Protocollo di esercizio di nuoto e metodi di cura per i ratti gravidi

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per delineare i metodi di riproduzione dei ratti, le procedure di addestramento al nuoto e i protocolli infermieristici post-riproduzione per i ratti gravidi dopo l'addestramento. Questo protocollo fornisce un modello animale per lo studio degli effetti dell'esercizio materno durante la gravidanza sulla prole e dei suoi meccanismi sottostanti.

Abstract

Il concetto di origini evolutive della salute e della malattia evidenzia l'impatto degli ambienti precoci sulle malattie croniche non trasmissibili come il diabete, le malattie cardiovascolari e il cancro. Gli studi che utilizzano modelli animali hanno studiato come fattori materni come la denutrizione, l'ipernutrizione, l'obesità e l'esposizione a sostanze chimiche o ipossia influenzino lo sviluppo fetale e la salute della prole, portando a problemi come il basso peso alla nascita, l'ipertensione, la dislipidemia e l'insulino-resistenza. Data la crescente prevalenza di sovrappeso e obesità tra le donne in età riproduttiva, interventi efficaci sono fondamentali. L'esercizio materno durante la gravidanza è emerso come un intervento chiave, a beneficio sia della madre che della prole e riducendo il rischio di malattia. Questo studio confronta le differenze di tre modelli di esercizio su ratti gravidi: corsa volontaria su ruote, tapis roulant motorizzati e nuoto. Il nuoto è l'opzione più vantaggiosa grazie ai suoi livelli di intensità sicuri e controllati. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi di riproduzione dei ratti, l'addestramento al nuoto durante la gravidanza e i protocolli infermieristici post-riproduzione. Questo modello, adatto a varie specie di ratti e topi, è utile per studiare i benefici dell'esercizio materno sulla salute della prole e sul benessere intergenerazionale.

Introduzione

Il concetto di Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD) è emerso negli ultimi due decenni, il che ha dimostrato che le influenze ambientali durante lo sviluppo precoce influenzano il rischio di successivi processi fisiopatologici associati alle malattie croniche non trasmissibili (NCD), in particolare il diabete, le malattie cardiovascolari e alcuni tipi di cancro¹. Durante la fase più plastica dello sviluppo fetale, in cui la prole è esposta all'ambiente intrauterino, l'interazione genico e ambiente e la perfusione utero-placentare sono fattori cruciali della riprogrammazione fetale². Studi precedenti hanno utilizzato prevalentemente modelli animali per studiare gli effetti dannosi, come la denutrizione materna, l'ipernutrizione o l'obesità durante la gravidanza, e l'esposizione prenatale a sostanze chimiche o ipossia, sullo sviluppo fetale e sugli effetti fenotipici a lungo termine nella prole³. Ciò ha prodotto un basso peso alla nascita e una successiva crescita e ha prodotto effetti avversi sulla prole, tra cui pressione sanguigna elevata, dislipidemia e insulino-resistenza⁴. Poiché il tasso di sovrappeso e obesità è in rapido aumento tra le donne in età riproduttiva, è urgentemente necessario stabilire interventi efficaci per prevenire la trasmissione intergenerazionale di questi deleteri disturbi materni, che hanno un impatto importante sulla salute della popolazione ^5,6.

L'esercizio fisico è stato a lungo riconosciuto come un'importante terapia preventiva per il diabete di tipo 2, l'ipertensione e molte altre malattie⁷. L'esercizio fisico durante la gravidanza ha effetti benefici per la madre e conferisce effetti benefici alla prole, riducendo così la trasmissione materna della malattia alla prole⁸. Diversi anni di ricerca hanno dimostrato la sicurezza dell'esercizio fisico e i profondi benefici, tra cui sostanziali riduzioni delle comuni condizioni di gravidanza come il diabete mellito gestazionale ^9,10. Per quanto riguarda la sicurezza materna e fetale, condurre l'allenamento fisico e i protocolli post-infermieristici è impegnativo.

