Исследование стресс-релаксации и реакций на неудачи в трахее

Резюме

Настоящий протокол определяет растягивающие стресс-релаксационные и отказные свойства трахеи свиней. Результаты таких методов могут помочь улучшить понимание вязкоупругих и отказных порогов трахеи и помочь продвинуть возможности вычислительных моделей легочной системы.

Аннотация

Биомеханические свойства трахеи напрямую влияют на воздушный поток и способствуют биологической функции дыхательной системы. Понимание этих свойств имеет решающее значение для понимания механизма повреждения в этой ткани. Этот протокол описывает экспериментальный подход к изучению стресс-релаксационного поведения трахеи свиней, которые были предварительно растянуты до 0% или 10% деформации в течение 300 с с последующей механической растягивающей нагрузкой до разрушения. Это исследование предоставляет подробную информацию об экспериментальном дизайне, сборе данных, анализе и предварительных результатах биомеханического тестирования трахеи свиней. Используя подробные шаги, предусмотренные в этом протоколе, и код MATLAB для анализа данных, будущие исследования могут исследовать зависящее от времени вязкоупругое поведение ткани трахеи, которое имеет решающее значение для понимания ее биомеханических реакций во время физиологических, патологических и травматических состояний. Кроме того, углубленные исследования биомеханического поведения трахеи будут критически способствовать улучшению конструкции связанных медицинских устройств, таких как эндотрахеальные имплантаты, которые широко используются во время операций.

Введение

Несмотря на свою критическую роль в легочных заболеваниях, самая большая структура дыхательных путей, трахея, имеет ограниченные исследования, детализирующие ее вязкоупругие свойства¹. Глубокое понимание зависящего от времени вязкоупругого поведения трахеи имеет решающее значение для исследований легочной механики, поскольку понимание специфических свойств материала дыхательных путей может помочь продвинуть науку о профилактике травм, диагностике и клиническом вмешательстве при легочных заболеваниях, которые являются третьей по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах ^2,3,4.

В доступных исследованиях характеристик тканей сообщалось о свойствах жесткости трахеи 5,6,7,8. Зависящие от времени механические реакции были минимально исследованы, несмотря на их важность в ремоделировании тканей, которое также изменяется патологией ^9,10. Более того, отсутствие зависящих от времени данных о реакции также ограничивает прогностические возможности вычислительных моделей легочной механики, которые в настоящее время прибегают к использованию общих конститутивных законов. Необходимо устранить этот пробел путем проведения стресс-релаксационных исследований, которые могут обеспечить необходимые характеристики материала для биофизических исследований трахеи. Текущее исследование предлагает подробную информацию о методах тестирования, сборе данных и анализе данных для изучения стресс-релаксационного поведения трахеи свиней.

протокол

Все описанные методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Дрекселя. Все трупные животные были приобретены на ферме, одобренной Министерством сельского хозяйства США (USDA), расположенной в Пенсильвании, штат США. Для настоящего исследования был использован труп самца йоркширской свиньи (3 недели).

1. Сбор ткани

1. Приобретите труп свиньи с утвержденной фермы и проведите эксперименты в течение 2 часов после эвтаназии. Держите труп на льду до тех пор, пока не будет завершен сбор ткани, чтобы обеспечить сохранение биомеханических свойств свежих тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В опубликованной литературе тестирование свежих тканей на животных обычно проводится в течение 2 часов после эвтаназии. Ссылки 11,12,13,14,15,16,17,18,19.
2. Поместите труп в положение лежа на спине, сделайте вертикальный разрез средней линии вдоль шеи и обнажите щитовидный хрящ, крикоидный хрящ и трахею от подъязычной кости до надстернальной выемки.
3. Соберите гортань и полноразмерную трахею с помощью лезвия No10 (рисунок 1А).
4. Отделите образец трахеи от гортани, а затем разрезайте трахеальную трубку продольно по всей длине с одной стороны с помощью лезвия No 10 (рисунок 1B).
5. Измерьте толщину трахеи с помощью полученного изображения поперечного сечения (полученного с помощью ImageJ²⁰, см. Таблицу материалов) (рисунок 1С). Используйте измеренную толщину ткани для расчета площади поперечного сечения во время анализа данных.
6. Разрежьте трахею на две окружные полоски шириной около 5 мм (проксимально) и две продольные полосы шириной около 5 мм (дистально), при этом минимальная длина этих полос составляет 25 мм (рисунок 1D).
7. Получите изображения четырех образцов (т.е. разрезанных полосок трахеи) рядом с линейкой. Используйте эти изображения для предоставления оцифрованных измерений ширины образца с помощью изображения J (рисунок 1E). Затем используйте эту измеренную ширину для расчета площади поперечного сечения образца во время анализа данных.
8. Убедитесь, что все образцы тканей увлажнены с использованием стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) на протяжении всего исследования. Держите образцы гидратированными в пропитанной PBS марле до готовности к тестированию. Погрузите ткань в PBS непосредственно перед тестированием на правильную гидратацию.

