Un modello cronico di allenamento a intervalli ad alta intensità e obesità indotta dalla dieta per massimizzare lo sforzo fisico e indurre cambiamenti fisiologici nei ratti

Riepilogo

Questo documento presenta le risposte morfometriche e i risultati delle prestazioni di allenamento di un protocollo di allenamento a intervalli ad alta intensità (HIIT) in un modello di ratto Sprague-Dawley di obesità indotta dalla dieta. Lo scopo di questo protocollo era quello di massimizzare l'intensità dell'esercizio e determinare le risposte fisiologiche all'HIIT nei ratti magri e obesi.

Abstract

Rispetto all'allenamento continuo-moderato o a bassa intensità, l'allenamento a intervalli ad alta intensità (HIIT) è un metodo alternativo più efficiente in termini di tempo che si traduce in benefici fisiologici simili. Questo documento presenta un protocollo HIIT che può essere utilizzato per valutare vari marcatori di salute in un modello di ratto Sprague-Dawley di obesità indotta dalla dieta. Le femmine di ratto Sprague Dawley di età pari a 21 giorni sono state assegnate in modo casuale ai seguenti gruppi: controllo (CON, n = 10), allenamento con esercizio fisico (TRN, n = 10), dieta ricca di grassi (HFD, n = 10) e dieta ad alto contenuto di grassi/allenamento con esercizio fisico (HFD / TRN, n = 10). Le diete di controllo consistevano in cibo commerciale da laboratorio con il 10% di chilocalorie (kcal) da grassi (3,82 kcal/g) e le diete ad alto contenuto di grassi (HFD) consistevano nel 45% di kcal da grassi (4,7 kcal/g). Gli animali hanno avuto accesso ad libitum alla dieta loro assegnata per tutta la durata dello studio. Dopo un periodo di induzione alla dieta di 8 settimane, le coorti di esercizi hanno completato quattro sessioni HIIT a settimana per 8 settimane. Ogni sessione HIIT consisteva in 10 intervalli di 1 minuto di sprint/2 minuti di riposo utilizzando un tapis roulant per roditori con una cinghia motorizzata. Dopo le 8 settimane di addestramento, gli animali sono stati sacrificati per la raccolta dei tessuti. I risultati non hanno rivelato differenze nella distanza percorsa tra i gruppi TRN e HFD/TRN e la velocità di allenamento è aumentata costantemente per tutta la durata dello studio, con una velocità di corsa finale di 115 cm/s e 111 cm/s rispettivamente per i gruppi TRN e HFD/TRN. L'apporto calorico settimanale è diminuito (p < 0,05) nel gruppo TRN rispetto al gruppo CON, ma è aumentato (p < 0,05) nel gruppo HFD/TRN rispetto al gruppo HFD. Infine, gli animali trattati con HFD avevano un'adiposità maggiore (p < 0,05) e gli animali addestrati avevano un'adiposità ridotta (p < 0,05) rispetto ai controlli. Questo protocollo dimostra un metodo efficiente per valutare gli effetti dell'HIIT su vari esiti fisiologici in un modello di obesità indotta dalla dieta.

Introduzione

L'obesità e le condizioni di comorbidità, come le malattie cardiovascolari, le malattie metaboliche e il cancro, continuano ad essere tra i più gravi, costosi e prevenibili di tutti gli esiti sanitari. Attualmente, oltre un terzo degli adulti negli Stati Uniti e più di 1,6 miliardi di adulti in tutto il mondo sono classificati come obesi in base al loro indice di massa corporea (BMI; definito come peso in chilogrammi diviso per il quadrato di altezza in metri)¹. L'obesità come malattia deriva da una predisposizione genetica, da esposizioni ambientali e da un guasto dei normali meccanismi che regolano l'assunzione e il dispendio energetico²_. Poiché i costi umani e finanziari dell'epidemia di obesità continuano ad aumentare, c'è stata un'attenzione intensificata nel tentativo di comprendere i meccanismi coinvolti nel bilancio energetico e gli effetti della dieta e dell'esercizio fisico nella lotta contro le malattie metaboliche.

Studi precedenti hanno dimostrato che l'esposizione a diete altamente appetibili e ricche di energia stimola l'eccesso di cibo nei modelli di ratto³. L'accesso ad libitum a diete altamente appetibili determina un eccessivo aumento di peso a causa dell'aumento dell'apporto calorico⁴. Gli studi hanno anche dimostrato che l'esercizio fisico può modulare l'appetito e migliorare la sensibilità dei segnali di sazietà negli individui obesi⁵. Si teorizza che questo recupero della sensibilità della segnalazione di sazietà con l'esercizio fisico sia parzialmente mediato dall'impatto dell'esercizio fisico sulla reattività dei tessuti centrali e periferici alla leptina, un ormone regolatore chiave derivato dagli adipociti che sopprime l'appetito e stimola il dispendio energetico⁵. Sebbene questi studi abbiano indagato una varietà di protocolli di esercizio, non c'è un chiaro consenso su quale intervento sia superiore ^6,7. Ci sono alcune prove che suggeriscono che l'allenamento a intervalli ad alta intensità (HIIT), che comporta ripetute raffiche di esercizio intenso intrecciate con intervalli di recupero, può migliorare la regolazione dell'appetito più di altre forme di esercizio, come l'allenamento continuo a intensità moderata (MICT), l'allenamento continuo a intensità vigorosa o l'attività fisica volontaria⁸. Tuttavia, ci sono lacune nella conoscenza che circondano l'intersezionalità dell'allenamento a intervalli ad alta intensità, della dieta e della regolazione dell'appetito.

