Um modelo crônico de treinamento intervalado de alta intensidade e obesidade induzida por dieta para maximizar o esforço de exercício e induzir mudanças fisiológicas em ratos

Resumo

Este trabalho apresenta as respostas morfométricas e os resultados do desempenho no treinamento de um protocolo de treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT) em um modelo de obesidade induzida por dieta em ratos Sprague-Dawley. O objetivo deste protocolo foi maximizar a intensidade do exercício e determinar as respostas fisiológicas ao HIIT em ratos magros e obesos.

Resumo

Comparado ao treinamento contínuo-moderado ou de baixa intensidade, o treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT) é um método alternativo mais eficiente em termos de tempo que resulta em benefícios fisiológicos semelhantes. Este artigo apresenta um protocolo HIIT que pode ser usado para avaliar vários marcadores de saúde em um modelo de obesidade induzida por dieta em ratos Sprague-Dawley. Ratas Sprague Dawley com 21 dias de idade foram aleatoriamente distribuídas nos seguintes grupos: controle (CON, n = 10), treinamento físico (TRN, n = 10), dieta hiperlipídica (DHL, n = 10) e dieta/treinamento físico com alto teor de gordura (DHL/NRT, n = 10). As dietas controle consistiram de ração comercial de laboratório com 10% de quilocalorias (kcal) de gordura (3,82 kcal/g), e as dietas hiperlipídicas (DH) consistiram de 45% kcal de gordura (4,7 kcal/g). Os animais tiveram acesso ad libitum à dieta que lhes foi atribuída durante todo o estudo. Após um período de indução da dieta de 8 semanas, as coortes de exercício completaram quatro sessões de HIIT por semana durante 8 semanas. Cada sessão de HIIT consistiu de 10 intervalos de 1 min de sprints/2 min de descanso utilizando esteira rolante de roedores com cinta motorizada. Após as 8 semanas de treinamento, os animais foram sacrificados para coleta de tecidos. Os resultados não revelaram diferenças na distância percorrida entre os grupos NRT e DFL/NRT, e a velocidade de treinamento aumentou progressivamente ao longo do estudo, com velocidade final de corrida de 115 cm/s e 111 cm/s para os grupos NRT e DF/NRT, respectivamente. A ingestão calórica semanal foi reduzida (p < 0,05) no grupo NRT em relação ao grupo CON, mas aumentou (p < 0,05) no grupo DHL/NRT em relação ao grupo DH. Por fim, os animais do HFD apresentaram maior (p < 0,05) adiposidade, e os treinados apresentaram redução (p < 0,05) em relação aos controles. Este protocolo demonstra um método eficiente para avaliar os efeitos do HIIT sobre vários desfechos fisiológicos em um modelo de obesidade induzida por dieta.

Introdução

A obesidade e as comorbidades, como doenças cardiovasculares, metabólicas e câncer, continuam a ser alguns dos resultados de saúde mais graves, caros e evitáveis. Atualmente, mais de um terço dos adultos nos Estados Unidos e mais de 1,6 bilhão de adultos no mundo são classificados como obesos de acordo com seu índice de massa corporal (IMC; definido como peso em quilogramas dividido pelo quadrado da altura em metros)¹. A obesidade como doença resulta de uma predisposição genética, exposições ambientais e uma quebra nos mecanismos normais que regulam a ingestão e o gasto energético²_. À medida que os custos humanos e financeiros da epidemia de obesidade continuam a aumentar, tem havido um foco intensificado na tentativa de entender os mecanismos envolvidos no balanço energético e os efeitos da dieta e do exercício no combate às doenças metabólicas.

Estudos anteriores demonstraram que a exposição a dietas altamente palatáveis e densas em energia estimula o consumo excessivo em modelos de ratos³. O acesso ad libitum a dietas altamente palatáveis impulsiona o ganho excessivo de peso como resultado do aumento da ingestão calórica⁴. Estudos também demonstraram que o exercício pode modular o apetite e melhorar a sensibilidade da sinalização da saciedade em indivíduos obesos⁵. Teoriza-se que essa recuperação da sensibilidade da sinalização da saciedade com o exercício é parcialmente mediada pelo impacto do treinamento físico na reatividade dos tecidos central e periférico à leptina, um importante hormônio regulador derivado do adipócito que suprime o apetite e estimula o gasto energético⁵. Embora esses estudos tenham investigado uma variedade de protocolos de exercícios, não há um consenso claro sobre qual intervenção é superior ^6,7. Existem algumas evidências que sugerem que o treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT), que envolve repetidas explosões de exercício extenuante entrelaçadas com intervalos de recuperação, pode melhorar a regulação do apetite mais do que outras formas de exercício, como treinamento contínuo de intensidade moderada (MICT), treinamento contínuo de intensidade vigorosa^{ou atividade física} voluntária8. No entanto, existem lacunas no conhecimento sobre a interseccionalidade do treinamento intervalado de alta intensidade, dieta e regulação do apetite.

