Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Riepilogo

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Abstract

La tubercolosi (TB), la principale causa di morte in tutto il mondo per un agente infettivo, ha ucciso 1,6 milioni di persone nel 2022, superata solo dal COVID-19 durante la pandemia 2019-2021. La malattia è causata dal batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Il ceppo di Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), l'unico vaccino contro la tubercolosi, è il più antico vaccino autorizzato al mondo, ancora in uso. Attualmente, ci sono 12 vaccini in fase di sperimentazione clinica e dozzine di vaccini in fase di sviluppo preclinico. Il metodo di scelta utilizzato per valutare l'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi negli studi preclinici è l'enumerazione delle colonie batteriche mediante il test delle unità formanti colonie (CFU). Questo test richiede dalle 4 alle 6 settimane per essere concluso, richiede un notevole spazio in laboratorio e nell'incubatore, ha costi elevati per i reagenti ed è soggetto a contaminazione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per l'enumerazione delle colonie, il micro-CFU (mCFU), che offre una soluzione semplice e rapida per analizzare i risultati dell'efficacia del vaccino contro la tubercolosi . Il test mCFU richiede un numero dieci volte inferiore di reagenti, riduce di tre volte il periodo di incubazione, impiegando da 1 a 2 settimane per concludersi, riduce lo spazio di laboratorio e il costo dei reagenti e riduce al minimo i rischi per la salute e la sicurezza associati al lavoro con un gran numero di M.tb. Inoltre, per valutare l'efficacia di un vaccino contro la tubercolosi, è possibile ottenere campioni da una varietà di fonti, compresi tessuti di animali vaccinati infettati da micobatteri. Descriviamo anche un metodo ottimizzato per produrre una coltura micobatterica unicellulare, uniforme e di alta qualità per gli studi sulle infezioni. Infine, proponiamo che questi metodi siano universalmente adottati per gli studi preclinici sulla determinazione dell'efficacia dei vaccini, portando in ultima analisi a una riduzione dei tempi di sviluppo dei vaccini contro la tubercolosi.

Introduzione

La tubercolosi (TBC) è la principale causa di morte in tutto il mondo a causa di un singolo agente infettivo, il batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb), che uccide più persone di qualsiasi altro agente patogeno. Nel 2021, la tubercolosi è stata responsabile di 1,6 milioni di decessi ed è stata superata dalla COVID-19 durante la pandemia 2019-2021¹. Inoltre, secondo il rapporto globale sulla tubercolosi del 2022 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, la pandemia di COVID-19 è stata responsabile di un aumento dei nuovi casi di tubercolosi. L'OMS segnala anche un forte calo del numero di persone a cui è stata diagnosticata la tubercolosi durante questo periodo, il che potrebbe aumentare ulteriormente il numero^{di casi di} tubercolosi.

Il Bacillus Calmette-Guérin (BCG) è un ceppo vivo attenuato del patogeno Mycobacterium bovis, utilizzato per la prima volta come vaccino più di 100 anni fa. Questo è l'unico vaccino contro la tubercolosi ed è il più antico vaccino autorizzato al mondo ancora in uso ^2,3. Attualmente, ci sono 12 vaccini in diverse fasi di sperimentazione clinica⁴ e dozzine di vaccini sono in fase di sviluppo preclinico ^5,6. La valutazione preclinica dei vaccini contro la tubercolosi include la valutazione della sicurezza e dell'immunogenicità⁷, che possono essere ottenute in diversi modelli animali come pesce zebra, topi, porcellini d'India, conigli, bovini e primati non umani ^8,9,10. Inoltre, la valutazione della capacità di un vaccino di indurre protezione contro l'infezione e/o la trasmissione di M.tb, cioè l'efficacia del vaccino, richiede un challenge di M.tb in vivo ^5,11. È interessante notare che la vaccinazione BCG induce effetti non specifici che influenzano la sopravvivenza di altri patogeni batterici e virali^12,13 attraverso il meccanismo dell'immunità addestrata¹⁴. Per quantificare la carica batterica vitale in un animale infetto, il metodo di scelta è l'enumerazione delle colonie batteriche attraverso il test delle unità formanti colonie (CFU) ^5,15. La CFU è un'unità che stima il numero di microrganismi (batteri o funghi) che formano colonie in specifiche condizioni di crescita. I CFU provengono da microrganismi vitali e replicativi e il numero assoluto di microrganismi viventi all'interno di ciascuna colonia è difficile da stimare. Non è chiaro se una colonia abbia avuto origine da uno o più microrganismi. L'unità CFU riflette questa incertezza, quindi si può osservare una grande variabilità nelle repliche dello stesso campione. Questo test richiede molto tempo e tecnici specializzati formati per lavorare in una struttura di livello di biosicurezza 3 (BSL3), un ampio spazio di laboratorio e incubatore, richiede da 4 a 6 settimane per concludersi ed è soggetto a contaminazione.