Studi precedenti hanno anche dimostrato che l'esercizio fisico è un potente mediatore delle comorbidità legate all'inattività, in particolare dal punto di vista delle alterazioni del tessuto muscolare e adiposo 9,10,11. Si ipotizza che questi cambiamenti di composizione portino alla promozione di uno stato antinfiammatorio che può essere responsabile del miglioramento del rischio di malattia osservato con l'esercizio^{fisico 12}. Le miochine, che sono citochine, altre piccole proteine e peptidi proteoglicani rilasciati dal muscolo scheletrico durante le contrazioni muscolari, sono stati ipotizzati come moderatori degli esiti antinfiammatori associati all'attività fisica. Al contrario, è stato dimostrato che le adipochine, molecole di segnalazione cellulare prodotte dal tessuto adiposo, svolgono principalmente un ruolo più deleterio e contribuiscono alla promozione di uno stato infiammatorio^13,14,15,16. Sebbene esistano prove significative che dimostrano che le alterazioni della composizione osservate con il MICT promuovono esiti positivi per la salute, è stato fatto meno lavoro per valutare i potenziali benefici dell'HIIT^{1 7,18}.

Infine, le malattie cardiovascolari sono ben note come la principale causa di morbilità nell'uomo e sono altamente correlate con l'obesità, la dieta e l'attività fisica¹. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per addestrare i roditori alla valutazione degli effetti dell'allenamento cardiovascolare su numerosi sistemi. In particolare, l'ipertrofia cardiaca è un marcato adattamento che si verifica con l'esercizio cardiovascolare. Questa ipertrofia consente contrazioni cardiache più robuste e l'apporto di sangue e ossigeno ai tessuti in esercizio. Ricerche precedenti suggeriscono che l'esercizio ad alta intensità ha maggiori probabilità di indurre ipertrofia cardiaca rispetto all'esercizio di intensità moderata¹⁹.

Questo protocollo aiuta a colmare le lacune della letteratura fornendo un approccio per esaminare gli effetti dell'HIIT sulla regolazione dell'appetito, sui cambiamenti di composizione (quindi, cambiamenti di miochine e adipochine) e sugli adattamenti cardiovascolari in un modello murino di obesità indotta dalla dieta. Inoltre, gli aumenti di intensità basati sulle prestazioni massimizzano i risultati dell'addestramento e assicurano che gli animali non si adattino all'allenamento e si avvicinino a un'intensità moderata più avanti nel protocollo di addestramento.

L'obiettivo generale di questo metodo è massimizzare lo sforzo fisico e identificare i cambiamenti fenotipici nei ratti Sprague-Dawley in risposta all'HIIT, all'obesità indotta dalla dieta e all'interazione di questi stimoli. Questo protocollo è unico rispetto ad altre tecniche grazie alla sua capacità di massimizzare lo sforzo durante tutto il periodo di allenamento, anche con l'aumento dei livelli di abilità e forma fisica dei ratti. Consente inoltre l'analisi simultanea dell'esercizio fisico e dell'obesità, piuttosto che concentrarsi esclusivamente sull'uno o sull'altro. In particolare, questo studio intendeva testare le seguenti ipotesi. (1) La velocità di esercizio può aumentare durante l'allenamento e la distanza percorsa dai ratti del gruppo TRN può essere maggiore rispetto al gruppo HFD/TRN²⁰. (2) L'apporto calorico settimanale medio dei ratti addestrati può essere maggiore di quello dei controlli, e questo può essere evidente all'interno di ciascuna coorte^{di dieta 21}. (3) L'aumento medio giornaliero di massa può essere maggiore nei ratti di controllo rispetto ai ratti esercitati e i ratti di controllo possono avere una massa grassa più elevata al sacrificio²¹. (4) La massa del cuore e del fegato può essere maggiore nei ratti HFD/TRN rispetto ai ratti TRN¹⁹.

Protocollo

Tutte le procedure descritte nel presente studio hanno seguito la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a edizione. Il disegno sperimentale è stato approvato dall'Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) nell'ambito dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 2019-5 presso la West Virginia School of Osteopathic Medicine. Fare riferimento alla Tabella dei materiali e alla Tabella 1 per ulteriori dettagli su tutti i materiali utilizzati in questo protocollo. Nella Figura 1 è riportato uno schema generale della sequenza temporale del protocollo.