2. Биомеханические испытания

1. Прикрепите каждый образец к специально разработанному зажиму (см.^{предыдущие отчеты 11,12,13,14,15,16,17,18,19}) таким образом, чтобы образец удерживался продольно между зажимами (рисунок 1F).
2. Осторожно закрепите зажимы (не вызывая растяжения) на машине для испытания материалов (см. Таблицу материалов), которая имеет тензодатчик 50 Н, прикрепленный к верхнему приводу (рисунок 1G).
3. Измерьте расстояние от захвата до захвата (т.е. зажима) с помощью линейки. Используйте это расстояние в качестве начальной длины ткани для расчета деформации.
4. Выполняйте предварительную подготовку путем растягивающего нагружения каждого образца пять раз со скоростью деформации от 1% до 1% деформации.
5. Держите каждый образец при пиковом удлинении 0% или 10% в течение 300 с, чтобы исследовать вязкоупругую реакцию ткани на стресс-релаксацию.
6. После теста на стресс-релаксацию немедленно растяните ткань со скоростью 1% / с до тех пор, пока не произойдет механическая неисправность.
7. Задокументируйте место отказа и подтвердите, что не произошло скольжения, обеспечив наличие образцов в зажимах после тестирования (рисунок 1H).

3. Сбор данных

1. Не получайте никаких данных во время предварительной подготовки.
2. Записывайте видеоролики о стресс-релаксации и тестировании отказов с помощью любой цифровой камеры со скоростью не менее 30 кадров/с.
3. Получение данных о времени (с), нагрузке (N) и перемещении (мм) с помощью программного обеспечения для сбора данных (см. Таблицу материалов) со скоростью дискретизации 250 образцов/с во время нагрузочно-релаксационных испытаний и испытаний на отказ.
4. Сохраните полученные данные в виде файла .csv и используйте его для анализа данных, как описано в шаге 4.
5. Приобретайте неподвижные изображения зажатой ткани до стресса-расслабления, после стресса-расслабления и после неудачи (рисунок 2).

