열 블록을 사용한 동물성 플랑크톤에 대한 열 한계 결정

요약

본 프로토콜은 안정하고 선형적인 열 구배를 생성하기 위해 상업적으로 이용가능한 성분의 사용을 예시한다. 이러한 구배는 플랑크톤 유기체, 특히 무척추 동물 유충의 열 상한을 결정하는 데 사용될 수 있습니다.

초록

열 한계와 폭은 종 분포를 예측하는 데 널리 사용되었습니다. 지구 온도가 계속 상승함에 따라 순응에 따라 열 한계가 어떻게 변하고 생활 단계와 개체군간에 어떻게 변하는 지 이해하는 것이 미래의 온난화에 대한 종의 취약성을 결정하는 데 중요합니다. 대부분의 해양 생물은 초기 플랑크톤 단계를 포함하는 복잡한 수명주기를 가지고 있습니다. 이러한 작은 초기 발달 단계(수십 미크론에서 수백 미크론)의 열 한계를 정량화하면 발달 병목 현상을 식별하는 데 도움이 되지만 이 프로세스는 표적 유기체의 작은 크기, 큰 벤치 공간 요구 사항 및 높은 초기 제조 비용으로 인해 어려울 수 있습니다. 여기에서는 소량(mL에서 수십 mL)에 맞춰진 설정이 제시됩니다. 이 설정은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소를 결합하여 안정적이고 선형적인 열 구배를 생성합니다. 설정의 생산 사양과 살아있는 개체와 죽은 개체를 소개 및 열거하고 치사 온도를 계산하는 절차도 제공됩니다.

서문

열 내성은 유기체의 생존과 기능의 핵심입니다 ^1,2. 인위적인 탄소 배출로 인해 지구가 계속 따뜻해짐에 따라 열 한계의 결정 및 적용에 대한 관심이 높아지고 있습니다³. 사망률, 발달 실패 및 이동성 상실과 같은 다양한 종말점이^{열 상한} 및 하한을 결정하는 데 사용되었습니다4. 이러한 열 한계는 종종 유기체의 열 틈새에 대한 대리인으로 간주됩니다. 이 정보는 지구 온난화에 더 취약한 종을 식별하고 미래의 종 분포와 그에 따른 종 상호 작용을 예측하는 데 사용됩니다 3,5,6,7. 그러나 특히 작은 플랑크톤 유기체의 경우 열 한계를 결정하는 것은 어려울 수 있습니다.

플랑크톤 유기체, 특히 해양 무척추 동물의 애벌레 단계의 경우 열 한계는 만성 노출을 통해 결정될 수 있습니다. 만성 노출은 며칠에서 몇 주에 걸쳐 여러 온도에서 유충을 사육하고 유충 생존율 및/또는 발달률이 감소하는 온도를 결정함으로써 달성됩니다 ^8,9,10. 그러나 이 접근법은 시간이 많이 걸리고 대규모 인큐베이터와 유충 사육 경험이 필요합니다(해양 무척추 동물 유충 배양에 대한 좋은 소개는 참조¹¹ 참조).

또는 열 응력에 대한 급성 노출을 사용하여 열 한계를 결정할 수 있습니다. 종종, 이러한 결정 접근법은 온도 제어 건조 수조(12,13,14)에 유충이 있는 작은 바이알을 배치하거나, PCR 열 순환기(15,16)에서 열 구배 기능을 활용하거나, 바이알이 꼭 맞는 구멍(¹⁷)을 갖는 큰 알루미늄 블록의 단부에 가열 및 냉각을 적용하여 생성된 열 구배를 따라 유리 바이알/미세 원심분리 튜브를 배치하는 것을 포함하고^{, 18,19}. 일반적인 건식 수조는 단일 온도를 생성합니다. 따라서 온도 범위에서 성능을 평가하기 위해 여러 장치를 동시에 작동해야 합니다. 열 순환기는 그래디언트를 생성하지만 작은 시료량(120μL)만 수용하므로 신중한 조작이 필요합니다. 열 순환기와 유사하게 대형 알루미늄 블록은 선형적이고 안정적인 온도 구배를 생성합니다. 두 접근법 모두 로지스틱 또는 프로빗 회귀와 결합하여 인구의 50%(LT₅₀)12,20,21에 대한 치사 온도를 계산할 수 있습니다. 그러나 사용 된 알루미늄 블록의 길이는 ~ 100cm였습니다. 이 크기에는 넓은 실험실 공간과 구멍을 뚫기 위한 특수 컴퓨터 수치 제어 밀링 머신에 대한 액세스가 필요합니다. 목표 온도를 유지하기 위해 두 개의 연구 등급 수조를 사용하는 것과 함께 설정 조립에 드는 재정적 비용이 높습니다.

