Determinazione dei limiti termici per lo zooplancton utilizzando un blocco termico

Riepilogo

Il presente protocollo illustra l'uso di componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Tale gradiente può quindi essere utilizzato per determinare il limite termico superiore degli organismi planctonici, in particolare delle larve di invertebrati.

Abstract

I limiti termici e l'ampiezza sono stati ampiamente utilizzati per prevedere la distribuzione delle specie. Mentre la temperatura globale continua a salire, capire come cambia il limite termico con l'acclimatazione e come varia tra le fasi della vita e le popolazioni è vitale per determinare la vulnerabilità delle specie al riscaldamento futuro. La maggior parte degli organismi marini ha cicli di vita complessi che includono i primi stadi planctonici. Mentre quantificare il limite termico di questi piccoli stadi iniziali di sviluppo (da decine a centinaia di micron) aiuta a identificare i colli di bottiglia dello sviluppo, questo processo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni degli organismi bersaglio, del grande spazio richiesto al banco e degli elevati costi iniziali di fabbricazione. Qui viene presentata una configurazione orientata verso piccoli volumi (da ml a decine di ml). Questa configurazione combina componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Vengono inoltre presentate le specifiche di produzione della configurazione, nonché le procedure per introdurre ed enumerare individui vivi rispetto a quelli morti e calcolare la temperatura letale.

Introduzione

La tolleranza termica è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione degli organismi ^1,2. Mentre il pianeta continua a riscaldarsi a causa delle emissioni antropogeniche di carbonio, viene prestata crescente attenzione alla determinazione e all'applicazione dei limiti termici³. Vari endpoint, come la mortalità, il mancato sviluppo e la perdita di mobilità, sono stati utilizzati per determinare i limiti termici superiori e inferiori⁴. Questi limiti termici sono spesso considerati un proxy per la nicchia termica di un organismo. Queste informazioni vengono a loro volta utilizzate per identificare le specie più vulnerabili al riscaldamento globale, nonché per prevedere la distribuzione futura delle specie e le interazioni delle specie risultanti 3,5,6,7. Tuttavia, determinare i limiti termici, specialmente per i piccoli organismi planctonici, può essere difficile.

Per gli organismi planctonici, in particolare gli stadi larvali degli invertebrati marini, il limite termico può essere determinato attraverso l'esposizione cronica. L'esposizione cronica si ottiene allevando larve a diverse temperature per giorni o settimane e determinando la temperatura alla quale la sopravvivenza larvale e/o il tasso di sviluppo si riducono^di 8,9,10. Tuttavia, questo approccio richiede piuttosto tempo e richiede grandi incubatori ed esperienza nell'allevamento delle larve (vedi riferimento¹¹ per una buona introduzione alla coltura di larve di invertebrati marini).

In alternativa, l'esposizione acuta allo stress termico può essere utilizzata per determinare i limiti termici. Spesso, questo approccio di determinazione comporta il posizionamento di piccole fiale con larve in bagni asciutti a temperatura controllata 12,13,14, sfruttando le funzioni di gradiente termico nei termociclatori PCR 15,16, o mettendo fiale di vetro / tubi di microcentrifuga lungo un gradiente termico generato dal riscaldamento e raffreddamento applicati alle estremità di grandi blocchi di alluminio con fori in cui le fiale si adattano perfettamente ^{17, 18,19}. I tipici bagni secchi generano una singola temperatura; Pertanto, è necessario utilizzare più unità contemporaneamente per valutare le prestazioni in un intervallo di temperature. I termociclatori generano un gradiente, ma possono contenere solo un piccolo volume di campione (120 μL) e richiedono un'attenta manipolazione. Simile ai termociclatori, i grandi blocchi di alluminio creano gradienti di temperatura lineari e stabili. Entrambi gli approcci possono essere accoppiati con la regressione logistica o probit per calcolare la temperatura letale per il 50% della popolazione (LT₅₀)12,20,21. Tuttavia, i blocchi di alluminio utilizzati erano lunghi ~ 100 cm; Questa dimensione richiede un ampio spazio di laboratorio e l'accesso a fresatrici a controllo numerico computerizzate specializzate per praticare i fori. Insieme all'utilizzo di due bagni d'acqua di livello di ricerca per mantenere la temperatura target, il costo finanziario dell'assemblaggio della configurazione è elevato.

