Определение тепловых пределов для зоопланктона с помощью теплового блока

Резюме

Настоящий протокол иллюстрирует использование коммерчески доступных компонентов для генерации стабильного и линейного теплового градиента. Такой градиент затем может быть использован для определения верхнего теплового предела планктонных организмов, особенно личинок беспозвоночных.

Аннотация

Тепловые пределы и широта широко используются для прогнозирования распространения видов. Поскольку глобальная температура продолжает расти, понимание того, как тепловой предел изменяется с акклиматизацией и как он варьируется между этапами жизни и популяциями, имеет жизненно важное значение для определения уязвимости видов к будущему потеплению. Большинство морских организмов имеют сложные жизненные циклы, которые включают ранние планктонные стадии. Хотя количественная оценка теплового предела этих небольших ранних стадий развития (от десятков до сотен микрон) помогает выявить узкие места в развитии, этот процесс может быть сложным из-за небольшого размера целевых организмов, больших требований к пространству на скамейке и высокой начальной стоимости изготовления. Здесь представлена установка, ориентированная на небольшие объемы (от мл до десятков мл). Эта установка сочетает в себе коммерчески доступные компоненты для создания стабильного и линейного теплового градиента. Также представлены производственные спецификации установки, а также процедуры введения и перечисления живых и мертвых людей и расчета летальной температуры.

Введение

Термическая толерантность является ключом к выживанию и функции организмов ^1,2. Поскольку планета продолжает нагреваться из-за антропогенных выбросов углерода, все большее внимание уделяется определению и применению тепловых пределов³. Различные конечные точки, такие как смертность, неспособность развиваться и потеря подвижности, использовались для определения как верхних, так и нижних температурных пределов⁴. Эти тепловые пределы часто считаются прокси для тепловой ниши организма. Эта информация, в свою очередь, используется для выявления видов, которые более уязвимы к глобальному потеплению, а также для прогнозирования будущего распространения видов и результирующих видовых взаимодействий 3,5,6,7. Однако определение тепловых пределов, особенно для небольших планктонных организмов, может быть сложной задачей.

Для планктонных организмов, особенно личиночных стадий морских беспозвоночных, тепловой предел может быть определен путем хронического воздействия. Хроническое воздействие достигается путем выращивания личинок при нескольких температурах в течение дней до недель и определения температуры, при которой выживаемость личинок и/или скорость развития снижаются на ^8,9,10. Однако этот подход является довольно трудоемким и требует больших инкубаторов и опыта в личиночном животноводстве (см. ссылку¹¹ для хорошего введения в культивирование личинок морских беспозвоночных).

В качестве альтернативы, острое воздействие теплового стресса может быть использовано для определения тепловых пределов. Часто этот подход к определению включает в себя помещение небольших флаконов с личинками в сухие ванны с контролируемой температурой 12,13,14, использование функций теплового градиента в тепловых циклерах ПЦР ^15,16 или помещение стеклянных флаконов / микроцентрифужных трубок вдоль теплового градиента, генерируемого примененным нагревом и охлаждением на концах больших алюминиевых блоков с отверстиями, в которые флаконы плотно помещаются^{17, 18,19.} Типичные сухие ванны генерируют единичную температуру; следовательно, несколько блоков должны эксплуатироваться одновременно для оценки производительности в диапазоне температур. Термоциклеры генерируют градиент, но вмещают только небольшой объем образца (120 мкл) и требуют тщательных манипуляций. Подобно тепловым циклерам, большие алюминиевые блоки создают линейные и стабильные температурные градиенты. Оба подхода могут быть объединены с логистической или пробитовой регрессией для вычисления летальной температуры для 50% процентов населения (LT₅₀)12,20,21. Тем не менее, используемые алюминиевые блоки были ~ 100 см в длину; этот размер требует большого лабораторного пространства и доступа к специализированным компьютерным фрезерным станкам с числовым программным управлением для сверления отверстий. Вместе с использованием двух гидромассажных водяных бань для поддержания целевой температуры финансовые затраты на сборку установки высоки.