Estudos prévios também demonstraram que o exercício é um poderoso mediador de comorbidades relacionadas à inatividade, particularmente do ponto de vista de alterações no músculo e tecido adiposo9,10,11_. Hipotetiza-se que essas alterações composicionais levem à promoção de um estado anti-inflamatório que pode ser responsável pela melhora do risco de doença observado com o exercício¹². As miocinas, que são citocinas, outras pequenas proteínas e peptídeos proteoglicanos liberados do músculo esquelético durante as contrações musculares, têm sido postuladas como moderadoras dos resultados anti-inflamatórios associados à atividade física. Em contraste, as adipocinas, moléculas sinalizadoras celulares produzidas pelo tecido adiposo, têm demonstrado primariamente um papel mais deletério e contribuem para a promoção de um estado inflamatório^13,14,15,16. Embora existam evidências significativas demonstrando que as alterações composicionais observadas com a MICT promovem resultados positivos para a saúde, menos trabalho tem sido feito para avaliar os benefícios potenciais do HIIT^{1 7,18}.

Finalmente, a doença cardiovascular está bem estabelecida como a principal causa de morbidade em humanos e está altamente correlacionada com obesidade, dieta e atividade física¹. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de treinar roedores para a avaliação dos efeitos do treinamento cardiovascular em vários sistemas. Em particular, a hipertrofia cardíaca é uma adaptação marcante que ocorre com o exercício cardiovascular. Essa hipertrofia permite contrações cardíacas mais robustas e entrega de sangue e oxigênio aos tecidos em exercício. Pesquisas prévias sugerem que o exercício de alta intensidade tem maior probabilidade de induzir hipertrofia cardíaca do que o exercício de intensidade moderada¹⁹.

Este protocolo ajuda a preencher as lacunas na literatura, fornecendo uma abordagem para examinar os efeitos do HIIT na regulação do apetite, mudanças na composição (portanto, alterações de miocinas e adipocinas) e adaptações cardiovasculares em um modelo murino de obesidade induzida por dieta. Além disso, os aumentos de intensidade baseados no desempenho maximizam os resultados do treinamento e garantem que os animais não estejam se adaptando ao treinamento físico e se aproximando de uma intensidade moderada mais tarde no protocolo de treinamento.

O objetivo geral deste método é maximizar o esforço de exercício e identificar alterações fenotípicas em ratos Sprague-Dawley em resposta ao HIIT, obesidade induzida por dieta e a interação desses estímulos. Este protocolo é único em comparação com outras técnicas devido à sua capacidade de maximizar o esforço durante todo o período de treinamento, mesmo com aumentos nos níveis de habilidade e condicionamento físico dos ratos. Também permite a análise simultânea de exercício e obesidade, em vez de se concentrar apenas em um ou outro. Especificamente, este estudo teve como objetivo testar as seguintes hipóteses. (1) As velocidades de exercício podem aumentar ao longo do treinamento, e a distância percorrida pelos ratos no grupo NRT pode ser maior do que no grupo DHL/^NRT20. (2) A ingestão calórica semanal média dos ratos treinados pode ser maior do que a dos controles, e isso pode ser evidente dentro de cada coorte de dieta²¹. (3) O ganho médio diário de massa pode ser maior em ratos controle do que em ratos exercitados, e ratos controle podem ter maior massa gorda no sacrifício²¹. (4) A massa do coração e do fígado pode ser maior nos ratos HFD/TRN em comparação com os ratos TRN¹⁹.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos no presente estudo seguiram o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8ª Edição. O desenho experimental foi aprovado pelo Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) no âmbito do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 2019-5 na West Virginia School of Osteopathic Medicine. Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1 para obter detalhes adicionais sobre todos os materiais usados neste protocolo. Um esboço geral da linha do tempo do protocolo é exibido na Figura 1.