David¹¹et al. Modelli di esercizio animale descritti applicabili alla ricerca sulla salute cardiovascolare. I tre modelli di esercizi comunemente usati, la corsa volontaria su ruote, i tapis roulant motorizzati e il nuoto, presentano vantaggi e svantaggi. La ruota che gira volontariamente imita da vicino il comportamento locomotore dei ratti, consentendo loro di muoversi secondo il loro ritmo circadiano. Tuttavia, questo tipo di esercizio richiede una regolazione più precisa dell'intensità e della durata. Il tapis roulant motorizzato può controllare l'intensità, il volume e la durata dell'esercizio, ma a volte necessita di stimolazione elettrica, che può innescare stress fisico e psicologico negli animali. Il nuoto è ampiamente utilizzato negli studi sui roditori a causa dell'intrinseca capacità di nuoto dei ratti, che può anche evitare la stimolazione elettrica o danni meccanici alle zampe e alla coda¹². Negli studi sui modelli di esercizio prenatale ^13,14, il nuoto è una modalità di esercizio comunemente usata. Man mano che la gravidanza progredisce e l'addome del ratto si gonfia, gli esercizi di corsa su tapis roulant e ruote possono causare il contatto ripetuto dell'addome con superfici dure. Al contrario, l'ambiente acquatico nel nuoto fornisce galleggiabilità, riducendo il rischio di lesioni legate all'esercizio per gli animali in gravidanza.

Questo protocollo presenta i metodi di allevamento dei ratti, come eseguire l'allenamento di nuoto durante la gravidanza e i protocolli di allattamento post-riproduzione per i ratti gravidi dopo l'addestramento. Questo modello di addestramento al nuoto in gravidanza può essere applicato a un'ampia gamma di specie di ratti e topi, che possono quindi fornire un utile modello di roditore per future indagini utilizzando modelli basati su animali per studiare i meccanismi che regolano gli effetti benefici dell'esercizio materno sulla salute della prole e i benefici dell'esercizio attraverso le generazioni.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal comitato etico animale dell'Università dello Sport di Pechino ed eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e le leggi cinesi sulla protezione degli animali e le linee guida istituzionali.

1. Accoppiamento e alimentazione dei ratti

1. Acquista ratti femmina Wistar di 10 settimane e ratti maschi Wistar di 11 settimane senza agenti patogeni (SPF) specifici.
2. Implementare l'alimentazione adattiva: nutrire i ratti Wistar ad libitum con una dieta standard per roditori e fornire l'accesso all'acqua del rubinetto per una settimana nell'impianto di alimentazione designato. Assicurarsi che tutti i ratti siano alloggiati in un ciclo luce-buio di 12 ore a una temperatura costante di 22 °C e un'umidità del 45-55%.
3. Esamina l'estro della femmina di ratto.
   1. Preparare l'attrezzatura e i materiali, inclusi vetrini da microscopio in vetro puliti, tamponi di cotone da 2 mm di diametro, soluzione salina (NaCl 0,9%) e microscopio.
   2. Etichettare ogni vetrino da microscopio con la data e l'identificazione del ratto.
   3. Tra le 18 e le 19, per ridurre al minimo lo stress, trattenere delicatamente la femmina di ratto. Afferrare la base della coda con il pollice e l'indice mentre si applica la pressione delle altre dita sulla vertebra lombare del ratto.
   4. Solleva la punta della coda ed esponi la vagina. Inumidisci un batuffolo di cotone con una soluzione salina, quindi metti la punta nella vagina e arrotola delicatamente la punta per raccogliere le secrezioni vaginali.
   5. Far rotolare la punta del tampone sul vetrino, evitando di riapplicarla nella stessa area.
   6. Esaminare lo striscio al microscopio e utilizzare l'obiettivo a basso ingrandimento (10x) per localizzare e osservare le cellule.
      NOTA: Durante l'estro, le secrezioni vaginali hanno nuclei epiteliali più grandi scomparsi, sostituiti da cellule epiteliali cheratinizzate esfoliate squamose che si sono accumulate in un tumulo.
   7. Registra la fase del ciclo estrale per ogni ratto.
4. Tra le 19 e le 20, metti un ratto maschio e una femmina nella gabbia di accoppiamento.
   NOTA: Le femmine di ratto devono essere in proestro o estro per l'accoppiamento.
5. Il secondo giorno, tra le 7 e le 8 del mattino, ispezionare la gabbia di accoppiamento per verificare la presenza di tappi copulatori. Se si trova un tappo copulatorio alla base della gabbia di accoppiamento, procedere alla creazione di uno striscio di secrezione vaginale per la femmina di ratto seguendo lo stesso metodo descritto nei passaggi 1.3.4- 1.3.6.
   NOTA: I tappi copulatori sono materiali gelatinosi di colore bianco latte o giallastro costituiti da vescicole seminali di ratto maschio e secrezioni prostatiche combinate con secrezioni vaginali.
6. Confermare la gravidanza nella femmina di ratto: dopo aver trovato i tappi copulatori nella gabbia di accoppiamento, osservare gli spermatozoi sullo striscio di secrezione vaginale. Designare questo giorno come giorno di gestazione 1 (GD1).
7. Isolare il ratto gravido in una gabbia separata.
   NOTA: Durante le fasi iniziali della gravidanza, è imperativo evitare che un ratto gravido incontri segnali chimici maschili sconosciuti nel suo ambiente o che coabita con un ratto maschio sconosciuto.
8. I periodi di gestazione del ratto durano in genere 21-23 giorni. Misura e registra il peso corporeo dei ratti da GD1 a GD20.
9. Su GD20, sostituire la gabbia del ratto gravido con una pulita e posizionare del cotone assorbente medico (di dimensioni simili al ratto) nella gabbia. Fornire acqua e cibo sufficienti per la sopravvivenza di sette giorni e posizionare la gabbia in un luogo tranquillo.
   NOTA: Non cambiare la gabbia per almeno 1 settimana dopo il parto del ratto. Quando si passa a una gabbia pulita, trasferire il cotone assorbente usato dalla gabbia sporca a quella nuova per assicurarsi che i ratti possano riconoscere l'odore della loro prole.
10. Il 21^° giorno dopo il parto, separare la prole per sesso e metterla in due gabbie.
    NOTA: A causa delle dimensioni ridotte della prole di 21 giorni, posizionare i pellet di mangime duro in una capsula di Petri di vetro all'interno della gabbia.