1. Disegno sperimentale

1. Utilizzare 40 ratti Sprague-Dawley femmine di 21 giorni provenienti da una fonte commerciale (vedere la tabella dei materiali).
2. Utilizzare dispositivi di protezione adeguati quando si maneggiano gli animali in conformità con le linee guida IACUC. Queste misure di sicurezza includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'uso di guanti sterili monouso, un camice da laboratorio, copriscarpe, ecc.
3. Pesare ogni animale e calcolare la media e l'errore standard della media per assicurarsi che i gruppi non differiscano in peso. Se i gruppi differiscono, abbina i gruppi per il peso corporeo ridistribuendo gli individui più pesanti nei gruppi più leggeri e gli individui più leggeri nei gruppi più pesanti.
4. Dividi in modo casuale gli animali in quattro gruppi: controllo (CON, n = 10), dieta di controllo/esercizio fisico (TRN, n = 10), dieta/controllo ad alto contenuto di grassi (HFD, n = 10) e dieta ad alto contenuto di grassi/esercizio fisico (HFD/TRN, n = 10).
5. Alloggiare i ratti in gabbie individuali (un animale per gabbia) in un ambiente controllato (12 ore di cicli luce/buio, 21 °C ± 2 °C, 60% ± 10% di umidità) e svezzare tutti i ratti con una dieta di controllo a base di cibo da laboratorio acquistato in commercio (vedi Tabella dei materiali) per un periodo di acclimatazione di 1 settimana. Fornire a ciascuna gabbia dispositivi di arricchimento (riparo, rosicchiabili e materiale per la nidificazione).
   NOTA: La dieta CON consiste in cibo da laboratorio acquistato in commercio (vedere la Tabella dei materiali e la Tabella 1 per ulteriori dettagli) con il 10% di kcal da grassi (3,82 kcal/g).
6. Consentire l'accesso ad libitum al cibo e all'acqua durante l'esperimento.
7. Dopo il periodo di acclimatazione di 1 settimana, iniziare il periodo di dieta di 8 settimane fornendo ai gruppi HFD e HFD/TRN chow HFD. Il chow HFD (vedere la Tabella dei materiali e la Tabella 1 per ulteriori dettagli) è costituito per il 45% da kcal di grassi (4,7 kcal/g), che rappresentano la ripartizione dei macronutrienti che si trova in una tipica dieta occidentale. Garantire che tutti gli animali continuino ad avere accesso ad libitum al cibo e all'acqua.
   1. All'inizio di ogni settimana, pesa e registra la massa di cibo data a ciascun animale. Usa 140 g di cibo per nutrire ogni animale per un'intera settimana.
   2. Per pesare il chow, posizionare una barca di pesatura su una bilancia digitale elettronica di precisione (vedere Tabella dei materiali) e tarare la bilancia premendo il pulsante "tara". Mettere 140 g di chow nella bilancia e registrare il peso (g) dalla bilancia. Questo è il peso "prima".
   3. Posizionare il chow nella mangiatoia nella gabbia di stabulazione di ogni singolo animale.
   4. Se un animale inizia a scarseggiare il cibo, pesane una quantità aggiuntiva (20 g per ogni giorno rimanente) e aggiungi quel cibo al vassoio del cibo. Annota la quantità di cibo in più che viene data a ciascun animale. Potrebbe essere necessario aggiungere peso sopra il cibo nella tramoggia per consentire una maggiore facilità di consumo se gli animali hanno difficoltà a consumare i pellet (come evidenziato dai pellet arrotondati nella tramoggia).
8. Alla fine di ogni settimana, pesare il cibo rimanente per ogni animale. Ogni animale dovrebbe avere del cibo avanzato per assicurarsi di essere in grado di mangiare ad libitum. Usando la stessa bilancia, registra il cibo rimanente. Questo è il peso "dopo".
9. Sottrarre il peso "dopo" dal "peso prima" per ogni singolo animale per registrare l'assunzione di cibo (g) a settimana.
10. Dopo il periodo di induzione alla dieta di 8 settimane, inizia il protocollo di allenamento HIIT per ratti in TRN e HFD/TRN. Consiste in un regime HIIT di 8 settimane con sessioni di allenamento ogni settimana il lunedì, martedì, giovedì e venerdì (vedi "Protocollo di allenamento HIIT" di seguito) tra le 08:00 e le 10:00. Assicurarsi che tutti gli animali abbiano accesso ad libitum alle diete sperimentali assegnate durante tutto il protocollo.
    NOTA: Non esiste una standardizzazione del protocollo tra i gruppi, poiché questo protocollo è progettato per massimizzare le prestazioni di ciascuna coorte e ogni coorte può differire (a causa dei fenotipi indotti dalla dieta).
11. Sopprimere i ratti 48 ore dopo l'ultima sessione di esercizio attraverso il prelievo di tessuto vitale dopo l'induzione dell'anestesia utilizzando isoflurano per via inalatoria (5%).