1. Delineamento experimental

1. Use 40 ratos Sprague-Dawley fêmeas de 21 dias de idade de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
2. Utilizar equipamentos de proteção adequados ao manusear os animais de acordo com as diretrizes da IACUC. Essas medidas de segurança incluem, mas não se limitam a, uso de luvas estéreis de uso único, jaleco, capas de sapato, etc.
3. Pesar cada animal e calcular a média e o erro padrão da média para garantir que os grupos não difiram em peso. Se os grupos diferirem, combine os grupos para o peso corporal, redistribuindo os indivíduos mais pesados nos grupos mais leves e os indivíduos mais leves nos grupos mais pesados.
4. Divida aleatoriamente os animais em quatro grupos: controle (CON, n = 10), dieta controle/treinamento de exercício (TRN, n = 10), dieta hiperlipídica/controle (DHL, n = 10) e dieta hiperlipídica/treinada com exercício (DHL/RNT, n = 10).
5. Alojar os ratos em gaiolas individuais (um animal por gaiola) em um ambiente controlado (ciclos claro/escuro de 12 h, 21 °C ± 2 °C, 60% ± 10% de umidade) e desmamar todos os ratos para uma dieta controle de ração de laboratório comprada comercialmente (ver Tabela de Materiais) por um período de aclimatação de 1 semana. Forneça a cada gaiola dispositivos de enriquecimento (abrigo, roedores e material de nidificação).
   NOTA: A dieta CON consiste em ração de laboratório comprada comercialmente (ver Tabela de Materiais e Tabela 1 para detalhes adicionais) com 10% kcal de gordura (3,82 kcal/g).
6. Permitir o acesso ad libitum a alimentos e água durante todo o experimento.
7. Após o período de aclimatação de 1 semana, inicie o período de dieta de 8 semanas fornecendo ração HFD e HFD/TRN. A ração HFD (ver Tabela de Materiais e Tabela 1 para detalhes adicionais) consiste em 45% kcal de gordura (4,7 kcal/g), representando a quebra de macronutrientes encontrada em uma dieta ocidental típica. Garantir que todos os animais continuem a ter acesso ad libitum a comida e água.
   1. No início de cada semana, pesar e registrar a massa de ração dada a cada animal. Use 140 g de ração para alimentar cada animal por uma semana inteira.
   2. Para pesar a ração, coloque um barco de pesagem em uma balança eletrônica digital de precisão (consulte Tabela de Materiais) e afie a balança pressionando o botão "tara". Coloque 140 g de ração no barco de pesagem e registre o peso (g) da balança. Este é o peso "antes".
   3. Coloque a ração no cocho de ração na gaiola de alojamento de cada animal.
   4. Se um animal começar a ficar sem ração, pese uma ração adicional (20 g para cada dia restante) e adicione essa ração à bandeja de comida. Registre a quantidade de ração adicional dada a cada animal. O peso pode precisar ser adicionado em cima do alimento na moega para permitir maior facilidade de consumo se os animais estiverem lutando para consumir os pellets (como evidenciado por pelotas arredondadas na moega).
8. Ao final de cada semana, pesar a ração restante para cada animal. Todos os animais deveriam ter sobras de ração para garantir que pudessem comer ad libitum. Usando a mesma escala, registre os alimentos remanescentes. Este é o peso "depois".
9. Subtrair o peso "depois" do peso "antes" de cada animal individual para registrar a ingestão alimentar (g) por semana.
10. Após o período de indução da dieta de 8 semanas, iniciar o protocolo de treinamento HIIT para ratos em TRN e HFD/TRN. Isso consiste em um regime HIIT de 8 semanas com sessões de treinamento todas as semanas às segundas, terças, quintas e sextas-feiras (consulte o "Protocolo de Treinamento HIIT" abaixo) entre 08:00 e 10:00 A.M. Certifique-se de que todos os animais tenham acesso ad libitum às suas dietas experimentais designadas durante todo o protocolo.
    OBS: Não há padronização do protocolo entre os grupos, pois este protocolo é desenhado para maximizar o desempenho de cada coorte, podendo cada coorte diferir (devido aos fenótipos induzidos pela dieta).
11. Eutanasiar os ratos 48 h após a última sessão de exercício através da coleta de tecidos vitais após indução anestésica com isoflurano inalatório (5%).
    1. Comece certificando-se de que há oxigênio e isoflurano adequados no sistema para induzir a anestesia. Abra o tanque de oxigênio girando a válvula principal (normalmente em cima do tanque) no sentido anti-horário. Pode ou não haver uma válvula reguladora que precisa ser aberta no tanque de oxigênio também, dependendo do tamanho do tanque de oxigênio. Além disso, verifique se a tubulação de exaustão está devidamente presa e se o recipiente de coleta não está acima do peso.