Pertanto, questo lavoro mira a sviluppare un mezzo alternativo per generare un gradiente di temperatura stabile e lineare con parti disponibili in commercio. Tale prodotto deve avere un ingombro ridotto e deve poter essere facilmente utilizzato per esperimenti di esposizione acuta allo stress termico per organismi planctonici. Questo protocollo è sviluppato con zooplancton di dimensioni <1 mm come organismi bersaglio e, quindi, è stato ottimizzato per l'uso di una provetta da microcentrifuga da 1,5 o 2 ml. Gli organismi di studio più grandi richiederanno contenitori più grandi delle provette di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzate e fori allargati nei blocchi di alluminio.

Oltre a rendere più accessibile l'apparato sperimentale, questo lavoro mira a semplificare la pipeline di elaborazione dei dati. Mentre il software statistico commerciale fornisce routine per calcolare LT₅₀ utilizzando la regressione logistica o probit, il costo della licenza non è banale. Pertanto, uno script facile da usare che si basa sul programma statistico open source R²² renderebbe l'analisi dei dati più accessibile.

Questo protocollo mostra come un blocco termico compatto può essere fabbricato con parti disponibili in commercio ed essere applicato per esporre lo zooplancton (larve del dollaro di sabbia Dendraster excentricus) allo stress termico acuto per determinare il loro limite termico superiore.

Protocollo

1. Fabbricazione del blocco termico

1. Collegare il riscaldatore a strisce da 120 V, 100 W al reostato (vedere Tabella dei materiali).
2. Preparare il blocco di alluminio di 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pollici x 5 pollici x 2 pollici) praticando 60 fori in una griglia 6 x 10 (vedere Tabella dei materiali). Assicurarsi che i fori siano distanziati di 2 cm da centro a centro in entrambe le direzioni. Ciascuno dovrebbe avere un diametro di 1,1 cm e una profondità di 4,2 cm (Figura 1).
   NOTA: Eseguire la foratura su una fresatrice o una pressa con punte in acciaio ad alta velocità. L'elemento riscaldante e l'elemento di raffreddamento sono stati entrambi scelti per coprire il più possibile la superficie di contatto delle superfici di 15,2 cm x 5 cm.
3. Praticare due fori aggiuntivi su una delle superfici di 20,3 cm x 5 cm tra la 1a e la 2a colonna e la 9a^e 10a^colonna, corrispondenti alle dimensioni delle sonde del regolatore di temperatura (vedi Tabella dei materiali).
4. Costruire una custodia da fogli acrilici trasparenti da 1,2 cm (0,5 pollici) (vedere la tabella dei materiali) per mantenere gli elementi in posizione e isolare il blocco termico completato. Utilizzare due strati di acrilico per isolare il lato posteriore dell'elemento riscaldante (Figura 1).
5. Nell'assemblaggio finale, applicare la pasta termica (vedere la tabella dei materiali) per massimizzare la conduttanza termica dall'elemento riscaldante nel blocco e dal blocco all'elemento di raffreddamento.

2. Determinazione delle impostazioni del gradiente termico

1. Collegare il refrigeratore a bagnomaria/acquario con tubi Tygon (vedere Tabella dei materiali). Isolare il tubo con l'isolamento del tubo di schiuma secondo necessità.
2. Inserire la sonda del termostato nei fori sul lato del blocco di alluminio. Assicurarsi che la sonda 1 sia posizionata vicino all'elemento riscaldante.
3. Posizionare i tubi di microcentrifuga riempiti fino all'orlo (1,5 ml) con acqua di rubinetto in tutti i fori fresati (60 tubi in totale).
4. Accendere il regolatore di temperatura e impostare la temperatura di arresto del riscaldamento della sonda da 1 a 35-37 °C e della sonda da 2 a 21,5-22,5 °C.
   NOTA: Il termostato proposto ha due prese che funzionano in modo indipendente; Solo la sonda 1 viene utilizzata per regolare la temperatura calda in questo particolare caso d'uso. Pertanto, impostare la temperatura della sonda 2 su quella della temperatura di fascia bassa.
5. Ruotare il reostato per accendere l'elemento riscaldante e impostarlo su medio.
6. Accendere il refrigeratore a bagnomaria/acquario e impostare la temperatura del refrigeratore a 15 °C.
7. Controllare che il blocco sia caldo su un'estremità e freddo sull'altra dopo 10 minuti.
   ATTENZIONE: Le estremità esposte dell'elemento riscaldante possono essere calde; Non toccarli.
8. Controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K (vedi Tabella dei materiali) ogni 10 minuti successivi. La temperatura si stabilizzerà dopo ~ 60 minuti e apparirà lineare (Figura 2).
9. Regolare i valori degli endpoint modificando le impostazioni del regolatore di temperatura e del bagno d'acqua in base alle esigenze.

3. Esposizione termica e enumerazione dei vivi:morti

NOTA: il passaggio 2 può essere omesso una volta determinate le impostazioni desiderate per il gradiente di temperatura.