    1. Inizia assicurandoti che ci sia ossigeno e isoflurano adeguati nel sistema per indurre l'anestesia. Aprire la bombola di ossigeno ruotando la valvola principale (in genere sulla parte superiore della bombola) in senso antiorario. Potrebbe esserci o meno una valvola di regolazione che deve essere aperta anche sul serbatoio dell'ossigeno, a seconda delle dimensioni del serbatoio dell'ossigeno. Inoltre, verificare che il tubo di scarico sia fissato correttamente e che il contenitore di raccolta non sia in sovrappeso.
    2. Pesare il contenitore prima dell'uso e annotare la data e il peso sul lato del contenitore. Verificare che il rubinetto sia aperto verso la camera di induzione e che il rubinetto sul cono del naso sia chiuso.
    3. Per indurre l'anestesia, posizionare l'animale nella camera di induzione e sigillare la camera fissando i dispositivi di blocco. Impostare l'isoflurano al 5% premendo il blocco di sicurezza e ruotando la manopola in senso antiorario.
    4. Quindi, ruotare la manopola alla base del flussometro di ossigeno in senso antiorario finché lo strumento non legge tra 1.5-2 L/min.
    5. Dopo 1-2 minuti, quando l'animale non è più cosciente, spegnere l'isoflurano ruotando la manopola in senso orario mentre si preme il blocco di sicurezza. Sciacquare la camera di induzione con ossigeno premendo la valvola di rilascio dell'ossigeno per 3-5 s. Sblocca la camera di induzione e rimuovi l'animale privo di sensi.
    6. Posiziona l'animale privo di sensi sulla schiena e fissa un cono nasale per fornire ulteriore anestesia. Aprire il rubinetto per l'erogazione della maschera facciale e chiudere il rubinetto per la camera di induzione. Somministrare isoflurano al 5% con ossigeno al 100% per l'anestesia tramite la maschera facciale fino a quando i riflessi del pedale non sono assenti.
       1. Controllare i riflessi del pedale applicando una pressione di pizzicamento alle dita dell'animale anestetizzato e cercando una risposta riflessa.
12. Sacrificare l'animale secondo i metodi approvati dall'IACUC (che possono variare a seconda dello studio) e sezionare attentamente i tessuti bersaglio per la misurazione e l'ulteriore analisi (tessuto adiposo sottocutaneo, tessuto adiposo perirenale, muscolo scheletrico, fegato, gonadi e cuore). A seconda dei protocolli IACUC, l'eutanasia può essere completata con la decapitazione con una ghigliottina o con il prelievo di tessuti vitali (cuore).
    1. Per raccogliere il cuore, praticare un'incisione sotto le costole e attraverso il diaframma.
       1. Localizzare il cuore e tagliare la vascolarizzazione (aorta, vena cava, arteria polmonare, vena polmonare) con forbici chirurgiche. Afferra il cuore con una pinza e taglia il tessuto connettivo per rilasciare il cuore. Lavorando velocemente, sciacquare il cuore con soluzione salina, tamponare il liquido in eccesso con una garza e registrare il peso. Se necessario, separare il ventricolo sinistro, il ventricolo destro e il setto con forbici chirurgiche e pesarli singolarmente.
       2. Mettere i campioni di tessuto cardiaco in un crioviale e congelare in azoto liquido.
    2. Successivamente, praticare un'incisione longitudinale lungo l'addome con un bisturi e due incisioni laterali dalla regione ombelicale al lato laterale dell'animale per consentire l'accesso agli organi addominali.
       1. Usando pinze e forbici chirurgiche, rimuovere tutti gli organi di interesse.
          NOTA: Per questo studio sono stati raccolti il fegato, il tessuto adiposo viscerale (addominale), il pancreas e il gastrocnemio. Il tessuto adiposo addominale è stato rimosso in una o due grandi sezioni tagliando delicatamente il tessuto connettivo intorno agli organi e alla parete della cavità corporea. Il grasso sottocutaneo non è stato raccolto, in modo simile ai metodi precedenti²²_.
       2. Per gli organi, dopo il prelievo, metterli in una bilancia pulita su una bilancia tarata. Registrare il peso (g) e posizionare i campioni in crioviali per il congelamento istantaneo.
    3. Per il gastrocnemio, praticare due incisioni lungo i lati laterali della parte inferiore della gamba e una orizzontalmente attraverso il tendine d'Achille.
       1. Tagliare o strappare il tessuto connettivo che collega la pelle alla muscolatura per esporre il gastrocnemio. Taglia il tendine d'Achille con le forbici chirurgiche il più vicino possibile al muscolo e afferra il gastrocnemio con una pinza.
       2. Segui il gastrocnemio fino al punto di connessione superiore e fai un taglio simile per liberare il muscolo.
       3. Pesare il campione su una barca di pesatura pulita e tarata, metterlo in un crioviale e congelarlo in azoto liquido.
13. Collocare immediatamente tutti gli altri campioni di tessuto raccolti in crioviali, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C. Questi tessuti possono essere conservati per future analisi di laboratorio come PCR, western blot o altri metodi in base agli obiettivi della ricerca.