    2. Pese o botijão antes de usar e anote a data e o peso na lateral do botijão. Verifique se a torneira está aberta para a câmara de indução e a torneira para o cone do nariz está fechada.
    3. Para induzir a anestesia, coloque o animal na câmara de indução e sele a câmara prendendo os dispositivos de bloqueio. Ajuste o isoflurano para 5% pressionando a trava de segurança e girando o mostrador no sentido anti-horário.
    4. Em seguida, gire o mostrador na base do medidor de fluxo de oxigênio no sentido anti-horário até que o medidor leia entre 1,5-2 L/min.
    5. Após 1-2 min, quando o animal não estiver mais consciente, desligue o isoflurano girando o mostrador no sentido horário enquanto pressiona a trava de segurança. Lave a câmara de indução com oxigênio pressionando a válvula de liberação de oxigênio por 3-5 s. Destrave a câmara de indução e remova o animal inconsciente.
    6. Coloque o animal inconsciente de costas e prenda um cone nasal para aplicar mais anestesia. Abra a torneira para a entrega da máscara facial e feche a torneira para a câmara de indução. Administrar isoflurano a 5% com oxigênio a 100% para anestesia através da máscara facial até que os reflexos pediosos estejam ausentes.
       1. Verifique os reflexos do pedal aplicando uma pressão de pinça nos dedos dos pés do animal anestesiado e procurando uma resposta reflexa.
12. Sacrificar o animal de acordo com os métodos aprovados pela IACUC (que podem variar de acordo com o estudo) e dissecar cuidadosamente os tecidos-alvo para medição e análise adicional (tecido adiposo subcutâneo, tecido adiposo perirrenal, músculo esquelético, fígado, gônadas e coração). Dependendo dos protocolos da IACUC, a eutanásia pode ser completada por decapitação com guilhotina ou por coleta de tecido vital (coração).
    1. Para coletar o coração, faça uma incisão abaixo das costelas e através do diafragma.
       1. Localize o coração e corte a vasculatura (aorta, veia cava, artéria pulmonar, veia pulmonar) com tesoura cirúrgica. Pegue o coração com pinças e corte qualquer tecido conjuntivo para liberar o coração. Trabalhando rapidamente, lave o coração com soro fisiológico, elimine o excesso de líquido com gaze e registre o peso. Se necessário, separe o ventrículo esquerdo, o ventrículo direito e o septo com uma tesoura cirúrgica e pese-os individualmente.
       2. Coloque as amostras de tecido cardíaco em um criovial e congele rapidamente em nitrogênio líquido.
    2. Em seguida, faça uma incisão longitudinal pelo abdome com bisturi e duas incisões laterais da região umbilical até a lateral do animal para permitir o acesso aos órgãos abdominais.
       1. Usando fórceps e tesouras cirúrgicas, remova todos os órgãos de interesse.
          NOTA: Para este estudo, o fígado, o tecido adiposo visceral (abdominal), o pâncreas e o gastrocnêmio foram coletados. O tecido adiposo abdominal foi removido em um ou dois grandes cortes, aparando-se suavemente o tecido conjuntivo ao redor dos órgãos e da parede da cavidade corporal. A gordura subcutânea não foi coletada, semelhante aos métodos^anteriores22_.
       2. Para os órgãos, após a remoção, coloque-os em um barco de pesagem limpo em uma balança. Registar o peso (g) e colocar as amostras em criósculos para congelamento instantâneo.
    3. Para o gastrocnêmio, faça duas incisões nas laterais da perna e uma horizontalmente através do tendão de Aquiles.
       1. Corte ou rasgue o tecido conjuntivo que liga a pele à musculatura para expor o gastrocnêmio. Corte o tendão de Aquiles com uma tesoura cirúrgica o mais próximo possível do músculo e pegue o gastrocnêmio com pinças.
       2. Siga o gastrocnêmio até o ponto de conexão superior e faça um corte semelhante para liberar o músculo.
       3. Pesar a amostra num barco de pesagem limpo e, colocar num criovial e congelar rapidamente em azoto líquido.
13. Coloque imediatamente quaisquer outras amostras de tecido coletadas em criofrascos, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C. Esses tecidos podem ser guardados para futuras análises laboratoriais, como PCR, western blot ou outros métodos de acordo com os objetivos da pesquisa.