따라서이 작업은 상업적으로 이용 가능한 부품으로 안정적이고 선형적인 온도 구배를 생성하는 대체 수단을 개발하는 것을 목표로합니다. 이러한 제품은 설치 공간이 작아야하며 플랑크톤 유기체에 대한 급성 열 응력 노출 실험에 쉽게 사용할 수 있어야합니다. 이 프로토콜은 크기가 <1mm인 동물성 플랑크톤을 표적 유기체로 사용하여 개발되었으므로 1.5mL 또는 2mL 미세 원심분리 튜브의 사용에 최적화되었습니다. 더 큰 연구 유기체에는 사용되는 1.5mL 미세 원심분리 튜브보다 큰 용기와 알루미늄 블록의 확장된 구멍이 필요합니다.

실험 장치를보다 쉽게 이용할 수있게하는 것 외에도이 작업은 데이터 처리 파이프 라인을 단순화하는 것을 목표로합니다. 상용 통계 소프트웨어는 로지스틱 또는 프로빗 회귀를 사용하여 LT₅₀ 을 계산하는 루틴을 제공하지만 라이선스 비용은 적지 않습니다. 따라서 오픈 소스 통계 프로그램 R²² 에 의존하는 사용하기 쉬운 스크립트는 데이터 분석을보다 쉽게 이용할 수있게합니다.

이 프로토콜은 시판되는 부품으로 소형 열 블록을 제조하고 동물성 플랑크톤(모래 달러 Dendraster excentricus의 유충)을 급성 열 스트레스에 노출시켜 열 상한을 결정하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 히트 블록의 제작

1. 120V, 100W 스트립 히터를 가변 저항기에 배선하십시오( 재료 표 참조).
2. 6 x 10 그리드에 60개의 구멍을 뚫어 20.3cm x 15.2cm x 5cm(8인치 x 5인치 x 2인치) 알루미늄 블록을 준비합니다( 재료 표 참조). 구멍이 양방향으로 중앙에서 중앙으로 2cm 간격으로 있는지 확인하십시오. 각각의 직경은 1.1cm, 깊이는 4.2cm여야 합니다(그림 1).
   알림: 밀링 머신에서 드릴링을 수행하거나 고속 강철 드릴 비트로 드릴 프레스를 사용하십시오. 발열체 및 냉각 소자는 모두 가능한 한 15.2 cm x 5 cm 표면의 접촉면을 많이 덮도록 선택되었다.
3. 온도 컨트롤러 프로브의 크기와 일치하도록 1번째와 2^{번째 열과} 9^{번째와 10번째 열 사이의} 20.3cm x 5cm 표면 중 하나에 두 개의 추가 구멍을 뚫습니다(재료 표 참조).
4. 1.2cm(0.5인치) 투명 아크릴 시트( 재료 표 참조)로 케이스를 구성하여 요소를 제자리에 고정하고 완성된 열 블록을 단열합니다. 두 겹의 아크릴을 사용하여 발열체의 뒷면을 단열합니다(그림 1).
5. 최종 어셈블리에서 열 페이스트( 재료 표 참조)를 적용하여 발열체에서 블록으로, 블록에서 냉각 요소로의 열전도율을 최대화합니다.