2. Protocollo di allenamento HIIT

1. Per iniziare una sessione di allenamento, accendere il tapis roulant (vedere la tabella dei materiali) ruotando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità di controllo.
2. Regolare l'urto del tapis roulant a 0,00 mA ruotando la manopola sull'unità di controllo in senso antiorario finché il monitor non legge 0,00 mA.
3. Impostare l'inclinazione del tapis roulant al 5,0% allentando il dado di bloccaggio nella parte inferiore del tapis roulant e impostando l'inclinazione sulla prima tacca. Serrare nuovamente il dado di bloccaggio per fissare l'inclinazione del tapis roulant in questa posizione.
4. Sostenendo il corpo dell'animale con una mano, afferrare delicatamente la base della coda con l'altra mano e posizionare l'animale in una corsia individuale sul tapis roulant.
5. Ripetere il processo fino a quando tutte e cinque le corsie individuali del tapis roulant sono occupate da un ratto della stessa coorte.
6. Regolare la velocità del tapis roulant a 45 cm/s ruotando la manopola della velocità in senso orario finché il monitor non indica 45 cm/s. Premere il pulsante Stop/Run per avviare il tapis roulant e lasciarlo funzionare per 5 minuti. Premere nuovamente il pulsante Stop/Run per arrestare il tapis roulant dopo 5 minuti. Durante questo periodo non viene utilizzata alcuna scossa elettrica.
   NOTA: Gli animali potrebbero aver bisogno di essere incoraggiati con spazzole a setole rigide a rimanere lontani dalla griglia d'urto durante le prime fasi del protocollo per facilitare l'apprendimento di come utilizzare il tapis roulant.
7. Al termine dei 5 minuti, lasciare riposare 2 minuti prima di iniziare il periodo di allenamento. Ruotare la manopola sull'unità di controllo in senso orario fino a quando il monitor non legge la velocità iniziale corrispondente dell'allenamento. Utilizzare una velocità di corsa iniziale per la prima sessione di 55 cm/s. Per il primo sprint di ogni nuovo giorno di allenamento, utilizzare una velocità iniziale inferiore di 4 cm/s rispetto alla velocità massima raggiunta il giorno precedente.
   1. Avviare il tapis roulant premendo il pulsante Start , far correre gli animali fino a quando il monitor non legge 1:00 (1 min), quindi arrestare il tapis roulant premendo nuovamente il pulsante Stop/Run .
   2. Agitare gli animali con le spazzole per incoraggiare il movimento in avanti se l'animale raggiunge la griglia antiurto (situata nella parte posteriore del tapis roulant). Se un animale per gruppo di allenamento non risponde alle spazzole più di due volte per allenamento, accendi la griglia d'urto a 2.0 mA per il resto della sessione.
8. Dopo lo sprint, lasciare riposare gli animali per 2 min. Al termine dei 2 minuti di riposo, iniziare lo sprint successivo avviando il tapis roulant premendo il pulsante Stop/Run sull'unità di controllo. I dettagli relativi alla velocità del tapis roulant sono definiti di seguito.
   1. Aumentare la velocità di 4 cm/s per l'intervallo di scatto successivo rispetto alla velocità utilizzata in precedenza se tutti e cinque gli animali all'interno di una coorte completano l'intervallo di scatto senza bisogno di motivazione (incoraggiamento con una spazzola a setole rigide o toccando la griglia d'urto più di cinque volte) per un intervallo di sprint completo di 1 minuto. La velocità viene aumentata ruotando la manopola della velocità sull'unità di controllo in senso orario.
   2. Utilizzare la stessa velocità dell'intervallo di sprint precedente se le spazzole vengono utilizzate per incoraggiare la corsa o se un animale tocca la griglia d'urto più di cinque volte in un singolo sprint di 1 minuto.
   3. Ridurre la velocità per l'intervallo successivo di 4 cm/s se un animale si dibatte eccessivamente durante un intervallo di scatto (più di 20 s di tempo accumulato sulla griglia d'urto).
      NOTA: In base alla nostra esperienza, il 100% degli animali è stato in grado di completare la corsa richiesta. Tuttavia, potrebbe essere necessario rimuovere gli animali dallo studio a discrezione dello sperimentatore se dimostrano una riluttanza a correre o subiscono shock eccessivi.
   4. Registra la velocità e la distanza percorsa per ogni incontro.
9. Ripeti il processo per un totale di 10 sessioni di allenamento HIIT ogni giorno di allenamento. Ogni allenamento consiste in 1 minuto di corsa ad alta intensità seguito da 2 minuti di riposo.
10. Alla fine della sessione di allenamento, rimuovi ogni animale dal tapis roulant e posizionalo nella sua gabbia individuale.
11. Per ogni nuovo giorno di allenamento, la velocità di corsa iniziale per il primo incontro inizia a 4 cm/s più lenta della velocità massima ottenuta nell'allenamento del giorno precedente, con una velocità minima di 55 cm/s.

3. Analisi statistica

1. Riportare la morfometria e altre misure di risultato come medie ed errori standard.
2. Determinare le differenze tra i gruppi in un software di analisi (vedere la tabella dei materiali) utilizzando un modello a effetti misti che consente confronti multipli.
   NOTA: la correzione di Šidák è stata implementata per tenere conto di più confronti. Quando necessario, è stato implementato un modello a misure ripetute. Le differenze significative sono state determinate da p < 0,05.

Risultati

La Figura 2 mostra che le prestazioni di allenamento sono aumentate nel corso della durata del protocollo. Le velocità di marcia finali dei gruppi TRN e HFD/TRN sono state rispettivamente di 115 cm/s e 111 cm/s. La distanza di corsa totale non differiva tra i gruppi TRN e HFD/TRN (Figura 3).