2. Protocolo de treinamento HIIT

1. Para iniciar uma sessão de treinamento, ligue a esteira (consulte Tabela de Materiais) acionando o botão liga/desliga na parte de trás da unidade de controle.
2. Ajuste o choque da esteira para 0,00 mA girando o mostrador na unidade de controle no sentido anti-horário até que o monitor leia 0,00 mA.
3. Ajuste a inclinação da esteira para 5,0% soltando a porca de travamento na parte inferior da esteira e ajustando a inclinação para o primeiro entalhe. Reaperte a porca de travamento para fixar a inclinação da esteira nessa posição.
4. Apoiando o corpo do animal com uma mão, segure suavemente a base da cauda com a outra mão e coloque o animal em uma pista individual na esteira.
5. Repita o processo até que todas as cinco pistas individuais na esteira sejam ocupadas por um rato da mesma coorte.
6. Ajuste a velocidade da esteira para 45 cm/s girando o seletor de velocidade no sentido horário até que o monitor leia 45 cm/s. Pressione o botão Parar/Executar para iniciar a esteira e deixe-a funcionar por 5 min. Pressione o botão Parar/Executar novamente para parar a esteira após 5 minutos. Nenhum choque elétrico é usado durante este tempo.
   OBS: Os animais podem precisar de incentivo com escovas de cerdas rígidas para se manterem fora da grade de choque durante as etapas iniciais do protocolo para facilitar o aprendizado de como usar a esteira.
7. Ao final dos 5 min, permita um descanso de 2 min antes de iniciar o período de treinamento. Ligue o mostrador na unidade de controle no sentido horário até que o monitor leia a velocidade inicial correspondente da sessão de treinamento. Use uma velocidade de corrida inicial para a primeira sessão de 55 cm/s. Para o primeiro sprint de cada novo dia de treino, use uma velocidade de partida 4 cm/s mais lenta do que a velocidade mais alta alcançada no dia anterior.
   1. Inicie a esteira pressionando o botão Iniciar , peça aos animais que corram até que o monitor leia 1:00 (1 min) e, em seguida, pare a esteira pressionando o botão Parar/Correr novamente.
   2. Agite os animais com escovas para incentivar o movimento para frente se o animal atingir a grade de choque (localizada na parte traseira da esteira). Se algum animal por grupo de treinamento não responder às escovas mais de duas vezes por sessão de treinamento, ligue a grade de choque para 2,0 mA no restante da sessão.
8. Após o sprint, deixe os animais descansarem por 2 min. No final dos 2 min de descanso, comece o próximo sprint iniciando a esteira pressionando o botão Stop/Run na unidade de controle. Os detalhes sobre a velocidade da esteira são definidos abaixo.
   1. Aumente a velocidade em 4 cm/s para o intervalo de sprint seguinte em relação à velocidade anterior usada se todos os cinco animais de uma coorte completarem o intervalo de sprint sem precisar de motivação (encorajamento com uma escova de cerdas rígidas ou tocar na grade de choque mais de cinco vezes) por um intervalo de sprint completo de 1 min. A velocidade é aumentada girando o botão de velocidade na unidade de controle no sentido horário.
   2. Use a mesma velocidade de intervalo do intervalo de sprint anterior se os pincéis forem usados para incentivar a corrida ou se algum animal tocar na grade de choque mais de cinco vezes em um único sprint de 1 minuto.
   3. Reduza a velocidade para o intervalo seguinte em 4 cm/s se um animal lutar excessivamente durante um intervalo de sprint (mais de 20 s de tempo acumulado na grade de choque).
      OBS: Em nossa experiência, 100% dos animais conseguiram completar a corrida necessária. No entanto, os animais podem precisar ser removidos do estudo a critério do investigador se demonstrarem falta de vontade de correr ou sofrerem choques excessivos.
   4. Registre a velocidade e a distância percorrida para cada luta.
9. Repita o processo para um total de 10 sessões de treinamento HIIT a cada dia de treinamento. Cada sessão de treinamento consiste em 1 min de corrida de alta intensidade seguido de 2 min de descanso.
10. Ao final da sessão de treinamento, retire cada animal da esteira e coloque-o em sua gaiola individual.
11. Para cada novo dia de treino, a velocidade inicial de corrida para a primeira série começa em 4 cm/s mais lenta do que a velocidade mais rápida obtida no treino do dia anterior, com uma velocidade mínima de 55 cm/s.

3. Análise estatística

1. Relate a morfometria e outras medidas de resultado como médias e erros padrão.
2. Determine as diferenças entre os grupos em um software de análise (consulte Tabela de Materiais) usando um modelo de efeitos mistos que permita comparações múltiplas.
   NOTA: A correção de Šidák foi implementada para levar em conta as comparações múltiplas. Um modelo de medidas repetidas foi implementado quando apropriado. Diferenças significativas foram determinadas por p < 0,05.

Resultados

A Figura 2 demonstra que o desempenho no treinamento aumentou ao longo da duração do protocolo. As velocidades finais de corrida dos grupos NRT e DF/NRT foram de 115 cm/s e 111 cm/s, respectivamente. A distância total percorrida não diferiu entre os grupos NRT e DF/NRT (Figura 3).