In questo studio, descriviamo un metodo ottimizzato per l'enumerazione delle colonie, il micro-CFU (mCFU), e offriamo una soluzione semplice e rapida per analizzare i risultati 15,16,17,18,19,20. Il test mCFU richiede un numero dieci volte inferiore di reagenti, riduce di tre volte il periodo di incubazione, impiegando da 1 a 2 settimane per concludersi, riduce lo spazio di laboratorio e il costo dei reagenti e riduce al minimo i rischi per la salute e la sicurezza associati al lavoro con un gran numero di M.tb. Proponiamo che questo metodo sia universalmente adottato per gli studi preclinici sulla determinazione dell'efficacia dei vaccini, portando in ultima analisi a una riduzione dei tempi di sviluppo dei vaccini contro la tubercolosi. Infine, questo metodo ottimizzato di enumerazione CFU è stato utilizzato per quantificare non solo i micobatteri ma anche altri batteri, come Escherichia coli e Ralstonia solanacearum²¹.

Protocollo

NOTA: Il protocollo qui descritto è per BCG ma può essere applicato a qualsiasi Micobatterio. Il BCG può essere utilizzato come batterio surrogato per gli esperimenti sulla tubercolosi quando le strutture BSL3 non sono disponibili²². Le seguenti procedure che utilizzano BCG devono essere eseguite in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e seguire le linee guida di biosicurezza appropriate e le buone pratiche di laboratorio per la manipolazione di microrganismi del gruppo di pericolo 2.

1. Preparazione dei terreni di coltura

1. Preparare il brodo Middlebrook 7H9 integrato con il 10% (v/v) di acido oleico, albumina, destrosio e arricchimento di catalasi (OADC), secondo le istruzioni del fornitore. Integrare il brodo con lo 0,05% (v/v) di tyloxapol.
   NOTA: Tyloxapol è un polimero liquido non ionico che è stato utilizzato come tensioattivo per prevenire la formazione di grumi batterici¹⁶.
2. Preparare il terreno solido Middlebrook 7H10 integrato con il 10% (v/v) di arricchimento OADC secondo le istruzioni del fornitore.
3. Distribuire 40 mL di terreno per capsula di Petri quadrata (120 mm x 120 mm). Lasciare asciugare le piastre per ridurre al minimo la formazione di condensa sulla superficie dell'agar.
   NOTA: Questa dimensione specifica della capsula di Petri è fondamentale per consentire il trasposizione diretto di almeno 96 goccioline da una piastra a 96 pozzetti. Un'efficace asciugatura delle piastre faciliterà in seguito la placcatura di piccole goccioline di sospensione batterica e impedirà la diffusione delle goccioline.
4. Preparare il terreno di infezione del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) o il terreno DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco. In entrambi i casi, integrare il terreno con il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio. Non aggiungere penicillina e streptomicina al terreno.

2. Preparazione del campione

1. Ottenere campioni da una varietà di fonti. Tipicamente, per quantificare la CFU per valutare l'efficacia di un vaccino contro la tubercolosi, è necessario acquisire campioni da tessuti animali vaccinati e non vaccinati. Ad esempio, polmone e milza di topo¹¹ o polmone di macaco, linfonodi toracici e periferici, milza, fegato, pelle, sangue, midollo osseo e lavaggio broncoalveolare²³. In alternativa, prelevare campioni da colture in vitro di macrofagi/cellule dendritiche/neutrofili infettati con BCG 18,19,20,24,25,26.