Поэтому эта работа направлена на разработку альтернативных средств для генерации стабильного линейного градиента температуры с коммерчески доступными деталями. Такой продукт должен иметь небольшую площадь и должен быть легко использован для экспериментов по воздействию острого теплового стресса для планктонных организмов. Этот протокол разработан с использованием зоопланктона размером <1 мм в качестве целевых организмов, и, таким образом, он был оптимизирован для использования микроцентрифужной трубки объемом 1,5 или 2 мл. Более крупным исследуемым организмам потребуются контейнеры больше, чем используемые микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, и увеличенные отверстия в алюминиевых блоках.

Помимо того, чтобы сделать экспериментальный аппарат более доступным, эта работа направлена на упрощение конвейера обработки данных. В то время как коммерческое статистическое программное обеспечение предоставляет процедуры для вычисления LT₅₀ с использованием логистической или пробитной регрессии, стоимость лицензирования нетривиальна. Поэтому простой в использовании скрипт, основанный на статистической программе R²² с открытым исходным кодом, сделает анализ данных более доступным.

Этот протокол показывает, как компактный тепловой блок может быть изготовлен из коммерчески доступных деталей и применен к воздействию зоопланктона (личинок песочного доллара Dendraster excentricus) на острый тепловой стресс для определения их верхнего теплового предела.

протокол

1. Изготовление теплового блока

1. Подключите полосовой нагреватель напряжением 120 В, 100 Вт к реостату (см. Таблицу материалов).
2. Подготовьте алюминиевый блок размером 20,3 см x 15,2 см x 5 см (8 дюймов x 5 дюймов x 2 дюйма), просверлив 60 отверстий в сетке 6 x 10 (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что отверстия расположены на расстоянии 2 см от центра до центра в обоих направлениях. Каждый из них должен быть 1,1 см в диаметре и 4,2 см в глубину (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните сверление на фрезерном станке или сверлильном прессе с высокоскоростными стальными сверлами. Нагревательный элемент и охлаждающий элемент были выбраны таким образом, чтобы покрыть как можно большую часть контактной поверхности поверхностей размером 15,2 см х 5 см.
3. Просверлите два дополнительных отверстия на одной из поверхностей размером 20,3 см х 5 см между^1-й и^2-й колоннами и^9-й и 10-й колоннами, соответствующие размеру датчиков регулятора температуры (см. Таблицу материалов).
4. Сконструируйте корпус из прозрачных акриловых листов размером 1,2 см (0,5 дюйма) (см. Таблицу материалов), чтобы удерживать элементы на месте и изолировать готовый тепловой блок. Используйте два слоя акрила для изоляции задней стороны нагревательного элемента (рисунок 1).
5. При окончательной сборке нанесите термопасту (см. Таблицу материалов) для максимизации теплопроводности от нагревательного элемента в блок и от блока к охлаждающему элементу.

2. Определение параметров теплового градиента

1. Соедините водяную баню/аквариумный чиллер с трубкой Tygon (см. Таблицу материалов). При необходимости изолируйте трубы изоляцией из пенопласта.
2. Вставьте датчик термостата в отверстия на боковой стороне алюминиевого блока. Убедитесь, что зонд 1 расположен рядом с нагревательным элементом.
3. Поместите микроцентрифужные трубки, заполненные до краев (1,5 мл) водопроводной водой, во все фрезерованные отверстия (всего 60 трубок).
4. Включите регулятор температуры и установите температуру стоп-нагрева зонда 1 на 35-37 °C и зонда 2 на 21,5-22,5 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемый термостат имеет два выхода, которые работают независимо; только зонд 1 используется для регулирования температуры тепла в данном конкретном случае использования. Поэтому установите температуру зонда 2 на температуру низкого уровня.
5. Поверните реостат, чтобы включить нагревательный элемент и установить его на средний.
6. Включите водяную баню/аквариумный чиллер и установите температуру чиллера на 15 °C.
7. Убедитесь, что блок теплый на одном конце и холодный на другом через 10 минут.
   ВНИМАНИЕ: Открытые концы нагревательного элемента могут быть горячими; не трогайте их.
8. Проверяйте температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки с помощью термопары с электродом К-типа (см. Таблицу материалов) каждые 10 минут после этого. Температура стабилизируется через ~60 мин и будет казаться линейной (рисунок 2).
9. Отрегулируйте значения конечных точек, изменив настройки регулятора температуры и водяной бани по мере необходимости.