O consumo médio semanal de ração para os animais da dieta controle foi maior (p < 0,0001) do que para aqueles com dieta hiperlipídica (103 g/semana ± 1,0 g/semana vs. 91 g/semana ± 1,0 g/semana, respectivamente). O consumo médio semanal de ração também foi maior (p < 0,001) nos grupos treinados do que nos não treinados (98 g/semana ± 1,3 g/semana vs. 92,2 g/semana ± 1,0 g/semana, respectivamente). Ao analisar as interações, os grupos CON versus TRN não diferiram entre si, mas tiveram maior (p < 0,05) ingestão semanal do que o grupo DH/NRT, que comeu mais (p < 0,05) do que o grupo DH (Figura 4). Ao traduzir o consumo de ração para o consumo de kcal, os animais da dieta hiperlipídica apresentaram maior (p < 0,0001) ingestão calórica do que aqueles da dieta controle (430 kcal/semana ± 4,6 kcal/semana vs. 396 kcal/semana ± 3,7 kcal/semana, respectivamente). Isso resultou em diferenças (p < 0,05) na ingestão calórica semanal entre os quatro grupos, com o grupo DH/NRT apresentando a maior ingestão calórica semanal, seguido pelos grupos DH, CON e NRT sequencialmente (Figura 5).

O peso corporal não diferiu entre os grupos até a 8ª semana do período de alimentação, quando os grupos DH e DH/NRT atingiram maior (p < 0,05) massa do que os grupos CON e TRN (293 g ± 10,1 g e 298 g ± 13,1 g vs. 270 g ± 8,6 g e 264 g ± 6,8 g, respectivamente). Os grupos HFD e HFD/TRN permaneceram mais pesados (p < 0,05) do que os grupos CON e TRN no restante do estudo (atingindo 332 g ± 14,4 g, 347 g ± 16,3 g, 304 g ± 10,3 g e 304 g ± 10,1 g para os grupos HFD, HFD/TRN, CON e TRN, respectivamente). O ganho médio diário (GMD) foi maior (p < 0,05) nos animais treinados versus não treinados ao longo da porção de exercício do estudo (0,8 g/dia ± 0,11 g/dia vs. 0,5 g/dia ± 0,09 g/dia, respectivamente), e não houve diferenças no GMD entre os grupos CON versus DHL nesse período. Em conjunto, isso resultou em maior (p < 0,05) GMD no grupo DH/NRT do que no grupo DH e nenhuma diferença entre os grupos CON e TRN (Figura 6) ao longo do período de treinamento. No entanto, o período de treinamento de 8 semanas não induziu diferença de peso entre os grupos DH/NRT e DFL (347 g ± 16,3 g vs. 331,5 g ± 14,4 g, respectivamente).

Após a conclusão do protocolo de treinamento, a recuperação tecidual revelou que os animais em DHL apresentaram maior (p < 0,05) adiposidade visceral do que o grupo CON (25 g ± 2,1 g vs. 19 g ± 1,5 g, respectivamente), e os animais treinados com exercício apresentaram redução (p < 0,05) da adiposidade visceral em relação aos animais controle (21 g ± 2,4 g vs. 25 g ± 2,1 g, respectivamente). O grupo DH apresentou maior (p < 0,05) adiposidade visceral do que os grupos NRT e DF/NRT (Figura 7). A massa cardíaca foi maior no grupo DH/NRT do que nos grupos CON, TRN e DHL (p < 0,05; 1,3 g ± 0,2 g vs. 1,1 g ± 0,1 g, 1,1 g ± 0,1 g e 1,0 g ± 0,1 g, respectivamente). Não foram observadas diferenças na massa hepática entre os grupos. Não foram identificadas diferenças na massa de quaisquer outros órgãos ou tecidos.