2. Programma di allenamento prenatale per il nuoto

1. Condurre un addestramento all'adattamento per tutti i ratti femmina sperimentali per 5 giorni.
   1. Preparare un contenitore di plastica trasparente di almeno 20 cm di altezza e riempirlo con 10 cm di acqua a 34 ± 1°C.
   2. Afferra la punta della coda del topo e sollevala, quindi metti il topo nell'acqua.
   3. Durante l'allenamento adattivo di 15 minuti, monitora attentamente la temperatura dell'acqua ogni 5 minuti, aggiungendo acqua calda per mantenere la temperatura.
   4. Dopo l'addestramento, trasferire il ratto in acqua pulita a 34 ± 1°C per lavare il pelo. Quindi, trasferisci il topo in una gabbia con asciugamani e usa un asciugacapelli per asciugare il pelo.
      NOTA: Il rumore e un ambiente caldo possono causare stress ai ratti. Pertanto, si consiglia di utilizzare un asciugacapelli silenzioso e a temperatura regolabile.
   5. Si prega di riportare il topo nelle rispettive gabbie.
2. Accoppiamento del ratto (seguire i passaggi 1.3-1.6).
3. Dopo il passaggio 1.7, assegnare in modo casuale i ratti gravidi a un gruppo sedentario (SED) e a un gruppo di esercizi (EX).
4. Pesare il ratto ogni giorno prima di ogni sessione di allenamento.
   NOTA: Durante l'allenamento adattivo, la perdita di peso dei ratti non deve superare i 3 g/giorno. Durante l'addestramento prenatale, il peso dei ratti dovrebbe aumentare gradualmente. Se i ratti perdono più di 3 g al giorno, ridurre il tempo di allenamento giornaliero del 50% per consentire il recupero.
5. Condurre l'allenamento di nuoto prenatale per l'EX da GD1 a GD20, 6 giorni alla settimana, dalle 8:00 alle 9:00 del mattino.
   1. Preparare un secchio d'acqua circolare con un diametro di 50 cm e un'altezza minima di 50 cm e riempirlo con 40 cm di acqua ad una temperatura di 34 ± 1°C.
   2. Da GD1 a GD5, eseguire inizialmente l'allenamento di nuoto per 20 min al giorno e aumentare progressivamente fino a 60 min al giorno.
   3. Da GD6 a GD20, continua l'allenamento per 60 minuti al giorno per 6 giorni a settimana.
   4. Per la cura successiva, fare riferimento ai passaggi 2.1.4-2.1.5.
   5. Dopo l'esercizio, somministrare all'EX rat 5 g di semi di girasole per roditori per fornire supporto nutrizionale.
6. Durante l'allenamento EX ogni giorno, posizionare il ratto SED nello stesso ambiente acquatico dell'allenamento adattivo (passaggio 2.1.1). Lascia che il ratto SED trascorra lo stesso tempo nell'ambiente acquatico del ratto EX. Dopo l'esercizio, dai al ratto SED 5 g di semi di girasole per roditori per fornirgli supporto nutrizionale ed emozioni rilassanti.
7. Dopo ogni sessione di allenamento di nuoto, pulisci e disinfetta tutte le attrezzature con luce ultravioletta, compresi secchi d'acqua e asciugamani.