3. Produzione di coltura BCG

NOTA: Per gli studi in vivo sui vaccini contro la tubercolosi, l'obiettivo è quello di migliorare l'efficacia del BCG. Pertanto, i gruppi vaccinati con BCG sono solitamente utilizzati come controllo. I ceppi di BCG utilizzati per la vaccinazione umana sono ideali per i test su modelli animali. In questo caso, una coltura di BCG deve essere ricostituita secondo le istruzioni del fornitore²⁷. Tuttavia, una coltura BCG per studi in vivo può anche essere prodotta internamente¹¹. La produzione di colture BCG unicellulari, uniformi e di alta qualità per protocolli di infezione in vitro è stata prodotta con grande successo in diversi studi 11,16,18,19,20,26,28,29, utilizzando il seguente protocollo, che può essere utilizzato anche per studi di provocazione su animali.

1. Coltura 50 mL di BCG in brodo 7H9, a 37 °C, con agitazione a 200 giri/min. Variare il volume in base alle esigenze dell'esperimento.
2. Ogni giorno, per 8-10 giorni, raccogliere 100 μL di coltura e diluirli aggiungendo 900 μL di PBS in una cuvetta da 1 mL. Procedere quindi misurando la densità ottica dei batteri (OD a λ=600 nm; OD₆₀₀) in uno spettrofotometro. Disegna una curva di crescita a partire da questi valori. Identificare la fase intermedia logaritmica della coltura (quando l'OD raddoppia in modo coerente per unità di tempo).
3. Preparare una coltura successiva e incubare fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica medio/tardiva come nei passaggi 3.1 e 3.2. Utilizzare i valori ottenuti nel passaggio precedente come guida. Assicurarsi che la coltura non raggiunga la fase di crescita stazionaria (quando l'OD inizia a stabilizzarsi) per mantenere una coltura di buona qualità di batteri vitali.
4. Raccogliere la coltura nella fase di crescita del log medio/tardivo. Centrifugare a 3000 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante.
5. Aggiungere 10 ml di PBS per lavare i batteri. Centrifugare a 3000 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante.
6. Risospendere i batteri con 5 ml di terreno di infezione. Immergere il tubo in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti, a piena potenza a 80 Hz.
7. Centrifugare a 1000 x g per 10 min. Raccogliere il surnatante evitando il pellet in quanto ricco di grumi batterici che dovrebbero essere evitati in una coltura BCG di alta qualità e scartarlo.
8. Misurare l'OD del surnatante. In questo caso, le colture in fase di crescita esponenziale, con un OD₆₀₀ di 0,1, equivalgono a 1 x 10⁷ CFU/mL.
   NOTA: Ogni laboratorio dovrebbe produrre le proprie curve di crescita BCG prima di iniziare gli esperimenti per stabilire una regressione lineare tra OD₆₀₀ e CFU utilizzando lo spettrofotometro. Si prega di notare che gli spettrofotometri hanno diverse distanze del percorso della luce, che possono variare le letture ottenute per lo stesso campione.
9. Esegui semplici calcoli per stabilire il numero di batteri da aggiungere a ciascuna coltura cellulare ospite. Il numero di batteri per cellula ospite è la molteplicità dell'infezione (MOI). Utilizzare un MOI di 10 batteri per cellula ospite, che è il MOI più comune utilizzato per gli esperimenti di infezione da BCG.

4. Saggio dell'unità formante microcolonie

NOTA: Dopo aver completato un esperimento di infezione in vivo o in vitro , l'enumerazione dei batteri può essere eseguita mediante mCFU. Per gli studi in vivo , i campioni devono essere prima omogeneizzati in un battitore di perline o in un altro omogeneizzatore di tessuti. Per le colture in vitro di macrofagi/cellule dendritiche/neutrofili infettati da BCG, i campioni devono essere lisati utilizzando un detergente non ionico (ad esempio, una soluzione allo 0,05% di detergente non ionico e non denaturante).