L'assunzione media settimanale di mangime per gli animali che seguivano la dieta di controllo era più alta (p < 0,0001) rispetto a quelli che seguivano la dieta ad alto contenuto di grassi (103 g/settimana ± 1,0 g/settimana contro 91 g/settimana ± 1,0 g/settimana, rispettivamente). Anche l'assunzione media settimanale di mangime è risultata maggiore (p < 0,001) nei gruppi allenati rispetto ai gruppi non addestrati (98 g/settimana ± 1,3 g/settimana vs. 92,2 g/settimana ± 1,0 g/settimana, rispettivamente). Osservando le interazioni, i gruppi CON rispetto a TRN non differivano l'uno dall'altro, ma avevano un'assunzione settimanale maggiore (p < 0,05) rispetto al gruppo HFD/TRN, che mangiava di più (p < 0,05) rispetto al gruppo HFD (Figura 4). Nel tradurre l'assunzione di mangime in assunzione di kcal, gli animali con dieta ricca di grassi avevano un apporto calorico più elevato (p < 0,0001) rispetto a quelli con la dieta di controllo (430 kcal/settimana ± 4,6 kcal/settimana contro 396 kcal/settimana ± 3,7 kcal/settimana, rispettivamente). Ciò ha comportato differenze (p < 0,05) nell'apporto calorico settimanale tra tutti e quattro i gruppi, con il gruppo HFD/TRN che mostrava il maggiore apporto calorico settimanale, seguito dai gruppi HFD, CON e TRN in sequenza (Figura 5).

Il peso corporeo non differiva tra i gruppi fino alla settimana 8 del periodo di alimentazione, quando i gruppi HFD e HFD/TRN hanno raggiunto una massa maggiore (p < 0,05) rispetto ai gruppi CON e TRN (293 g ± 10,1 g e 298 g ± 13,1 g contro 270 g ± 8,6 g e 264 g ± 6,8 g, rispettivamente). I gruppi HFD e HFD/TRN sono rimasti più pesanti (p < 0,05) rispetto ai gruppi CON e TRN per il resto dello studio (raggiungendo rispettivamente 332 g ± 14,4 g, 347 g ± 16,3 g, 304 g ± 10,3 g e 304 g ± 10,1 g per i gruppi HFD, HFD/TRN, CON e TRN, rispettivamente). Il guadagno giornaliero medio (ADG) è stato maggiore (p < 0,05) negli animali addestrati rispetto a quelli non addestrati rispetto alla parte di esercizio dello studio (0,8 g/die ± 0,11 g/die vs. 0,5 g/die ± 0,09 g/die, rispettivamente) e non ci sono state differenze nell'ADG tra i gruppi CON e HFD in questo periodo. Insieme, ciò ha portato a un ADG maggiore (p < 0,05) nel gruppo HFD/TRN rispetto al gruppo HFD e nessuna differenza tra i gruppi CON e TRN (Figura 6) durante il periodo di allenamento. Tuttavia, il periodo di allenamento di 8 settimane non ha indotto una differenza di peso tra i gruppi HFD/TRN e HFD (347 g ± 16,3 g contro 331,5 g ± 14,4 g, rispettivamente).

Dopo il completamento del protocollo di addestramento, il prelievo tissutale ha rivelato che gli animali trattati con HFD avevano un'adiposità viscerale maggiore (p < 0,05) rispetto al gruppo CON (25 g ± 2,1 g contro 19 g ± 1,5 g, rispettivamente) e gli animali addestrati all'esercizio fisico avevano una riduzione (p < 0,05) adiposità viscerale rispetto agli animali di controllo (21 g ± 2,4 g contro 25 g ± 2,1 g. rispettivamente). Il gruppo HFD aveva un'adiposità viscerale maggiore (p < 0,05) rispetto ai gruppi TRN e HFD/TRN (Figura 7). La massa cardiaca era maggiore nel gruppo HFD/TRN rispetto ai gruppi CON, TRN e HFD (p < 0,05; 1,3 g ± 0,2 g vs. 1,1 g ± 0,1 g, 1,1 g ± 0,1 g e 1,0 g ± 0,1 g, rispettivamente). Non sono state osservate differenze nella massa epatica tra i gruppi. Non sono state identificate differenze nella massa di altri organi o tessuti.