1. Accendere il bagno d'acqua e il riscaldatore di ricircolo e impostarli rispettivamente su 15 °C e 37 °C per generare un gradiente di temperatura da 19,5 °C a 37 °C.
2. Per garantire che il gradiente termico sia lineare, posizionare tubi di microcentrifuga riempiti fino all'orlo (1,5 ml) con acqua di rubinetto in tutti i fori fresati (60 tubi in totale).
3. Lasciare che il blocco termico raggiunga la temperatura impostata aspettando 45-60 min. Controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K per vedere se ha raggiunto la temperatura prevista. Nota queste temperature.
4. Se gli organismi in studio hanno dimensioni di >500 μm e possono essere facilmente trasferiti da un contenitore all'altro (ad esempio, un copepodi), riempire una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 750 μL di acqua di mare filtrata da 0,45 μm. In alternativa, se gli organismi in studio sono piccoli, riempire una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 250 μL di acqua di mare filtrata da 0,45 μm.
   NOTA: Per i dati rappresentativi, sono state utilizzate larve del Dendraster excentrics, che sono 2, 4 e 6 giorni dopo la fecondazione (vedi Tabella dei materiali). La dimensione media (± S.D., n = 15 per ogni età) di questi individui era rispettivamente di 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm e 292 ± 14 μm. Dato che queste larve possono essere facilmente concentrate (fase 3.5), le provette della microcentrifuga sono state riempite con 750 μL di acqua di mare filtrata.
5. Concentrare la coltura degli organismi in studio con il filtraggio inverso (cioè posizionare la maglia nel contenitore contenente gli organismi in studio e rimuovere l'acqua attraverso la parte superiore della maglia), in modo che gli organismi in studio rimangano nella parte inferiore del becher¹¹.
   NOTA: Una rete di nylon da 30 μm è stata utilizzata per i dollari di sabbia larvale studiati (vedi Tabella dei materiali).
6. Risciacquare il campione animale concentrato con acqua di mare filtrata (ad esempio, quando si coltiva con alimenti algali o altri prodotti chimici). Ripetere ancora una volta il filtraggio inverso per concentrare il campione animale.
7. Inserire un numero noto di singoli organismi nelle provette di microcentrifuga riempite a metà. Contare i piccoli organismi planctonici al microscopio da dissezione (vedi Tabella dei materiali) e trasferirli con pipette Pasteur di vetro.
   NOTA: Il numero di organismi da posizionare dipende dalle dimensioni; Per i dollari di sabbia larvale che avevano dimensioni ~ 200 μm, 20 individui per tubo di microcentrifuga erano appropriati.
   ATTENZIONE: Le pipette di vetro sono più desiderabili delle pipette di plastica poiché alcuni organismi planctonici sono idrofobi e si attaccano alle superfici di plastica.
8. Aggiungere 0,45 μm di acqua di mare filtrata alle provette di microcentrifuga contenenti animali fino a quando il volume finale è di 1 ml.
9. Per consentire agli organismi di riscaldarsi gradualmente fino alla temperatura sperimentale desiderata, posizionare le provette di microcentrifuga con animali, preparate al punto 3.7, nel blocco termico a partire dall'estremità fredda. Posizionare coppie di provette per microcentrifuga su ogni fila (12 provette in totale).
10. Attendere 10 min.
11. Spostare le coppie di tubi di microcentrifuga inseriti al punto 3.9 nei fori adiacenti con temperature più calde. Posizionare ulteriori coppie di tubi per microcentrifuga in ogni fila all'estremità fredda. Ogni fila avrà ora quattro tubi. Attendere altri 10 minuti.
12. Continuare ad aggiungere provette di microcentrifuga con gli animali spostando le loro posizioni dall'estremità più fredda a quella più calda in coppia. Attendere 10 minuti tra ogni turno fino a quando il blocco termico non è completamente riempito.
    NOTA: I passaggi 3.9-3.12 sono considerati una fase di accelerazione per aumentare gradualmente la temperatura sperimentata dagli organismi di studio.
13. Lascia che gli animali incubano alla temperatura designata per 2 ore. Questa fase è la fase di esposizione a temperatura costante dell'esperimento.
    1. Controllare la temperatura delle provette della microcentrifuga con una termocoppia ogni ora se il periodo di incubazione supera le 2 ore.
       NOTA: Regolare il tempo di incubazione in base alle esigenze sperimentali. Se l'incubazione è più lunga di 2 ore, controllare la temperatura dei tubi a intervalli di tempo regolari con una termocoppia in caso di guasto imprevisto dell'apparecchiatura. Per ridurre al minimo il disturbo agli organismi in studio, posizionare in modo casuale sei o più tubi di microcentrifuga riempiti solo con acqua di mare filtrata nel blocco per il monitoraggio della temperatura.
14. Al termine del periodo di incubazione, misurare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K. Nota queste temperature.
15. Rimuovere tutti i 60 tubi di microcentrifuga con animali e metterli in supporti pre-etichettati.
16. Incubare i tubi (fase 3.14) alla temperatura predeterminata, come la temperatura di allevamento, per 1 ora, che è il periodo di recupero.
    NOTA: il periodo di recupero può essere specie-specifico. Per il dollaro di sabbia larvale, la temperatura di allevamento era di 18 °C, e quindi il campione è stato posto in una camera ambientale. Consultare la letteratura pertinente e/o condurre un esperimento di prova per assicurarsi che il conteggio dei morti vivi non sia stato influenzato dalla durata del periodo di recupero. Nei dati rappresentativi, il numero di animali vivi dopo 1 ora era lo stesso di dopo 12 o 24 ore di recupero.
17. Per enumerare la proporzione di organismo in studio che è vivo dopo l'esposizione termica, trasferire il contenuto di una singola provetta di microcentrifuga su una capsula di Petri da 35 mm utilizzando una pipetta di vetro.
18. Osserva e nota il numero relativo di individui che sono ancora attivi (vivi) e quelli che hanno preso il nuoto o si sono dissolti (morti) sotto un microscopio da dissezione. Assicurarsi che il numero totale di individui osservati sia uguale al numero di individui inseriti nei tubi nella fase 3.7. Controllare il lato delle provette della microcentrifuga e della capsula di Petri per gli individui se i numeri non corrispondono.