2. 열 구배 설정 결정

1. 수조 / 수족관 냉각기를 Tygon 튜브와 연결하십시오 ( 재료 표 참조). 필요에 따라 폼 파이프 단열재로 튜브를 절연하십시오.
2. 온도 조절기 프로브를 알루미늄 블록 측면의 구멍에 삽입합니다. 프로브 1이 발열체 근처에 있는지 확인하십시오.
3. 가장자리까지 채워진 미세 원심 분리 튜브 (1.5 mL)에 수돗물을 모든 밀링 된 구멍 (총 60 개 튜브)에 놓습니다.
4. 온도 컨트롤러를 켜고 프로브 1의 정지 가열 온도를 35-37 °C로, 프로브 2를 21.5-22.5 °C로 설정합니다.
   알림: 제안된 온도 조절기에는 독립적으로 작동하는 두 개의 콘센트가 있습니다. 이 특정 사용 사례에서 따뜻한 온도를 조절하는 데 프로브 1만 사용됩니다. 따라서 프로브 2의 온도를 로우 엔드 온도의 온도로 설정하십시오.
5. 가변 저항기를 돌려 발열체를 켜고 중간으로 설정하십시오.
6. 수조 / 수족관 냉각기를 켜고 냉각기 온도를 15 ° C로 설정하십시오.
7. 블록의 한쪽 끝이 따뜻하고 10 분 후에 다른 쪽 끝이 식은지 확인하십시오.
   주의 : 발열체의 노출 된 끝은 뜨거울 수 있습니다. 만지지 마십시오.
8. 이후 10분마다 K형 전극( 재료 표 참조)이 있는 열전대를 사용하여 각 마이크로 원심분리기 튜브 내부의 온도를 확인합니다. 온도는 ~ 60 분 후에 안정화되고 선형으로 나타납니다 (그림 2).
9. 필요에 따라 온도 컨트롤러와 수조의 설정을 변경하여 끝점의 값을 조정합니다.

3. 열 노출 및 라이브:데드 열거

알림: 온도 구배에 대해 원하는 설정이 결정되면 2단계를 생략할 수 있습니다.

