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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo studio, abbiamo sviluppato una nanosonda di impronte digitali basata su diffusione Raman potenziata dalla superficie (SERS) a basso costo con biocompatibilità favorevole per mostrare il bioimaging delle cellule vive senza etichetta e rilevare due ceppi batterici, mostrando in dettaglio come ottenere spettri SERS di cellule viventi in un metodo non distruttivo.

Abstract

La tecnologia di scattering Raman potenziato dalla superficie (SERS) ha attirato sempre più attenzione nel campo biomedico grazie alla sua capacità di fornire informazioni sulle impronte molecolari di campioni biologici, nonché al suo potenziale nell'analisi di singole cellule. Questo lavoro mira a stabilire una strategia semplice per la bioanalisi SERS label-free basata su nanosonde Au@carbon punti (Au@CDs). Qui, i CD derivati dai polifenoli sono utilizzati come riducente per sintetizzare rapidamente le nanostrutture Au@CD del guscio del nucleo, che consente potenti prestazioni SERS anche quando la concentrazione di blu di metilene (MB) è bassa come 10-9 M, a causa del meccanismo di potenziamento Raman cooperativo. Per la bioanalisi, Au@CDs può servire come nanosensore SERS unico per identificare i componenti cellulari dei biocampioni (ad esempio, cellule tumorali e batteri). Le impronte molecolari di specie diverse possono essere ulteriormente distinte dopo la combinazione con l'analisi delle componenti principali. Inoltre, Au@CDs anche consentire l'imaging SERS label-free per analizzare i profili di composizione intracellulare. Questa strategia offre una bioanalisi SERS fattibile e senza etichettatura, aprendo una nuova prospettiva per la nanodiagnosi.

Introduzione

L'analisi di una singola cellula è essenziale per lo studio della rivelazione dell'eterogeneità cellulare e per valutare lo stato completo della cellula. La risposta istantanea della cellula al microambiente giustifica anche l'analisi di una singola cellula1. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni alle tecniche attuali. Il rilevamento della fluorescenza può essere applicato all'analisi di singole cellule, ma è limitato dalla bassa sensibilità. Altre sfide derivano dal complicato background di fluorescenza delle cellule e dal fotosbiancamento a fluorescenza sotto irradiazione a lungo termine2. Lo scattering Raman potenziato dalla superficie (SERS) può qualificarsi in termini di analisi a singola cellula grazie ai suoi vantaggi, tra cui (1) riflettere le informazioni intrinseche delle impronte digitali molecolari e la situazione istantanea, (2) altissima sensibilità superficiale, (3) rilevamento multiplex conveniente, (4) alta fotostabilità, (5) il rilevamento può essere quantificato per l'analisi comparativa, (6) evitare l'autofluorescenza cellulare con l'eccitazione della lunghezza d'onda NIR, (7) il rilevamento può essere eseguito in un acquoso cellulare e (8) il rilevamento può essere diretto a una regione specifica all'interno della cella 3,4,5.

Esistono due meccanismi ampiamente riconosciuti per comprendere il SERS come un fenomeno fondamentale: il potenziamento elettromagnetico (EM) come motivo dominante e il potenziamento chimico (CM). EM si riferisce, in una data frequenza del campo eccitante, all'oscillazione di elettroni collettivi guidati da onde elettromagnetiche quando la frequenza della luce incidente corrisponde alla frequenza degli elettroni liberi che oscillano nel metallo, dando origine alla risonanza plasmonica di superficie (SPR). Quando l'SPR localizzato (LSPR) si verifica attraverso il laser incidente che colpisce le nanoparticelle metalliche (NP), porta all'assorbimento risonante o alla dispersione della luce incidente. Di conseguenza, l'intensità del campo elettromagnetico superficiale delle NP metalliche può essere aumentata da due a cinque ordini4. Tuttavia, la chiave per l'enorme miglioramento in SERS non è un singolo NP metallico, ma il divario tra due NP, che crea punti caldi. La CM è generata da due lati, tra cui (1) interazioni tra molecole bersaglio e NP metalliche e (2) molecole bersaglio in grado di trasferire elettroni da / verso NP metalliche 4,5. Dettagli più esaustivi possono essere trovati in questi articoli di revisione 4,5. Diversi metodi promettenti per il biorilevamento e l'imaging SERS in cellule viventi sono stati presentati in letteratura precedente, ad esempio, la rilevazione di cellule apoptotiche6, proteine negli organelli7, miRNA intracellulari8, membrane lipidiche cellulari,9citochine10 e metaboliti11 in cellule viventi, nonché l'identificazione e il monitoraggio delle cellule mediante imaging SERS confocale2, 11,12,13. È interessante notare che il SERS label-free presenta il vantaggio unico di SERS, che può descrivere spettri molecolari interni5.