Figura 1: Linha do tempo do protocolo de estudo por idade do animal em dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Velocidade HIIT durante todo o protocolo de treinamento para os animais TRN e HFD/TRN por sessão. O HIIT foi realizado em quatro dias diferentes a cada semana durante 8 semanas, resultando em 32 sessões de treinamento. Os dados médios por treino são apresentados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Distância média percorrida por sprint nos grupos TRN e HFD/TRN ao longo do protocolo de treinamento. O HIIT foi realizado em quatro dias diferentes a cada semana durante 8 semanas, resultando em 32 sessões de treinamento. Os dados são apresentados como média ± MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Consumo médio semanal de ração das coortes CON, TRN, HFD e HFD/TRN. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). ^a,b,cAs médias com letras diferentes diferem (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ingestão calórica semanal das coortes CON, TRN, HFD e HFD/TRN. Os dados são apresentados como média ± EPM. ^a,b,c,dAs médias com letras diferentes diferem (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Ganho de peso médio diário nas coortes CON, TRN, HFD e HFD/TRN. Os dados são apresentados como média ± EPM. ^a,bOs grupos com letras diferentes diferem (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Massa gordurosa visceral média à necropsia. Os dados são apresentados como média ± EPM. ^a,bOs grupos com letras diferentes diferem (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composições das dietas utilizadas no protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Este protocolo fornece um método eficaz para examinar os efeitos do HIIT em vários marcadores de saúde em um modelo de obesidade induzida por dieta. O procedimento baseia-se em estudos anteriores para permitir um método mais eficiente em termos de tempo para examinar múltiplas variáveis de desfecho, como variáveis de treinamento físico, marcadores de regulação do apetite e análises invasivas da composição corporal 3,7,8,18,23,24_. O conteúdo da dieta, a duração e o protocolo de intervenção com exercício foram consistentes com publicações anteriores^23,24_. Neste estudo, foi adquirida ração laboratorial disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). A ração de laboratório para as dietas hiperlipídicas e controle continha a mesma quantidade de proteína e micronutrientes. Os teores de carboidratos e lipídios das dietas foram modificados para fornecer um método seguro de indução da obesidade no grupo experimental (ver Tabela 1).

O período de indução da obesidade de 8 semanas utilizado no presente estudo foi modelado com base em pesquisas anteriores que mostraram mudanças significativas no peso após o fornecimento de ração comercial de laboratório consistindo de 45% kcal de gordura (4,7 kcal/g), o que representa a quebra de macronutrientes encontrada na dieta ocidental típica²³. Além disso, estudos prévios demonstraram a eficácia de um protocolo HIIT de 8 semanas em influenciar a ingestão alimentar ^7,8, o perfil adiposo ^18,23 e o ganho muscular ¹⁸. Os resultados do protocolo descrito neste estudo foram consistentes com estudos anteriores que relataram que o HIIT afeta a regulação do apetite, bem como mudanças na composição da adiposidade e massa muscular.

Um benefício desse protocolo é que ele maximiza a intensidade do treinamento físico nos animais e mantém o esforço máximo durante todo o protocolo. À medida que os animais aprendem continuamente a usar a esteira com proficiência e obter ganhos de condicionamento físico, a velocidade da esteira é aumentada de acordo com seu desempenho. Além disso, a utilização da inclinação de 5,0% permite que os animais atinjam a intensidade máxima em cada sessão e durante todo o protocolo mais rapidamente do que seria realizado sem o uso da inclinação. Como resultado, o desempenho do exercício é maximizado para cada treino e para a duração do protocolo.

Durante o estudo, um animal não conseguiu completar o protocolo experimental devido à doença, resultando em n = 39 animais completando o estudo, com apenas n = 9 ratos na coorte de DH. Esse protocolo foi inicialmente desenhado para avaliar mudanças no perfil de citocinas em resposta ao exercício e à dieta, e a análise de poder resultou em poder superior a 90% para identificar uma diferença (p < 0,05) na citocina alvo primária (irisina). Estudos futuros que utilizem esse modelo devem contar com análises de poder únicas para determinar tamanhos amostrais apropriados.

Este estudo foi projetado principalmente para examinar os resultados fisiológicos do HIIT em um modelo de roedor de obesidade induzida por dieta e maximizar a intensidade do exercício. Esse protocolo foi capaz de demonstrar variação no GMD e adiposidade em resposta à dieta e HIIT (Figura 6 e Figura 7). Estudos futuros poderiam identificar especificamente as respostas endócrinas, de miocinas e adipocinas ao HIIT. A elucidação desses mecanismos pode ser benéfica no tratamento e prevenção da obesidade e suas comorbidades.

Este estudo também demonstrou o impacto da dieta e do HIIT no consumo de ração. Os resultados indicaram que quando os animais consumiram uma dieta rica em gordura, os animais treinados consumiram mais calorias do que os animais não treinados. Em contraste, quando os animais ingeriram a dieta controle, os animais treinados consumiram menos calorias do que os animais não treinados, demonstrando diferentes respostas de regulação do apetite dependendo da composição da dieta. Portanto, estratégias de perda de peso que utilizam HIIT podem ser menos eficazes para aqueles que consomem simultaneamente uma dieta rica em gordura, pois podem ser mais propensos a consumir calorias em excesso. Por outro lado, a ingestão balanceada de macronutrientes durante o HIIT pode promover baixa ingestão calórica e, portanto, facilitar a perda de peso. Este modelo pode facilitar os esforços de pesquisa para desenvolver uma compreensão mais profunda dos mecanismos por trás do balanço energético e esforços para desenvolver estratégias eficazes de perda de peso.