1. 재순환 수조와 히터를 켜고 각각 15 °C 및 37 °C로 설정하여 19.5 °C에서 37 °C까지의 온도 구배를 생성합니다.
2. 열 구배가 선형이 되도록 하려면 밀링된 모든 구멍(총 60개 튜브)에 수돗물로 가장자리(1.5mL)까지 채워진 미세 원심분리 튜브를 놓습니다.
3. 45-60분 동안 기다림으로써 열 블록이 설정 온도에 도달하도록 합니다. K형 전극이 있는 열전대를 사용하여 각 마이크로 원심분리기 튜브 내부의 온도를 확인하여 예상 온도에 도달했는지 확인합니다. 이 온도에 유의하십시오.
4. 연구 유기체의 크기가 >500μm이고 한 용기에서 다른 용기(예: 요각류)로 쉽게 옮길 수 있는 경우 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 750μL의 0.45μm 여과된 해수를 채웁니다. 또는 연구 유기체가 작은 경우 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 250μL의 0.45μm 여과된 해수를 채웁니다.
   참고: 대표적인 데이터를 위해, 수정 후 2, 4, 6일 후에 사용되는 모래 달러 Dendraster excentrics 의 유충이 사용되었습니다( 재료 표 참조). 이들 개체의 평균 (± S.D., 각 연령에 대해 n = 15) 크기는 각각 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm 및 292 ± 14 μm였습니다. 이러한 유충이 쉽게 농축될 수 있다는 점을 감안할 때(단계 3.5), 미세원심분리 튜브를 750μL의 여과된 해수로 채웠다.
5. 연구 유기체의 배양물을 역여과(즉, 연구 유기체를 담는 용기에 메쉬를 놓고 메쉬의 상단을 통해 물을 제거)로 농축시켜, 연구 유기체가 비커(¹¹)의 바닥에 남아 있도록 한다.
   참고 : 30 μm 나일론 메쉬가 연구 된 유충 모래 달러에 사용되었습니다 ( 재료 표 참조).
6. 농축된 동물 샘플을 여과된 해수로 헹굽니다(예: 조류 식품 또는 기타 화학 물질로 배양할 때). 역여과를 한 번 더 반복하여 동물 샘플을 농축시킨다.
7. 알려진 수의 개별 유기체를 반쯤 채워진 미세 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 해부 현미경 ( 재료 표 참조)으로 작은 플랑크톤 유기체를 세고 유리 파스퇴르 피펫으로 옮깁니다.
   참고 : 배치 할 유기체의 수는 크기에 따라 다릅니다. ~ 200 μm 크기의 유충 모래 달러의 경우 미세 원심 분리 튜브 당 20 개체가 적절했습니다.
   주의: 유리 피펫은 플라스틱 피펫보다 더 바람직한데, 일부 플랑크톤 유기체는 소수성이고 플라스틱 표면에 달라붙기 때문입니다.
8. 최종 부피가 0.45mL가 될 때까지 동물이 들어 있는 미세 원심분리 튜브에 1μm 여과된 해수를 추가합니다.
9. 유기체가 원하는 실험 온도까지 서서히 예열되도록하려면 3.7 단계에서 준비한 동물과 함께 마이크로 원심 분리기 튜브를 콜드 엔드에서 시작하는 열 블록에 넣습니다. 각 줄에 한 쌍의 마이크로 원심 분리기 튜브를 놓습니다 (총 12 개의 튜브).
10. 10분 동안 기다립니다.
11. 3.9단계에서 삽입된 한 쌍의 미세 원심분리기 튜브를 더 따뜻한 온도의 인접한 천공 구멍으로 이동합니다. 콜드 엔드의 각 행에 추가 쌍의 마이크로 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 이제 각 행에 4개의 튜브가 있습니다. 10분 더 기다립니다.
12. 동물의 위치를 더 차가운 끝에서 따뜻한 끝으로 쌍으로 이동하여 동물과 함께 미세 원심 분리기 튜브를 계속 추가하십시오. 히트 블록이 완전히 채워질 때까지 각 교대 사이에 10분 동안 기다립니다.
    참고 : 3.9-3.12 단계는 연구 유기체가 경험하는 온도를 점진적으로 높이기위한 상승 단계로 간주됩니다.
13. 동물을 지정된 온도에서 2 시간 동안 배양하게하십시오. 이 단계는 실험의 항온 노출 단계입니다.
    1. 잠복기가 2시간을 초과하는 경우 매시간 열전대가 있는 미세 원심분리기 튜브의 온도를 확인하십시오.
       참고: 실험 필요에 따라 배양 시간을 조정하십시오. 배양이 2 시간보다 길면 예기치 않은 장비 고장이 발생할 경우 열전대를 사용하여 일정한 시간 간격으로 튜브의 온도를 확인하십시오. 연구 유기체에 대한 교란을 최소화하려면 온도 모니터링을 위해 여과된 해수로만 채워진 6개 이상의 미세 원심분리기 튜브를 블록에 무작위로 배치합니다.
14. 배양 기간이 끝나면 K형 전극이 있는 열전대를 사용하여 각 미세 원심분리 튜브 내부의 온도를 측정합니다. 이 온도에 유의하십시오.
15. 동물이 있는 60개의 미세 원심분리기 튜브를 모두 제거하고 사전 라벨이 부착된 홀더에 넣습니다.
16. 튜브를 사육 온도와 같은 미리 결정된 온도에서 회복 기간인 1시간 동안 배양(단계 3.14)합니다.
    참고: 회복 기간은 종에 따라 다를 수 있습니다. 유충 모래 달러의 경우, 사육 온도는 18°C였고, 따라서 샘플을 환경 챔버에 넣었다. 관련 문헌을 참조하거나 시험 실험을 수행하여 live:dead 수가 회복 기간의 영향을 받지 않는지 확인하십시오. 대표적인 데이터에서, 1 시간 후에 살아있는 동물의 수는 회복의 12 또는 24 시간 후와 동일했다.
17. 열 노출 후 살아있는 연구 유기체의 비율을 열거하려면 유리 피펫을 사용하여 개별 미세 원심분리 튜브의 내용물을 35mm 페트리 접시에 옮깁니다.
18. 해부 현미경으로 여전히 활동적(생존)하고 수영을 하거나 용해된(죽은) 개체의 상대적인 수를 관찰하고 기록하십시오. 관찰된 총 개체 수가 3.7단계에서 튜브에 배치된 개체 수와 같은지 확인합니다. 숫자가 일치하지 않는 경우 마이크로 원심 분리기 튜브와 페트리 접시의 측면을 확인하십시오.