3. Caratteristiche fisiche dei feti

1. La mattina di GD20.5, anestetizzare la femmina di ratto con isoflurano al 3% e sopprimerla in una camera di CO₂ .
2. Usa un coltello chirurgico per praticare un'incisione nell'addome inferiore del ratto. Assicurarsi che l'incisione sia inclinata verso entrambi i lati dell'addome, garantendo la completa esposizione dell'utero.
3. Aprire con cautela l'utero usando pinze e forbici per esporre i feti e la placenta. Separare delicatamente il sottile amnio che circonda i feti usando una pinza per evitare danni indotti dalle forbici ai feti e alle placenta.
4. Pulisci i corpi dei feti usando una garza sterile per rimuovere sangue e muco. Separare in sequenza feti e placente in base alle loro posizioni anatomiche, quindi pesarli.
5. Osservare la distanza tra l'ano e i genitali per determinare il sesso dei feti. I feti maschi hanno una distanza maggiore rispetto alle femmine. Registrare il sesso e la quantità di feti per riferimento futuro.
6. Misurare la lunghezza dei feti usando un calibro mentre si è sdraiati. Poiché i feti sono ancora vivi, possono raggomitolarsi dopo essere stati sezionati, quindi apri i loro corpi per prendere le misure.
   NOTA: Per garantire la coerenza dei risultati sperimentali e la coerenza dei metodi di misurazione, lo stesso sperimentatore mantiene gli stessi standard per tutto il tempo. I feti sono stati soppressi secondo le linee guida raccomandate dall'istituzione e sono stati raccolti campioni di tessuto per ulteriori analisi, se necessario.

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Risultati

Nella sezione sui metodi di riproduzione dei ratti (Figura 1), determiniamo il ciclo estrale delle femmine di ratto effettuando vetrini di secrezione vaginale per aumentare il tasso di successo della riproduzione. Il ciclo estrale dei ratti dura 4-5 giorni, tra cui proestro, estro, metestro e diestro. Le femmine di ratto in metestro o diestro mostrano comportamenti come allontanarsi dai maschi. Allo stesso tempo, quelli in estro sono disposti ad accoppiarsi ...

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Discussione

Questo studio mira a stabilire un programma di esercizi fattibile per i ratti gravidi, inclusi metodi dettagliati di accoppiamento dei ratti, protocolli di allenamento al nuoto e metodi di ricerca per valutare gli indicatori fisiologici nei feti. Abbiamo sviluppato un modello di allenamento prenatale per l'esercizio di nuoto attraverso la pratica, con soluzioni corrispondenti a potenziali problemi che possono sorgere nel protocollo (Tabella 1). Questo protocollo lo rende...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caliper	Mitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd	530-101 N15	Fetus dissect
Circular water bucket	Naliya	N/A	Rat swimming
Experimental Surgical Instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	SP0001-G	Fetus dissect
Glass Microscope Slides	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	80312-3161	Vaginal smear
Glass petri dish	Merck Life Technologies	BR455751-10EA	Offspring rearing
Hairdryer	Panasonic	EH-WNE5H	Post-swimming care
Information Card	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R510-22-10	Fetus dissect
Light microscope	Olympus	IX71-F22PH	Vaginal smear
Mating cage	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Medical Absorbent Cotton	Hongxiang Sanitary Materials Co., LTD	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Rodent Anesthesia Machine, Gas Anesthesia	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R500IE	Fetus dissect
Rodent breeding feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1032	Pregnant rat feeding
Rodent maintenance feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1022	Offspring rearing
Rodent sunflower seeds	Jolly	JP241	Nutritional supplement
Soundproof cotton	Kufu Medical Instrument	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Sterile Cotton Swab (2 mm diameter)	Kufu Medical Instrument	N/A	Vaginal smear
Sterile gauze	Kufu Medical Instrument	N/A	Fetus dissect
Stroke-physiological Saline Solution (0.9% NaCl)	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD	N/A	Vaginal smear
Thermometer	Beekman organism	N/A	The monitoring of rat swimming
Towels	Grace	N/A	Post-swimming care
Transparent plastic container	Naliya	N/A	Swimming adaptive training
Ultraviolet light	Merck Life Technologies	Z169633-1EA	Post-swimming care
Water heater	Haier	EC6001-Q6S	Rat swimming
Weight Scale	Electronlc Acale	JM.A10001	Body weight measurement
Wistar Rats	Vital river Laboratory Animal Technology Co., LTD	N/A	Experiment