1. Diluizioni seriali utilizzando una piastra a 96 pozzetti: eseguire diluizioni seriali di 10 volte dei lisati, in una piastra sterile a 96 pozzetti secondo lo schema della Figura 1A. Distribuire i lisati sulle righe A ed E. Per ogni piastra, il numero massimo di campioni e/o repliche è 24.
2. Aggiungere 180 μL di dH₂O ai pozzetti rimanenti per eseguire la diluizione seriale.
3. Utilizzando una pipetta a 12 canali, sospendere nuovamente i lisati nella fila A e trasferire 20 μL nella fila B (20 μL lisato + 180 μL dH₂O). Omogeneizzare bene. Ripetere in sequenza questo passaggio per le righe B e C fino a raggiungere l'ultima diluizione nella riga D.
   NOTA: Di solito eseguiamo tre diluizioni (10⁰, 10¹, 10², 10³), utilizzando quindi 4 file della piastra (A-D o E-H) per ogni set di 12 campioni e/o repliche.
4. Placcatura a microgoccia: utilizzare una pipetta multicanale da 0,5-10 μL (sono preferibili puntali sottili) per trasferire 5 μL da ciascuna fila della piastra a 96 pozzetti alla piastra quadrata media solida, secondo la Figura 1B.
5. Pipettando lentamente le goccioline da 5 μL, lasciare che tocchino leggermente l'agar. Ciò contribuirà a rimuovere la gocciolina dalla punta verso l'agar e a ridurre la possibilità di ritenzione del liquido all'interno della punta.
6. Lasciare asciugare le goccioline, chiudere la piastra di agar e incubarla a 37 °C monitorando la crescita batterica. Facoltativamente, incubare le piastre di agar in un sacchetto di plastica sigillato per evitare che le piastre si secchino.
7. Conteggio delle microcolonie: dopo circa 6-10 giorni di incubazione, verificare la presenza di singole colonie, visibili ad occhio nudo (Figura 2).
8. Contare le colonie utilizzando l'obiettivo con l'ingrandimento più basso (4x o inferiore) di un microscopio ottico invertito o di una lente d'ingrandimento. I conteggi devono essere eseguiti nelle diluizioni in cui il numero di colonie è inferiore a 300 e superiore a 30. In alternativa, utilizzare una fotocamera per scattare una foto della gocciolina per contare manualmente le colonie sul computer o utilizzare un software come ImageJ per automatizzare il conteggio delle colonie.
9. Per esprimere il numero di celle in CFU/mL, utilizzare la seguente equazione:
   
   Dove C = numero di colonie contate, V = volume placcato in μL e Dil = diluizione dove sono state contate le colonie (10⁰, 10¹, 10², 10³). Ad esempio, se 30 colonie sono state contate in una gocciolina da 5 μL nella diluizione 10², allora:
   

Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo mCFU. (A) Diluizioni seriali di 10 volte dei lisati contenenti BCG in una piastra a 96 pozzetti. (B) Piastra di Petri quadrata contenente terreno di coltura solido e ricoperta da 96 goccioline da 5 μL ciascuna. Le goccioline vengono pipettate direttamente dalla piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Unità formanti microcolonie di BCG dopo 10 giorni di incubazione. A sinistra, una foto di una capsula di Petri quadrata sovrapposta a 96 goccioline da 5 μL ciascuna, come precedentemente rappresentato nella Figura 1B. A destra, le singole foto di 3 goccioline corrispondono a un lisato originale (10⁰) e due diluizioni (10¹, 10²). Le foto sono state scattate utilizzando una fotocamera DSRL dotata di un obiettivo zoom 18-55 mm (piastra) o di un obiettivo macro da 105 mm (goccioline). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Conteggio delle unità formanti microcolonie nelle Figi (ImageJ)

NOTA: Il metodo mCFU consente la quantificazione CFU di grandi insiemi di campioni. Le immagini delle goccioline possono essere registrate per l'analisi posteriore per facilitare il conteggio delle colonie. Diversi dispositivi fotografici possono produrre immagini con una qualità sufficiente per questo scopo. Questi includono fotocamere digitali, webcam, microscopi e lenti d'ingrandimento collegati alla fotocamera e telefoni cellulari. Un software gratuito di analisi delle immagini come ImageJ offre la possibilità di contare manualmente o automaticamente le colonie in quelle immagini. Per dimostrare entrambi i metodi, verrà utilizzato Fiji, che è una distribuzione di ImageJ che include diversi strumenti per l'analisi scientifica delle immagini³⁰. Le Figi possono essere scaricate da https://fiji.sc/.