4. LT₅₀의 계산

1. 최소한 다음 헤더가 있는 CSV 형식의 데이터 테이블을 생성합니다: 관심 있는 그룹화 변수, 튜브의 온도(°C), 생존한 개체 수 및 사망한 개인 수.
   참고: 대표 데이터의 경우 목표가 연령 그룹 간의 비교이므로 관심 있는 그룹화 변수가 연령으로 대체됩니다.
2. 로지스틱 회귀 분석으로 데이터를 적합하려면 이항 분포가 있는 일반화 선형 모형을 사용하십시오. 보충 코딩 파일 1 은 오픈 소스 소프트웨어 R⁽²²)을 사용하는 예제 샘플 스크립트를 나타낸다.
3. 중간 열 상한(LT 50)을 결정하려면 개인의₅₀%가 생존한 예측 변수 값(즉, 온도)을 계산합니다. 보충 코딩 파일 2는^R22의 MASS²³으로부터의 함수 dose.p를 사용하는 예제 스크립트를 나타낸다.

결과

이 프로토콜의 목표는 동물성 플랑크톤의 열 상한을 결정하는 것입니다. 이를 위해서는 안정적이고 선형적인 열 구배가 필요합니다. 제안된 설정은 수조 온도를 8°C로 설정하고 히터를 39°C로 설정하여 14°C에서 40°C 범위의 열 구배를 생성할 수 있었습니다(그림 2A). 온도 구배는 끝점 값을 변경하여 좁히고 이동할 수 있습니다. 더 좁은 범위 (19 °C 내지 37 °C)를 갖는 열 구배?...

토론

이 프로토콜은 급성 열 노출을 통해 작은 플랑크톤 유기체의 열 한계를 결정하는 접근 가능하고 사용자 정의 가능한 접근 방식을 제공합니다. 하단의 수조와 상단의 히터에 의해 제어되는 10홀 설계와 유연한 온도 엔드포인트를 통해 LT₅₀을 정밀하게 결정할 수 있습니다. 이 접근 방식을 사용하면 <1°C의 열 한계 차이를 감지할 수 있습니다(그림 3). 이 접근법은 다양한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm membrane filter	VWR	74300-042
½” Acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe	VWR	76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger	Omega Engineering	HH506A	Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette	Ranin
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W	McMaster-Carr	3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix	Pentair	CM2B	Use to make aritifical seawater
Denraster excentricus	M-Rep		Sand dollars from California
Dissecting microscope	Nikon	SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm)	Amazon		Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"	McMaster-Carr	86825K953	Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation	McMaster-Carr	4530K121	Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller	Amazon		Can be used in place of the lab-grade water bath
Example with larval sand dollar
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling	Amazon		Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet)	Amazon		Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators	VWR	89202-386	Can be replaced with an aquarium chiller
Microcentrifuge Tubes	VWR	76019-014	If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative
Nitex mesh filter	Self made		Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing
Pasteur pipette	VWR	14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)	Millpore-Sigma	P3911-500G
R statistical software.	The R Project for Statistical Computing
Syringe needle	VWR	89219-346	Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing	McMaster-Carr	5233K65	Adjust to match the chiller and block used
Zoo Med Repti Temp Rheostat	Chewy.com		Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output