4. Анализ данных

1. Ввод данных
   1. Загрузите и установите программное обеспечение для анализа данных MATLAB (см. Таблицу материалов), включая наборы инструментов «Оптимизация» и «Обработка изображений».
   2. Загрузите zip-папку (Дополнительный файл кодирования 1), которая включает коды MATLAB и образец набора данных, который будет использоваться для объяснения этапов анализа данных.
   3. Перейдите к загруженной сжатой папке и извлеките ее содержимое.
   4. Откройте MATLAB и установите распакованную папку в качестве рабочего каталога. Убедитесь, что рабочий каталог содержит следующие папки и файлы, помеченные как указано в примечании ниже. Убедитесь, что в этом рабочем каталоге нет дополнительных папок или файлов, так как они могут помешать работе кода и привести к ошибке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Неудача (после релаксации), (2) Только неудача, (3) Расслабление, (4) calc_relax_failure, (5) main_relax_failure, (6) тестированиеДаты.xlsx.
   5. Перейдите в папку Только сбой .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, содержащиеся в этой папке, получены из контрольной группы в этом исследовании, т.е. биомеханические данные из образцов трахеи, которые подверглись механическому разрушению после удлинения на 0%.
   6. Храните данные из образцов, протестированных на определенную дату, в одном файле Microsoft Excel, используя следующее соглашение об именовании файлов: mmddyy. Например, данные из всех образцов трахеи контрольной группы, протестированных 30 апреля 2022 года, должны храниться в Failure Only | 043022.xlsx.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что в текущем исследовании все биомеханические испытания проводились в один день; однако, если данные были получены из нескольких дат тестирования, создайте новый файл Microsoft Excel, названный в описанном соглашении, для каждой из этих дат тестирования.
   7. Открытый сбой только | 043022.xlsx и признать, что существует несколько вкладок листа, каждая из которых содержит необработанные данные из каждого образца, подвергшегося механическому отказу в эту конкретную дату, то есть 30 апреля 2022 года.
   8. Убедитесь, что образцы помечены в соответствии со следующим соглашением: [тип образца]_[номер образца]_[вставить уровень деформации предварительного растяжения]%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, в текущем исследовании образцы трахеи контрольной группы подвергались механическому испытанию на разрушение при осевой или окружной нагрузке без какого-либо предварительного расслабления напряжения. Поэтому эти образцы называются в следующем формате: TA_1_0% и TC_1_0% соответственно. 0% означает отсутствие предварительного растяжения. Образцы трахеи из нашей экспериментальной группы сначала проводили при фиксированном удлинении при осевой или окружной нагрузке 10% для оценки реакции релаксации вязкоупругого напряжения, а затем подвергали механическому разрушению. Поэтому эти образцы называются в следующем формате: TA_1_10% и TC_1_10% (см. шаги 4.1.16 и 4.1.23, представляющие условия осевой и окружной нагрузки, соответственно).
   9. Выберите вкладку листа TA_1_0%. Убедитесь, что столбцы заголовков необработанных данных помечены в точности так, как это было выделено жирным шрифтом в примечании ниже.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Время (с), (2) Нагрузка (N),, (3) Положение (мм), (4) Диаметры (мм) ( этап 1.7), (5) Средняя площадь поперечного сечения (толщина х ширина,^мм2) (получено на этапе 1.5 и этапе 1.7), (6) Начальная длина (мм) (этап 2.3).
   10. Закройте текущий файл Microsoft Excel, только сбой | 043022.xlsx.
   11. Вернитесь в рабочий каталог программного обеспечения для анализа данных.
   12. Перейдите в папку Релаксация.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, содержащиеся в этой папке, получены из экспериментальной группы в этом исследовании, т.е. биомеханические данные из образцов трахеи, которые были подвергнуты стресс-релаксационному тестированию при фиксированном удлинении 10% в течение 300 с.
   13. Храните данные из экспериментальных групповых образцов, протестированных на определенную дату, в одном файле Microsoft Excel, используя следующее соглашение о маркировке: mmddyy.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Например, данные всех образцов трахеи экспериментальной группы, протестированных 30 апреля 2022 года, должны храниться в Relaxation | 043022.xlsx. Дополнительные сведения см. в примечании к этапу 4.1.6.
   14. Открытая релаксационная | 043022.xlsx и признать, что существует несколько вкладок листа, каждая из которых содержит необработанные данные о релаксации нагрузки из каждого образца в экспериментальной группе, которая была протестирована в эту конкретную дату, то есть 30 апреля 2022 года.
   15. Сделайте паузу и обратите внимание, что каждый из образцов, как указано на вкладках рабочего листа, включенных в этот файл Microsoft Excel, впоследствии подвергся механической неисправности при растягивающей механической нагрузке.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие данные о сбоях для каждого из присутствующих образцов должны храниться в папке Failure (Post-Relaxation), описанной далее в шаге 4.1.20.