Un problema importante per il SERS label-free è un substrato razionale e affidabile. I substrati tipici di SERS sono NP di metalli nobili a causa della loro eccellente capacità di disperdere molta luce14. Al giorno d'oggi, sempre più attenzione è rivolta ai nanocompositi a causa delle loro notevoli proprietà fisiche e chimiche e biocompatibilità. Più significativamente, i nanocompositi possono mostrare una migliore attività SERS a causa dell'intensa EM indotta dai punti caldi sui nanoibridi e dall'ulteriore miglioramento chimico proveniente da altri materiali non metallici15. Ad esempio, Fei et al. hanno utilizzato i punti quantici (QD) MoS 2 come riduttori per sintetizzare nanocompositi QD Au NP@MoS2per l'imaging SERS nel vicino infrarosso (NIR) senza etichetta delle cellule di cancro al seno 4T1 del topo (cellule 4T1)16. Inoltre, Li et al. hanno fabbricato un substrato SERS 2D costituito da NP Au e nanofogli di ditellururo di afnio 2D per misurazioni SERS senza etichetta di batteri patogeni di origine alimentare17. Recentemente, i punti di carbonio (CD), buoni donatori di elettroni, sono stati usati come riducenti senza altri riducenti o irradiazione per sintetizzare Au@carbon nanosonde a punti (Au@CDs)18, che sono stati segnalati come materiali efficienti per migliorare l'attività SERS in base all'effetto di trasferimento di carica (CT) tra nuclei Au e gusci CD 19,20. Inoltre, i CD sono riconosciuti come l'agente di tappatura e uno stabilizzatore per impedire alle NP di aggregare21. Inoltre, apre maggiori possibilità di reazioni con analiti, in quanto può fornire un gran numero di siti di legame e attivi20. Sfruttando quanto sopra, Jin et al. hanno sviluppato un metodo rapido e controllabile per fabbricare NP Ag@CD con proprietà SERS uniche ed eccellenti attività catalitiche per il monitoraggio di reazioni catalitiche eterogenee in tempo reale18.

Qui, è stato dimostrato un metodo facile e a basso costo per la fabbricazione di substrati SERS Au@CD core-shell per identificare componenti cellulari e bioimaging cellulare vivo SERS label-free, nonché per rilevare e differenziare Escherichia coli (E. coli) e Staphylococcus aureus (S. aureus), che è promettente per la diagnosi precoce della malattia e una migliore comprensione dei processi cellulari.

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Protocollo

1. Fabbricazione di Au@CDs

Nota : la Figura 1 illustra una procedura di fabbricazione per Au@CDs.

  1. Preparare la soluzione CD utilizzando acido citrico (CA) e acido gallico (GA) mediante una tipica procedura di trattamento idrotermale18. Aggiungere 100 μL di 3,0 mg mL-1 della soluzione CD preparata in 200 μL di acido cloroaurico 10 mM (HAuCl4) (vedere Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 10 s fino a produrre una sospensione viola.
  2. Centrifugare la sospensione viola a 4.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente il surnatante usando una pipetta se la rimozione dei colloidi Au@CD è difficile.
  3. Risospendere il Au@CDs con 200 μL di acqua deionizzata (resistività di 18,2 MΩcm) per lavare i CD in eccesso.
  4. Ripetere il punto 1.2 e ottenere le NP del guscio centrale, ridisperse in 100 μL di acqua deionizzata, e conservare a 4 °C. I NP possono essere conservati per 1 mese.