1. Metodo di conteggio manuale
   1. Aprire l'immagine contenente l'mCFU in Figi. Seleziona Plugin > Analizza > contatore di celle.
   2. Nel menu Contatore di celle, selezionare Inizializza , quindi selezionare un contatore (ad esempio, Tipo 1).
   3. Procedi cliccando su ogni colonia. Ogni clic verrà visualizzato sull'immagine e aggiornerà il contatore (Figura 3). Per annullare i clic accidentali, selezionare Elimina.
   4. Registrare il valore visualizzato sul contatore. Fare clic sul pulsante Ripristina per reimpostare il conteggio e aprire una nuova immagine per contare altri campioni.
      NOTA: Ulteriori istruzioni su questo plugin sono disponibili all'https://imagej.net/plugins/cell-counter.
2. Metodo di conteggio automatizzato
   1. Aprire l'immagine contenente l'mCFU in Figi. Selezionare Immagine > Tipo > 8 bit. Questo convertirà l'immagine in un'immagine in scala di grigi a 8 bit.
   2. Selezionate lo strumento Ovale nella barra degli strumenti e disegnate un ovale attorno all'area con le colonie (Figura 4A). L'ovale può essere regolato dopo essere stato disegnato.
   3. Selezionare Modifica > Cancella esterno per rimuovere qualsiasi interferenza dall'area esterna (Figura 4B). Selezionare Immagine > Regola > soglia.
   4. Spostare i cursori nel menu della soglia fino a quando le colonie non vengono visualizzate in rosso e il rumore di fondo è ridotto al minimo (Figura 4C).
   5. Selezionare Applica e uscire dalla finestra della soglia. Viene generata un'immagine in bianco e nero (Figura 4D).
   6. Selezionare Analizza > Analizza particelle. Nella finestra Analizza particelle, specificare l'intervallo per l'area della colonia (compresa tra 1 e infinito, misurata in pixel quadrati) e la circolarità (tra 0 e 1, dove 1 è un cerchio perfetto; Figura 4E).
   7. Selezionare Contorni nel menu a comparsa Mostra. Controllare Visualizza risultati per misurazioni dettagliate per ogni colonia nella finestra dei risultati. Selezionare Cancella risultati per cancellare eventuali misurazioni precedenti. Selezionare la casella Riepiloga per visualizzare i risultati riepilogativi delle misurazioni (Figura 4E).
   8. Avviare l'analizzatore selezionando OK. Viene visualizzata una nuova finestra che mostra tutte le colonie delineate che sono state rilevate e conteggiate. Nella finestra dei risultati vengono visualizzati i dettagli di ogni colonia, mentre nella finestra dei risultati riepilogati vengono visualizzati i conteggi totali delle colonie (Figura 4F).
      NOTA: Le impostazioni per le dimensioni e la circolarità variano in base alla risoluzione e all'ingrandimento dell'immagine, nonché alle dimensioni e alla forma delle colonie. Ripetere il processo più volte fino a trovare le impostazioni migliori che rilevano tutte le colonie. Ulteriori istruzioni sul plug-in per l'analisi delle particelle sono disponibili all'indirizzo https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Figura 3. Un metodo manuale per il conteggio di mCFU utilizzando il plug-in del contatore di cellule sul software Fiji. I punti blu indicano le colonie già cliccate dall'utente. Il menu a destra mostra il numero di colonie contate fino a quel momento (il conteggio è 41). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Un metodo automatizzato per il conteggio di mCFU utilizzando il software Fiji. (A, B) L'area di interesse con le colonie viene selezionata utilizzando lo strumento di selezione ovale e l'area esterna viene rimossa utilizzando il comando Cancella esterno. (C, D) Un'immagine in bianco e nero delle colonie viene generata utilizzando lo strumento soglia. (E, F) Il numero di colonie viene quantificato utilizzando lo strumento Analizza particelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Il test mCFU qui descritto aumenta la quantità di informazioni che possono essere recuperate da una singola capsula di Petri ad almeno 96 volte. La Figura 5 illustra un confronto tra due metodi di somministrazione del farmaco per l'uso riproposto di saquinavir (SQV)^31,32 come farmaco diretto all'ospite per il trattamento della tubercolosi. In questo test, quattro diversi ceppi di Mycobacterium tuberculosis sono stati utiliz...

Discussione

La tubercolosi è un importante problema di salute pubblica con un'importanza crescente, in particolare nei paesi a basso e medio reddito. L'interruzione delle strutture sanitarie per la diagnosi e il trattamento della tubercolosi durante la pandemia di COVID-19 ha causato un impatto negativo sull'incidenza di nuovi casi¹. Inoltre, i ceppi di M.tb multi-farmaco ed estensivamente resistenti ai farmaci e la co-infezione di M.tb e HIV devono essere affrontati con urgenza per control...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051