   16. Убедитесь, что образцы помечены в соответствии с соглашением, описанным в шаге 4.1.8.
   17. Переключитесь на каждую вкладку листа, найденную в текущем файле Microsoft Excel, и обратитесь к шагу 4.1.9, чтобы убедиться, что необработанные данные о релаксации нагрузки для каждого образца, обозначенные любой заданной вкладкой листа, отформатированы правильно.
   18. Сохраните и закройте текущий файл Microsoft Excel, Релаксация | 043022.xlsx.
   19. Вернитесь в рабочий каталог программного обеспечения для анализа данных.
   20. Перейдите в папку Failure (Post-Relaxation).
   21. Убедитесь в наличии файлов Microsoft Excel с теми же датами (см. в шаге 4.1.6 для получения подробных сведений об именовании файлов Microsoft Excel, соответствующих каждой дате тестирования), что и в папке Relaxation.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, содержащиеся в текущей папке Failure (Post-Relaxation), представляют собой соответствующие необработанные данные о механическом разрушении из образцов трахеи, подвергшихся стресс-релаксационному тестированию при фиксированном удлинении 10% в течение 300 с.
   22. Открытая неудача (пострелаксация) | 043022.xlsx и распознавать несколько вкладок листа, каждая из которых содержит необработанные данные о механических неисправностях из тех же образцов, присутствующих в Relaxation | 043022.xlsx.
   23. Убедитесь, что образцы маркированы в соответствии с соглашением, упомянутым на этапе 4.1.8, и что эти знаки соответствуют знакам, указанным в | 043022.xlsx.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Например, данные в текущем файле Microsoft Excel для TA_1_10% представляют собой необработанные данные о механических разрушениях для образца трахеи No 1 при осевой нагрузке, который ранее подвергался стресс-релаксационному тестированию при фиксированном удлинении 10% в течение 300 с.
   24. Перейдите по каждой вкладке листа и обратитесь к шагу 4.1.9, чтобы убедиться, что столбец заголовка для необработанных данных о механических неисправностях для каждого образца отформатирован правильно.
   25. Закройте текущий файл Microsoft Excel, Сбой (после расслабления) | 043022.xlsx.
   26. Вернитесь в рабочий каталог программного обеспечения для анализа данных.
   27. Повторите шаги 4.1.5-4.1.26 для дополнительных дат испытаний, если это применимо.
   28. Откройте файл Microsoft Excel testingDates.xlsx, который направит код на анализ заданных пользователем дат тестирования.
   29. Перечислите даты тестирования в первой колонке в следующем формате: мм/дд/гг.
   30. Во второй колонке укажите, используя Y (для да) или N (для нет), были ли какие-либо образцы на эту конкретную дату испытания из экспериментальной группы (расслабление напряжения с последующим механическим разрушением).
   31. В третьей колонке укажите, используя Y (для да) или N (для нет), были ли какие-либо образцы на эту конкретную дату испытания из контрольной группы (прямое механическое разрушение).
   32. Повторите шаги 4.1.29-4.1.31 для дополнительных дат тестирования.
   33. Сохраните и закройте текущий файл Microsoft Excel, testDates.xlsx.
   34. Вернитесь в рабочий каталог программного обеспечения для анализа данных.
   35. Откройте файл основного скрипта , main_relax_failure.m.
   36. Выберите большую зеленую стрелку на программном интерфейсе, чтобы запустить код. Также можно ввести run main_calc_relax в командном окне.
   37. При появлении запроса введите разделенные запятыми фиксированные уровни удлинения (в %) для различных экспериментальных групп и нажмите OK.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании было использовано только одно удлинение расслабления напряжения, т.е. введите 10. Не включайте 0% для контрольной группы. Однако, если данные были получены из нескольких удлинений, например 10% и 20%, то введите 10,20.
   38. При появлении запроса введите разделенные запятыми продолжительность стресс-релаксационного тестирования (в секундах) для различных экспериментальных групп и нажмите OK.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании образцы трахеи проводились при фиксированном удлинении в течение 300 с и, следовательно, на входе 300. Однако, если данные были получены из нескольких продолжительностей релаксации стресса, например, 90 с и 300 с, то введите 90 300.
2. Реакция на расслабление вязкоупругого стресса
   1. Используя код (main_relax_failure.m), преобразуйте данные о времени загрузки (кодовая строка 144) в номинальные данные о напряжении-времени, используя следующее уравнение¹⁹: , где σ представляет напряжение (мега Pascals [MPa]), F представляет окружную или осевую нагрузку (Ньютоны [N]), а A₀ представляет начальную площадь поперечного сечения (миллиметры в квадрате [мм²]).
   2. Используя код (main_relax_failure,м), определите пиковую нагрузку и величины напряжения (строки кода 138 и 146) в ответ на применение 10% фиксированного удлинения на образце в начале 300-секундного релаксационного теста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения далее называются начальной пиковой нагрузкой и начальным пиковым напряжением, соответственно.