2. Caratterizzazione delle Au@CDs

  1. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
    1. Lasciare il CD e Au@CD campioni per una notte a -80 °C per liofilizzare da una soluzione congelata e frantumarli dopo la liofilizzazione in polvere.
    2. Disperdere adeguatamente i campioni di polvere ottenuti nell'acqua deionizzata mediante sonicazione, al 100% della potenza, per 5 minuti.
    3. Far cadere alcune gocce della sospensione del campione su una griglia TEM rivestita in Cu coperta da una pellicola di carbonio lacey e acquisire immagini dopo l'essiccazione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione a una tensione di accelerazione di 200 kV (vedere Tabella dei materiali).
  2. Spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FT-IR)
    1. Ripetere il passaggio 2.1.1 per ottenere campioni di potenza, macinare alcune particelle KBr pre-essiccate in polveri in un mortaio, aggiungere un pizzico del campione e mescolare contemporaneamente con le polveri KBr per la caratterizzazione IR16.
  3. Spettroscopia di assorbanza ultravioletta-visibile-vicino infrarosso (UV-vis-NIR)
    1. Preparare la sospensione di CD e Au@CDs con la giusta concentrazione per assicurarsi che l'assorbanza sia inferiore a uno ed eseguire la caratterizzazione UV-vis-NIR16.
  4. Spettri Raman
    1. Accendere il laser a semiconduttore da 785 nm, con una potenza laser di 10 mW e un ingrandimento dell'obiezione di 20x. Impostare la durata dell'esposizione su 5 s e il numero di accumuli su tre.
    2. Aggiungere un volume uguale di campioni di Au@CDs preparati in 5 μL di soluzione di blu di metilene (MB) e mescolare accuratamente.
    3. Posizionare una goccia di sospensione sul substrato di ottone per raccogliere gli spettri SERS.

3. Coltura cellulare

  1. Coltura di cellule di carcinoma polmonare epiteliale umano (cellule A549, passate in laboratorio) nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrate con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina e incubate in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Seminare le cellule in piastre da 96 pozzetti (1 × 105 cellule/pozzetto) e trattare con Au@CDs in diverse concentrazioni nell'intervallo 20-100 μM. Utilizzare un kit di analisi CCK-8 per misurare la vitalità cellulare (vedere Tabella dei materiali). In ogni trattamento vengono utilizzati tre duplicati indipendenti.
  3. Per eseguire gli esperimenti SERS, procedere seguendo i passaggi seguenti:
    1. Inserire un chip di zaffiro sterile (vedi Tabella dei materiali) nelle piastre a 12 pozzetti e quindi seminare le cellule su un singolo pozzetto con 1 mL di mezzo. Incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2durante la notte per raggiungere il 70%-80% di confluenza.
    2. Aggiungere il Au@CDs nel singolo pozzetto e incubare per 4-6 ore.
      NOTA: Prima dell'incubazione, testare la stabilità dei substrati, in particolare delle NP in fase di soluzione. Questi materiali sono suscettibili di degradazione attraverso processi di dissoluzione, aggregazione e sedimentazione durante lo stoccaggio e l'uso, che possono ridurre le perdite EM e diminuire l'attività SERS. Più significativamente, per l'assorbimento cellulare, potrebbe essere ampiamente influenzato dalle dimensioni delle NP22.
    3. Durante l'incubazione, i substrati entreranno nelle cellule attraverso l'assorbimento endocitico. Dopo l'incubazione, osservare le cellule al microscopio ottico fino a quando alcune particelle nere sono visibili all'interno delle cellule.
      NOTA: Se l'intensità del SERS è debole, cercare di aumentare la concentrazione di Au@CD o prolungare il tempo di incubazione.
    4. Rimuovere il substrato, sciacquare delicatamente i trucioli di zaffiro con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e immergerli in PBS per il rilevamento SERS16.

4. Esperimenti SERS cellulari

  1. Aprire il computer, accendere lo spettrometro Raman, avviare il software e quindi accendere il laser a 785 nm (vedere Tabella dei materiali).
  2. Fare clic su Nuova misurazione e avviare una nuova acquisizione spettrale. Calibrare17 con wafer di silicio prima della misurazione del campione.
  3. Prendi un obiettivo 20x per assicurarti che venga osservata un'immagine cellulare chiara, quindi cambia l'obiettivo a 50x. Impostare la potenza del laser da bassa ad alta e il tempo di esposizione e gli accumuli appropriati.
    NOTA: Prima della misurazione SERS, controllare la potenza laser appropriata per prevenire danni irreversibili alle cellule e assicurarsi che i parametri di acquisizione siano coerenti. L'intensità del SERS è correlata alla potenza del laser, alla dimensione dello spot, all'accumulo e al tempo di esposizione.
  4. Scegli un punto di celle da misurare e fai clic su Esegui. Ogni cella viene misurata da 20 punti e vengono misurate 10 celle per prendere la media.
    NOTA: I componenti intracellulari sono complicati, portando a un'ampia disparità di spettri. Pertanto, prendi spettri in regioni cellulari simili e prendi il maggior numero possibile di spettri.
  5. Salva gli spettri.
  6. Fare clic su Nuova acquisizione di immagini Streamline, quindi fare clic su Revisione video, selezionare l'intervallo da fotografare e fare clic su OK. Impostare i parametri: edge streamline di 785 nm, centro di 1.200 cm-1, durata dell'esposizione di 5 s, numero di accumuli di tre e potenza laser al 50%.
  7. Fare clic su Nuovo imaging vivente, scegliere Segnale a linea di base, impostare l'intervallo dal primo limite 625 al secondo limite 1.700, quindi fare clic su Impostazione area. Quindi impostare i passaggi corretti e fare clic su Applica e OK. Infine, fare clic su Esegui per avviare l'esecuzione dell'imaging SERS.