Finalmente, esse protocolo demonstrou variação no tecido cardíaco entre as coortes, refletindo mudanças adaptativas na composição corporal em resposta à dieta e ao treinamento físico. Esses dados sugerem que a indução de obesidade seguida de HIIT pode predispor os indivíduos à hipertrofia miocárdica sem alterações associadas no tamanho hepático. Análises futuras para determinar os mecanismos por trás desses achados podem ser úteis para investigar a hipertrofia miocárdica e as conexões metabólicas entre obesidade, HIIT e doença cardiovascular.

O protocolo descrito neste estudo tem várias limitações. Primeiramente, a esteira utilizada neste estudo possuía cinco pistas, o que permitia a corrida de cinco ratos de uma só vez. Embora essa forma de execução do protocolo tenha sido eficiente, foi difícil para um único pesquisador atender cada um dos animais de uma só vez. Houve ocasiões em que foi difícil para o atendente da esteira dividir sua atenção entre os múltiplos animais que precisavam de estimulação com escovas de cerdas. No futuro, garantir que mais pessoal de pesquisa esteja disponível para ajudar com os protocolos de treinamento será uma prioridade. Além disso, o modelo de esteira de cinco pistas não tem a capacidade de medir as trocas gasosas e, portanto, o metabolismo aeróbio/anaeróbio dos animais durante o protocolo não pôde ser avaliado. A empresa que forneceu a esteira para roedores (ver Tabela de Materiais) oferece uma esteira com capacidade para medir as trocas gasosas, mas é uma esteira de pista simples e, portanto, exigiria tempo e esforço significativamente maiores. Esse esforço pode valer a pena, no entanto, para pesquisadores que precisam medir ou controlar desfechos específicos da calorimetria indireta. Além disso, há poucas evidências disponíveis sobre como a grade de choque pode afetar o desempenho do exercício, o que deve ser considerado na interpretação dos resultados desse modelo. Por fim, o protocolo de exercícios descrito neste estudo foi elaborado com ratas jovens da raça Sprague-Dawley. Estudos prévios demonstraram efeitos dimórficos sexuais, especialmente em relação ao HIIT e à regulação do apetite ^3,7. Embora resultados semelhantes sejam esperados, este protocolo não testou animais de diferentes espécies, idades, sexos ou desfechos de saúde.

Em comparação com modelos anteriores, este protocolo demonstra um método mais eficiente em termos de tempo para avaliar uma variedade de variáveis de desfecho. Por exemplo, esse protocolo foi capaz de identificar interações entre HIIT e regulação do apetite em um protocolo que envolveu quatro sessões de treinamento por semana durante 8 semanas, em comparação com estudos anteriores que envolveram cinco sessões de treinamento por semana durante 8 semanas²⁴ ou até 12 semanas de treinamento⁸. Além disso, esse desenho de estudo permitiu a análise de uma variedade de marcadores de saúde, como dados de exercício, marcadores de regulação do apetite e composição corporal. Esses marcadores, assim como as adaptações do coração ao treinamento físico, representam meios promissores de avaliar também as adaptações do sistema cardiovascular ao treinamento. Medidas da função endotelial, composição do tipo de fibras musculares e hipertrofia de miócitos cardíacos poderiam ser facilmente adicionadas para aprofundar o entendimento dessas adaptações induzidas pelo exercício. Além disso, esse protocolo incluiu escalonamentos baseados em desempenho na intensidade. Esse desenho permitiu maximizar os resultados do treinamento e garantiu que os ratos não se adaptassem ao ambiente de exercício e se aproximassem de um modelo de treinamento contínuo de intensidade moderada ao final da intervenção. Isso é demonstrado na Figura 2; especificamente, as velocidades de sprint desses animais foram mais do que o dobro das velocidades alcançadas em publicações anteriores, que passaram a demonstrar muitas adaptações cardiovasculares, musculares esqueléticas e termorregulatórias consistentes com intervenções HIIT²⁵.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial laboratory chow for control diet	Research Diets Inc., New Brunswick, NJ	D12450H
Commercial laboratory chow for high-fat diet	Research Diets Inc., New Brunswick, NJ	D12451
GraphPad Prism software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA
Precision Electronic Digital Scale	Ohaus Corporation, Pine Brook, NJ	V11P30
Rodent treadmill	Panlab, Barcelona, Spain
Sprague Dawley rats	Charles River, Durham, NC
Table top anesthesia machine	VetEquip Inc., Livermore, CA	V0557