Figura 1: Cronologia del protocollo di studio in base all'età dell'animale in giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Velocità HIIT durante il protocollo di addestramento per gli animali TRN e HFD/TRN per sessione. L'HIIT è stato eseguito in quattro giorni diversi ogni settimana per 8 settimane, per un totale di 32 sessioni di allenamento. Vengono presentati i dati medi per allenamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Distanza media percorsa per sprint nei gruppi TRN e HFD/TRN durante il protocollo di allenamento. L'HIIT è stato eseguito in quattro giorni diversi ogni settimana per 8 settimane, per un totale di 32 sessioni di allenamento. I dati sono presentati come media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Assunzione media settimanale di mangime delle coorti CON, TRN, HFD e HFD/TRN. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). ^a,b,cLe medie con lettere diverse differiscono (p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Apporto calorico settimanale delle coorti CON, TRN, HFD e HFD/TRN. I dati sono presentati come media ± SEM. ^a,b,c,dLe medie con lettere diverse differiscono (p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Aumento di peso medio giornaliero nelle coorti CON, TRN, HFD e HFD/TRN. I dati sono presentati come media ± SEM. ^a,bI gruppi con lettere diverse differiscono (p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Massa adiposa viscerale media all'autopsia. I dati sono presentati come media ± SEM. ^a,bI gruppi con lettere diverse differiscono (p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizioni delle diete utilizzate nel protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo efficace per esaminare gli effetti dell'HIIT su diversi marcatori di salute in un modello di obesità indotta dalla dieta. La procedura attinge a studi precedenti per consentire un metodo più efficiente in termini di tempo per esaminare più variabili di risultato, come le variabili di allenamento fisico, i marcatori di regolazione dell'appetito e le analisi invasive della composizione corporea 3,7,8,18,23,24_. Il contenuto della dieta, la durata e il protocollo di intervento dell'esercizio erano coerenti con le pubblicazioni precedenti^23,24_. In questo studio è stato acquistato un chow da laboratorio disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Il cibo da laboratorio per le diete ad alto contenuto di grassi e di controllo conteneva la stessa quantità di proteine e micronutrienti. Il contenuto di carboidrati e grassi delle diete è stato modificato per fornire un metodo sicuro per indurre l'obesità nel gruppo sperimentale (vedi Tabella 1).

Il periodo di induzione dell'obesità di 8 settimane utilizzato nel presente studio è stato modellato sulla base di ricerche precedenti che mostravano cambiamenti significativi nel peso a seguito della fornitura di cibo di laboratorio commerciale costituito dal 45% di kcal da grassi (4,7 kcal/g), che rappresenta la ripartizione dei macronutrienti riscontrata nella tipica dieta occidentale²³. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato l'efficacia di un protocollo HIIT di 8 settimane nell'influenzare l'assunzione di cibo^7,8, i profili adiposi ^18,23 e l'aumento muscolare ¹⁸. I risultati del protocollo descritto in questo studio sono coerenti con studi precedenti che riportano che l'HIIT influisce sulla regolazione dell'appetito, nonché sui cambiamenti di composizione dell'adiposità e della massa muscolare.

Un vantaggio di questo protocollo è che massimizza l'intensità dell'allenamento negli animali e mantiene il massimo sforzo per tutta la durata del protocollo. Man mano che gli animali imparano continuamente a usare il tapis roulant in modo competente e a migliorare la forma fisica, la velocità del tapis roulant aumenta di conseguenza in relazione alle loro prestazioni. Inoltre, l'uso dell'inclinazione del 5,0% consente agli animali di raggiungere la massima intensità in ogni sessione e durante tutto il protocollo più rapidamente di quanto si otterrebbe senza l'uso dell'inclinazione. Di conseguenza, le prestazioni dell'esercizio sono massimizzate per ogni allenamento e per la durata del protocollo.

Durante lo studio, un animale non è stato in grado di completare il protocollo sperimentale a causa di una malattia, con il risultato che n = 39 animali hanno completato lo studio, con solo n = 9 ratti nella coorte HFD. Questo protocollo è stato inizialmente progettato per valutare i cambiamenti nei profili delle citochine in risposta all'esercizio fisico e alla dieta, e l'analisi della potenza ha portato a una potenza superiore al 90% per identificare una differenza (p < 0,05) nella citochina bersaglio primaria (irisina). Gli studi futuri che utilizzano questo modello dovrebbero basarsi su analisi di potenza uniche per determinare le dimensioni appropriate del campione.

Questo studio è stato progettato principalmente per esaminare i risultati fisiologici dell'HIIT in un modello di roditore di obesità indotta dalla dieta e per massimizzare l'intensità dell'esercizio. Questo protocollo è stato in grado di dimostrare la variazione dell'ADG e dell'adiposità in risposta alla dieta e all'HIIT (Figura 6 e Figura 7). Studi futuri potrebbero identificare in modo specifico le risposte endocrine, miochine e adipochine all'HIIT. La delucidazione di questi meccanismi può rivelarsi utile nel trattamento e nella prevenzione dell'obesità e delle sue comorbilità.

Questo studio ha anche dimostrato l'impatto della dieta e dell'HIIT sull'assunzione di cibo. I risultati hanno indicato che quando gli animali hanno consumato una dieta ricca di grassi, gli animali addestrati hanno consumato più calorie rispetto agli animali non addestrati. Al contrario, quando gli animali hanno mangiato la dieta di controllo, gli animali addestrati hanno consumato meno calorie rispetto agli animali non addestrati, dimostrando diverse risposte di regolazione dell'appetito a seconda della composizione della dieta. Pertanto, le strategie per la perdita di peso che utilizzano l'HIIT possono essere meno efficaci per coloro che consumano contemporaneamente una dieta ricca di grassi, poiché potrebbero avere maggiori probabilità di consumare calorie in eccesso. Al contrario, l'assunzione equilibrata di macronutrienti durante l'HIIT può favorire un basso apporto calorico e, quindi, facilitare la perdita di peso. Questo modello può facilitare gli sforzi di ricerca per sviluppare una comprensione più profonda dei meccanismi alla base dell'equilibrio energetico e gli sforzi per sviluppare strategie efficaci di perdita di peso.