3. Тепловое воздействие и перечисление живых:мертвых

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2 может быть опущен после определения желаемых настроек градиента температуры.

1. Включите циркуляционную водяную баню и нагреватель и установите их на 15 °C и 37 °C соответственно, чтобы создать градиент температуры от 19,5 °C до 37 °C.
2. Чтобы убедиться, что тепловой градиент является линейным, поместите микроцентрифужные трубки, заполненные до краев (1,5 мл) водопроводной водой, во все фрезерованные отверстия (всего 60 трубок).
3. Дайте тепловому блоку достичь заданной температуры, подождав 45-60 мин. Проверьте температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки с помощью термопары с электродом K-типа, чтобы увидеть, достигла ли она ожидаемой температуры. Обратите внимание на эти температуры.
4. Если исследуемые организмы имеют размер >500 мкм и могут быть легко перенесены из одного контейнера в другой (например, копепод), заполните микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл 750 мкл 0,45 мкм фильтрованной морской воды. В качестве альтернативы, если исследуемые организмы небольшие, заполните микроцентрифужную трубку 1,5 мл 250 мкл 0,45 мкм фильтрованной морской воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных данных использовались личинки песчаных эксцентриков Dendraster, которым 2, 4 и 6 дней после оплодотворения (см. Таблицу материалов). Средний (± S.D., n = 15 для каждого возраста) размер этих особей составлял 152 ± 7 мкм, 260 ± 17 мкм и 292 ± 14 мкм соответственно. Учитывая, что эти личинки могут быть легко сконцентрированы (стадия 3.5), микроцентрифужные трубки были заполнены 750 мкл фильтрованной морской воды.
5. Сконцентрируйте культуру исследуемых организмов с помощью обратной фильтрации (т.е. поместите сетку в емкость, содержащую исследуемые организмы, и удалите воду через верхнюю часть сетки), чтобы исследуемые организмы оставались в нижней части стакана¹¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для изученных личиночных песочных долларов использовалась нейлоновая сетка размером 30 мкм (см. Таблицу материалов).
6. Промыть концентрированный образец животного фильтрованной морской водой (например, при культивировании с водорослями или другими химическими веществами). Повторите обратную фильтрацию еще раз, чтобы сконцентрировать образец животного.
7. Поместите известное количество отдельных организмов в наполовину заполненные микроцентрифужные трубки. Подсчитайте мелкие планктонные организмы под рассекающим микроскопом (см. Таблицу материалов) и переложите их стеклянными пипетками Пастера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество организмов, подлежащих размещению, зависит от размера; для личиночных песочных долларов размером ~200 мкм было уместно 20 особей на микроцентрифужную трубку.
   ВНИМАНИЕ: Стеклянные пипетки более желательны, чем пластиковые, так как некоторые планктонные организмы являются гидрофобными и будут прилипать к пластиковым поверхностям.
8. Добавьте 0,45 мкм отфильтрованной морской воды в микроцентрифужные трубки, содержащие животных, пока конечный объем не составит 1 мл.
9. Чтобы позволить организмам постепенно прогреться до желаемой экспериментальной температуры, поместите микроцентрифужные трубки с животными, подготовленные на этапе 3.7, в тепловой блок, начиная с холодного конца. Разместите пары микроцентрифужных трубок на каждом ряду (всего 12 трубок).
10. Подождите 10 минут.
11. Переместите пары микроцентрифужных трубок, вставленных на шаге 3.9, в соседние просверленные отверстия с более высокими температурами. Поместите дополнительные пары микроцентрифужных трубок в каждый ряд на холодном конце. Каждый ряд теперь будет иметь четыре трубки. Подождите еще 10 минут.
12. Продолжайте добавлять микроцентрифужные трубки с животными, смещая их положения с более холодного конца на более теплый конец парами. Подождите 10 минут между каждой сменой, пока тепловой блок не будет полностью заполнен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 3.9-3.12 рассматриваются как фаза наращивания для постепенного повышения температуры, испытываемой исследуемыми организмами.
13. Дайте животным высиживаться при заданной температуре в течение 2 ч. Этот этап является фазой постоянного температурного воздействия эксперимента.
    1. Проверяйте температуру микроцентрифужных трубок термопарой каждый час, если инкубационный период превышает 2 ч.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации в зависимости от экспериментальных потребностей. Если инкубация длится более 2 ч, проверьте температуру трубок через равные промежутки времени с помощью термопары в случае непредвиденного отказа оборудования. Чтобы свести к минимуму помехи исследуемым организмам, случайным образом поместите шесть или более микроцентрифужных трубок, заполненных только отфильтрованной морской водой, в блок для мониторинга температуры.
14. В конце инкубационного периода измеряют температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки с помощью термопары с электродом К-типа. Обратите внимание на эти температуры.
15. Удалите все 60 микроцентрифужных трубок с животными и поместите их в предварительно маркированные держатели.
16. Инкубировать трубы (стадия 3.14) при заданной температуре, такой как температура выращивания, в течение 1 ч, что является периодом восстановления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Период восстановления может быть видоспецифичным. Для личиночного песочного доллара температура выращивания составляла 18 °C, и поэтому образец помещали в экологическую камеру. Обратитесь к соответствующей литературе и / или проведите пробный эксперимент, чтобы убедиться, что количество живых: мертвых не было затронуто продолжительностью периода восстановления. В репрезентативных данных количество животных, живших через 1 ч, было таким же, как и после 12 или 24 ч выздоровления.
17. Чтобы перечислить долю исследуемого организма, который жив после теплового воздействия, перенесите содержимое отдельной микроцентрифужной трубки на чашку Петри толщиной 35 мм с помощью стеклянной пипетки.
18. Понаблюдайте и обратите внимание на относительное количество особей, которые еще активны (живы) и тех, кто захватил плавание или растворился (умер) под рассекающим микроскопом. Убедитесь, что общее число наблюдаемых особей равно числу особей, помещенных в трубки на этапе 3.7. Проверьте боковые стороны микроцентрифужных трубок и чашки Петри для отдельных лиц, если цифры не совпадают.