   3. Используя код (main_relax_failure,м), рассчитайте процентное снижение напряжения (или нагрузки) на 300 с (строки кода 141 и 149), используя следующее уравнение: , где Rel% представляет процент релаксации, σ(0⁺) представляет начальное пиковое напряжение (или начальную пиковую нагрузку), а σ(300) представляет зарегистрированный уровень напряжения (или нагрузки) после расслабления более 300 с.
   4. Обратитесь к коду (main_relax_failure.m) для моделирования реакции релаксации вязкоупругого напряжения (Code Lines 152-161) с использованием модели экспоненциального распада серии Prony с двумя терминами. Эта модель обычно используется для описания вязкоупругого поведения различных биологических тканей, включая различные уровни хрящевых дыхательных путей (трахея, большие бронхи и мелкие бронхи)^21,22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитанные значения напряжений [σ(t)] нормализуются для получения следующей уменьшенной релаксационной функции: и G(0) = 1. Для сравнения вязкоупругих реакций на расслабление напряжения G(t) подгоняется кривой с использованием нелинейной регрессии наименьших квадратов следующим образом: , где t - время во время удержания релаксации напряжения, g - коэффициент релаксации, τ₁ и τ₂ и указывает время релаксации (в секундах), которое описывает краткосрочное (начальное) и долгосрочное (равновесное) поведение ткани соответственно.
3. Реакция на механические неисправности
   1. Используйте код (main_relax_failure.м.) для преобразования данных о смещении нагрузки (кодовые строки 143-144), записанных машиной для испытания на растяжение, в номинальные данные о напряжениях-деформациях с использованием уравнений, упомянутых в примечании ниже.
      ПРИМЕЧАНИЕ: , где σ представляет собой номинальное напряжение (МПа), F представляет собой окружную или осевую нагрузку (N), а A₀ представляет начальную площадь поперечного сечения (^мм2); , где представляет результирующую деформацию, ΔL представляет смещение, а L₀ представляет начальную длину образца. Для образцов, подвергшихся испытанию на растяжение после удержания релаксации напряжения, L₀ представляет собой предварительно растянутую длину ткани. Например, образец 3 (начальная длина 8 мм) предварительно растягивали до 10%, и поэтому L₀ считали 8,8 мм для расчета результирующих значений деформации¹⁹.
   2. Используйте функцию (calc_relax_failure,м), чтобы определить максимальную нагрузку (т.е. нагрузку на отказ) и соответствующее смещение при отказе, а также максимальное напряжение (т.е. напряжение отказа) и соответствующее напряжение отказа (кодовые строки 33 и 61-63).
   3. Используйте функцию (calc_relax_failure.m) для отбрасывания данных о перемещении нагрузки после нагрузки отказа (строка 34).
   4. Используйте функцию (calc_relax_failure.m) для построения кривой нагрузки-смещения и, при появлении запроса, вручную выберите две точки в линейной области кривой для аппроксимации жесткости ткани (N/mm) (кодовые строки 37-58).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку кривая нагрузка-смещение нормализуется площадью поперечного сечения и начальной длиной образца для получения кривой напряжения-деформации, код использует выбранные пользователем координаты x- и y- из кривой нагрузки-смещения для вычисления модуля упругости (МПа) с использованием следующего уравнения¹⁹: , где E представляет модуль упругости, x и y представляют выбранные координаты на кривой нагрузки-смещения, A₀ представляет площадь поперечного сечения, L₀ представляет длину образца в начале механической неисправности, а Δσ и Δ представляют собой изменение напряжения и деформации над линейной областью реакции разрушения, соответственно.
   5. Повторите шаг 4.3.4 для каждого образца.
4. Вывод данных
   1. После успешного выполнения кода убедитесь, что вычисляемые результаты доступны в рабочем каталоге программного обеспечения для анализа данных в виде файла Microsoft Excel в следующем соглашении об именовании: relax_failure_results_mmddyy.xlsx, где mmddyy будет заменен датой запуска кода.

Результаты

На рисунке 1 показана неисправная ткань вблизи места зажима и наличие ткани внутри зажима, что подтверждает отсутствие скольжения во время испытания на растяжение. На рисунке 2 показаны различные места разрушения, включая верхние или нижние участки зажи...

Обсуждение

Очень немногие исследования сообщали о стресс-релаксационных свойствах трахеи^21,23. Исследования необходимы для дальнейшего укрепления нашего понимания зависимых от времени реакций ткани трахеи. В настоящем исследовании предлагаются подробные шаги по ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable safety scalpels	Fine Science Tools Inc	10000-10
eXpert 7600	ADMET Inc.	N/A	Norwood, MA
Forceps	Fine Science Tools Inc	11006-12 and 11027-12 or 11506-12
Gauge Safe	ADMET Inc.	N/A	Free Download
Image J	NIH	N/A	Open Source
Proramming Software - MATLAB	Mathworks	N/A	version 2018A
Scissors	Fine Science Tools Inc	14094-11 or 14060-09
Sterile phosphate buffer solution	Millipore, Thomas Scientific	MFCD00131855