Infine, questo protocollo ha dimostrato la variazione del tessuto cardiaco tra le coorti, riflettendo i cambiamenti adattativi nella composizione corporea in risposta alla dieta e all'esercizio fisico. Questi dati suggeriscono che l'induzione dell'obesità seguita dall'HIIT può predisporre gli individui all'ipertrofia miocardica senza alcuna alterazione delle dimensioni epatiche. Analisi future per determinare i meccanismi alla base di questi risultati potrebbero essere utili per studiare l'ipertrofia miocardica e le connessioni metaboliche tra obesità, HIIT e malattie cardiovascolari.

Il protocollo descritto in questo studio presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, il tapis roulant utilizzato in questo studio aveva cinque corsie, che consentivano di far correre cinque ratti contemporaneamente. Mentre questo modo di eseguire il protocollo era efficiente, era difficile per un singolo ricercatore occuparsi di ciascuno degli animali contemporaneamente. C'erano occasioni in cui era difficile per l'addetto al tapis roulant dividere la propria attenzione tra i molteplici animali che avevano bisogno di essere stimolati con spazzole di setole. In futuro, sarà prioritario garantire la disponibilità di un maggior numero di personale di ricerca per assistere i protocolli di formazione. Inoltre, il modello di tapis roulant a cinque corsie non ha la capacità di misurare lo scambio gassoso e, pertanto, non è stato possibile valutare il metabolismo aerobico/anaerobico degli animali durante il protocollo. L'azienda che ha fornito il tapis roulant per roditori (vedi Tabella dei materiali) offre un tapis roulant con la capacità di misurare lo scambio di gas, ma è un tapis roulant a corsia singola e, quindi, richiederebbe molto più tempo e sforzo. Questo sforzo può essere utile, tuttavia, per i ricercatori che hanno bisogno di misurare o controllare i risultati specifici della calorimetria indiretta. Inoltre, ci sono pochissime prove disponibili su come la griglia d'urto possa influire sulle prestazioni dell'esercizio, che dovrebbero essere considerate quando si interpretano i risultati di questo modello. Infine, il protocollo di esercizio descritto in questo studio è stato progettato con giovani ratti Sprague-Dawley femmine. Studi precedenti hanno mostrato effetti sessualmente dimorfici, in particolare per quanto riguarda l'HIIT e la regolazione dell'appetito ^3,7. Sebbene siano previsti risultati simili, questo protocollo non ha testato animali di specie, età, sesso o esiti sanitari diversi.

Rispetto ai modelli precedenti, questo protocollo dimostra un metodo più efficiente in termini di tempo per valutare una serie di variabili di risultato. Ad esempio, questo protocollo è stato in grado di identificare le interazioni tra HIIT e regolazione dell'appetito in un protocollo che prevedeva quattro sessioni di allenamento a settimana per 8 settimane, rispetto a studi precedenti che prevedevano cinque sessioni di allenamento a settimana per 8 settimane,²⁴ o addirittura 12 settimane di allenamento⁸. Inoltre, questo disegno di studio ha permesso l'analisi di una varietà di indicatori di salute, come i dati sull'esercizio fisico, i marcatori della regolazione dell'appetito e la composizione corporea. Questi marcatori, così come gli adattamenti del cuore all'esercizio fisico, rappresentano mezzi promettenti per valutare anche gli adattamenti all'allenamento del sistema cardiovascolare. Le misure della funzione endoteliale, della composizione del tipo di fibra muscolare e dell'ipertrofia dei miociti cardiaci potrebbero essere facilmente aggiunte per approfondire la comprensione di questi adattamenti indotti dall'esercizio. Inoltre, questo protocollo includeva escalation di intensità basate sulle prestazioni. Questo disegno ha permesso di massimizzare i risultati dell'allenamento e ha assicurato che i ratti non si adattassero all'ambiente di esercizio e si avvicinassero a un modello di allenamento continuo di intensità moderata verso la fine dell'intervento. Ciò è illustrato nella Figura 2; in particolare, le velocità di sprint di questi animali erano più del doppio delle velocità raggiunte nelle pubblicazioni precedenti, che hanno continuato a dimostrare molti adattamenti cardiovascolari, muscolo scheletrici e termoregolatori coerenti con gli interventi HIIT²⁵.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial laboratory chow for control diet	Research Diets Inc., New Brunswick, NJ	D12450H
Commercial laboratory chow for high-fat diet	Research Diets Inc., New Brunswick, NJ	D12451
GraphPad Prism software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA
Precision Electronic Digital Scale	Ohaus Corporation, Pine Brook, NJ	V11P30
Rodent treadmill	Panlab, Barcelona, Spain
Sprague Dawley rats	Charles River, Durham, NC
Table top anesthesia machine	VetEquip Inc., Livermore, CA	V0557