5. Coltura batterica e misurazioni SERS

  1. Diluire le colture notturne di E. coli e S. aureus (1:100) in 5 ml del nuovo terreno Luria-Bertani (LB) (vedi Tabella dei materiali). Dopo la crescita a 37 °C a A600 da 0,4 a 0,6, centrifugare la coltura a 5.000 × g per 5 minuti per pellettare le cellule.
  2. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS seguito da una centrifugazione di 5 minuti e 5.000 × g (a temperatura ambiente) due volte.
  3. Mescolare la coltura batterica con il Au@CDs e osservare la miscela direttamente sotto la piattaforma SERS.

6. Analisi dei dati

  1. Smussare gli spettri e correggere la linea di base.
  2. Eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA)16 con i dati elaborati.

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Risultati

La fabbricazione del Au@CDs è illustrata nella Figura 1. I CD sono stati preparati da CA e GA tramite un tipico processo idrotermale18. Au@CDs sono stati rapidamente sintetizzati riducendo HAuCl4 da CD in mezzi acquosi a temperatura ambiente. Le dimensioni e la morfologia dei CD e dei Au@CDs possono essere osservate da TEM e TEM23 ad alta risoluzione (HR). I CD preparati sono monodispersi con piccole dimens...

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Discussione

In sintesi, Au@CDs con un guscio CD ultrasottile di 2,1 nm sono stati fabbricati con successo. I nanocompositi mostrano una sensibilità SERS superiore rispetto agli Au NP puri. Inoltre, Au@CDs possiedono eccellenti prestazioni in termini di riproducibilità e stabilità a lungo termine. Ulteriori ricerche includono l'assunzione di Au@CDs come substrati per eseguire l'imaging SERS delle cellule A54931 e per rilevare due ceppi batterici32. È stato dimostrato che Au@CDs può...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32071399 e 62175071), dal Science and Technology Program di Guangzhou (2019050001), dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515011988) e dalla Open Foundation of the Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine (Fujian Normal University), Ministero della Pubblica Istruzione, Cina (JYG2009).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBS buffer (Cell culture)Langeco TechnologyBL316A
6 well cell culture plateLABSELECT11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)GLPBIOGK10001
Citric acidShanghai Aladdin Biochemical TechnologyC108869
CO2 incubatorThermo Fisher Technologies3111
Constant temperature magnetic agitatorSartorius Scientific InstrumentsSQP
Cryogenic high speed centrifugeShanghai BoxunSW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture mediumProcellPM150210
Electronic balanceSartorius Scientific InstrumentsSQP
Enzyme markerThermo Fisher Technologies3111
Fetal bovine serumZhejiang Tianhang Biological Technology11011-8611
Figure 1Figdraw.
Fourier infrared spectrometerThermo, AmericaNicolet 380
Freeze dryerTecanInfinite F50
Gallic acidShanghai Aladdin Biochemical TechnologyG104228
Handheld Raman spectrometerOCEANHOOD, Shanghai, ChinaUspectral-PLUS
HAuCl4Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscopeThermo Fisher TechnologiesFEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclaveShanghai BoxunYXQ-LS-50S figure-materials-1875
Inverted microscopeNanjing Jiangnan Yongxin OpticalXD-202
LB Broth BRHuankai picoorganism028320
Medical ultra-low temperature refrigeratorThermo Fisher TechnologiesULTS1368
Methylene blueSigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive SolutionbeyotimeC0207
Penicillin streptomycin double resistanceShanghai BoxunYXQ-LS-50S figure-materials-2549
Pure water meterMillipore, USAMilli-Q System
Raman spectrometerRenishaw
Sapphire chipbeyotime
Thermostatic water bathChangzhou Noki
Ultra-clean tableShanghai BoxunSW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometerMADAPA, ChinaUV-6100S
Wire 3.4Renishaw

Riferimenti

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