4. Calcolo di LT₅₀

1. Generare una tabella di dati in formato CSV con almeno le seguenti intestazioni: raggruppamento variabile di interesse, temperatura del tubo in °C, numero di individui vivi e numero di individui morti.
   NOTA: per i dati rappresentativi, la variabile di raggruppamento di interesse è sostituita dall'età poiché l'obiettivo è quello di confrontare tra gruppi di età.
2. Per adattare i dati alla regressione logistica, utilizzare un modello lineare generalizzato con una distribuzione binomiale. Il file di codifica supplementare 1 mostra uno script di esempio che utilizza il software open source R²².
3. Per determinare il limite termico superiore mediano (LT 50), calcolare il valore predittivo (cioè la temperatura) al quale il₅₀% degli individui è sopravvissuto. Il file di codifica supplementare 2 mostra uno script di esempio che utilizza la funzione dose.p dal MASS²³ in R²².

Risultati

L'obiettivo di questo protocollo è determinare il limite termico superiore dello zooplancton. Per fare ciò, è necessario un gradiente termico stabile e lineare. La configurazione proposta è stata in grado di generare un gradiente termico compreso tra 14 °C e 40 °C impostando la temperatura del bagno d'acqua a 8 °C e il riscaldatore a 39 °C (Figura 2A). Il gradiente di temperatura può essere ridotto e spostato modificando i valori finali. È stato inoltre generato un gradiente termic...

Discussione

Questo protocollo fornisce un approccio accessibile e personalizzabile per determinare i limiti termici di piccoli organismi plancton attraverso l'esposizione termica acuta. Il design a 10 fori e i punti finali di temperatura flessibili, controllati dal bagno d'acqua all'estremità inferiore e dal riscaldatore all'estremità superiore, consentono di determinare LT₅₀ con precisione. Utilizzando questo approccio, è stata rilevata una differenza nel limite termico di <1 °C (Figura 3

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm membrane filter	VWR	74300-042
½” Acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe	VWR	76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger	Omega Engineering	HH506A	Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette	Ranin
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W	McMaster-Carr	3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix	Pentair	CM2B	Use to make aritifical seawater
Denraster excentricus	M-Rep		Sand dollars from California
Dissecting microscope	Nikon	SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm)	Amazon		Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"	McMaster-Carr	86825K953	Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation	McMaster-Carr	4530K121	Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller	Amazon		Can be used in place of the lab-grade water bath
Example with larval sand dollar
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling	Amazon		Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet)	Amazon		Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators	VWR	89202-386	Can be replaced with an aquarium chiller
Microcentrifuge Tubes	VWR	76019-014	If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative
Nitex mesh filter	Self made		Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing
Pasteur pipette	VWR	14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)	Millpore-Sigma	P3911-500G
R statistical software.	The R Project for Statistical Computing
Syringe needle	VWR	89219-346	Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing	McMaster-Carr	5233K65	Adjust to match the chiller and block used
Zoo Med Repti Temp Rheostat	Chewy.com		Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output