	Fine Science Tools Inc	11006-12 and 11027-12 or 11506-12
Gauge Safe	ADMET Inc.	N/A	Free Download
Image J	NIH	N/A	Open Source
Proramming Software - MATLAB	Mathworks	N/A	version 2018A
Scissors	Fine Science Tools Inc	14094-11 or 14060-09
Sterile phosphate buffer solution	Millipore, Thomas Scientific	MFCD00131855