4. Вычисление LT₅₀

1. Сгенерируйте таблицу данных в формате CSV с по крайней мере следующими заголовками: группирующая переменная, представляющая интерес, температура трубки в °C, количество живых особей и количество погибших особей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных данных интересующая группирующая переменная заменяется возрастом, поскольку цель состоит в сравнении между возрастными группами.
2. Чтобы сопоставить данные с логистической регрессией, используйте обобщенную линейную модель с биномиальным распределением. Дополнительный файл кодирования 1 показывает пример сценария с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом R²².
3. Чтобы определить медианный верхний тепловой предел (LT₅₀), вычислите предикторное значение (т.е. температуру), при котором выжило 50% особей. Файл дополнительного кодирования 2 показывает пример скрипта, использующего функцию dose.p из MASS²³ в R²².

Результаты

Целью данного протокола является определение верхнего теплового предела зоопланктона. Для этого необходим стабильный и линейный тепловой градиент. Предложенная установка была способна генерировать тепловой градиент в диапазоне от 14 °C до 40 °C путем установки температуры водяной бани...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает доступный и настраиваемый подход к определению тепловых пределов малых планктонных организмов при остром тепловом воздействии. Конструкция с 10 отверстиями и гибкие конечные точки температуры, контролируемые водяной баней на нижнем конце и нагревателем на ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm membrane filter	VWR	74300-042
½” Acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe	VWR	76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger	Omega Engineering	HH506A	Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette	Ranin
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W	McMaster-Carr	3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix	Pentair	CM2B	Use to make aritifical seawater
Denraster excentricus	M-Rep		Sand dollars from California
Dissecting microscope	Nikon	SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm)	Amazon		Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"	McMaster-Carr	86825K953	Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation	McMaster-Carr	4530K121	Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller	Amazon		Can be used in place of the lab-grade water bath
Example with larval sand dollar
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling	Amazon		Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet)	Amazon		Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators	VWR	89202-386	Can be replaced with an aquarium chiller
Microcentrifuge Tubes	VWR	76019-014	If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative
Nitex mesh filter	Self made		Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing
Pasteur pipette	VWR	14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)	Millpore-Sigma	P3911-500G
R statistical software.	The R Project for Statistical Computing
Syringe needle	VWR	89219-346	Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing	McMaster-Carr	5233K65	Adjust to match the chiller and block used
Zoo Med Repti Temp Rheostat	Chewy.com		Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output