Metodi per rilevare la tosse e l'infiammazione delle vie aeree nei topi

Riepilogo

Qui, descriviamo la misurazione della tosse utilizzando un sistema di pletismografia di tutto il corpo (WBP) non invasivo e in tempo reale e le procedure normative per la raccolta di campioni di tessuto di topi e introduciamo alcuni metodi per valutare l'infiammazione delle vie aeree.

Abstract

La tosse cronica, che dura più di 8 settimane, è uno dei disturbi più comuni che richiedono cure mediche e i pazienti soffrono di un enorme onere socioeconomico e di un marcato peggioramento della qualità della vita. I modelli animali possono imitare la complessa fisiopatologia della tosse e sono strumenti importanti per la ricerca sulla tosse. Il rilevamento della sensibilità alla tosse e dell'infiammazione delle vie aeree è di grande importanza per lo studio del complesso meccanismo patologico della tosse. Questo articolo descrive la misurazione della tosse utilizzando un sistema di pletismografia di tutto il corpo (WBP) non invasivo e in tempo reale e le procedure normative per la raccolta di campioni di tessuto (inclusi sangue, polmone, milza e trachea) di topi. Introduce alcuni metodi per valutare l'infiammazione delle vie aeree, tra cui i cambiamenti patologici nelle sezioni polmonari e tracheali colorate con ematossilina ed eosina (HE), la concentrazione totale di proteine, la concentrazione di acido urico e l'attività della lattato deidrogenasi (LDH) nel surnatante del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) e i leucociti e la conta cellulare differenziale del BALF. Questi metodi sono riproducibili e servono come strumenti preziosi per studiare la complessa fisiopatologia della tosse.

Introduzione

La tosse è un importante comportamento di difesa per mantenere la pervietà delle vie aeree e proteggere i polmoni da sostanze potenzialmente dannose. Tuttavia, quando è disregolata, la tosse diventa una condizione patologica¹. La tosse cronica, solitamente definita come della durata di otto o più settimane, è uno dei sintomi più frequenti che richiedono cure mediche². Poiché la tosse cronica persiste spesso per anni, i pazienti soffrono di un enorme onere socioeconomico e di un marcato peggioramento della qualità della vita ^3,4,5. La tosse cronica è ampiamente considerata una sindrome da ipersensibilità alla tosse ed è caratterizzata da tosse fastidiosa spesso scatenata da bassi livelli di esposizione termica, meccanica o chimica⁶. L'insorgenza di ipersensibilità alla tosse è strettamente correlata all'infiammazione delle vie aeree⁷. Tuttavia, i meccanismi fisiopatologici alla base della modulazione della sensibilità alla tosse devono essere ulteriormente chiariti.

I modelli animali possono imitare la complessa fisiopatologia della tosse e sono strumenti importanti per la ricerca sulla tosse ^8,9. Studi precedenti hanno scoperto che l'infezione virale, l'instillazione intrapolmonare di interferone-γ (IFN-γ), la perfusione esofagea di acido cloridrico, l'esposizione agli inquinanti, il fumo di sigaretta e l'acido citrico possono indurre tosse negli animali 10,11,12,13,14,15,16,17. Al fine di valutare meglio la tosse e l'infiammazione delle vie aeree, in questo studio è stato stabilito un modello murino di tosse utilizzando una dose non letale del virus H1N1. Per il rilevamento della tosse, sono stati istituiti clinicamente alcuni strumenti di misurazione della tosse per misurare la tosse, inclusi metodi soggettivi e oggettivi¹⁸. Gli strumenti di valutazione soggettiva per valutare la gravità della tosse includono principalmente una scala analogica visiva, il punteggio della tosse e questionari sulla qualità della vita, ecc.^19,20. Tuttavia, è improbabile che vengano utilizzati per valutare la tosse negli animali. Inoltre, la tosse può essere valutata oggettivamente attraverso un test di provocazione della tosse e il monitoraggio della frequenza della tosse. Il test di provocazione della tosse utilizzando un sistema di pletismografia di tutto il corpo (WBP) è un metodo oggettivo ampiamente utilizzato negli studi sugli animali per misurare la sensibilità alla tosse e rivelare i meccanismi alla base della tosse^13,16. Sulla base delle caratteristiche neuroanatomiche del riflesso della tosse, l'acido citrico, la capsaicina, l'adenosina 5'-trifosfato (ATP), l'isotiocianato di allile (AITC) e il mediatore infiammatorio bradichinina sono comunemente usati come agenti tossivi per indurre la tosse^21,22. L'acido citrico è uno dei primi e più utilizzati agenti tossivi che scatenano i riflessi della tosse, che è stato convalidato per misurare la sensibilità alla tosse. Inoltre, il test di provocazione con acido citrico ha una buona sicurezza, fattibilità e tollerabilità ed è suggerito per valutare la sensibilità al riflesso della tosse in risposta alle terapie per la tosse²³. Pertanto, questo articolo descriverà il metodo per misurare la sensibilità alla tosse in risposta all'acido citrico nei topi utilizzando un sistema WBP non invasivo e in tempo reale.

Gli studi sulla fisiopatologia della tosse richiedono campioni di prova, compresi campioni di sangue, liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) e tessuti polmonari e tracheali per verificare i cambiamenti nei livelli dei fattori chiave²⁴. Attualmente, mancano procedure normative per la raccolta di campioni di tessuto di topi e studi correlati impiegano approcci diversi che complicano la valutazione dell'infiammazione delle vie aeree. Il lavaggio broncoalveolare è un metodo importante per valutare l'infiammazione delle vie aeree nelle malattie respiratorie²⁵. Diversi metodi di lavaggio broncoalveolare porteranno a una mancanza di comparabilità tra studi correlati. Inoltre, diversi metodi di lavaggio broncoalveolare hanno un impatto sulle cellule infiammatorie e sulle citochine infiammatorie nella BALF. Pertanto, questo articolo descriverà l'istituzione di un modello murino di tosse con una dose non letale del virus H1N1, la misurazione della tosse utilizzando un sistema WBP e un metodo di lavaggio broncoalveolare affidabile, sicuro e di grande successo nei topi.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina di Guangzhou (20240248) e sono state eseguite in stretta conformità con le linee guida approvate. In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi privi di patogeni specifici del peso di 20-25 g. Tutti i topi sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 ± 2 °C), umidità (50% ± 20%) e illuminazione (dalle 6:30 alle 18:30) in gabbie dal fondo solido con cibo e acqua disponibili ad libitum. La linea temporale del protocollo è illustrata nella Figura 1.

1. Istituzione di un modello murino di tosse

1. Utilizzare il virus dell'influenza A/California/7/2009 (H1N1). Determinare la dose letale del virus H1N1 nei topi.
   1. In breve, anestetizzare i topi (n = 10 per gruppo) con pentobarbital sodico (80 mg·^kg-1) e quindi infettarli per via intranasale con un virus diluito in serie 10 volte.
   2. Monitorare il decesso per un periodo di 15 giorni. Calcolare la dose letale mediana (LD₅₀) con il metodo Reed-Muench²⁶.
2. Infettare il topo con il virus H1N1.
   1. Sciogliere 0,8 x LD₅₀ di virus H1N1 in 50 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   2. Anestetizzare i topi con pentobarbital sodico (80 mg·^kg-1).
   3. Quando i topi sono stati profondamente anestetizzati, posizionare il topo in posizione supina con le narici rivolte verso l'alto.
   4. Instillare 5-10 μL di soluzione di virus H1N1 o soluzione di PBS (come controllo) per via intranasale in una narice di topi utilizzando una pipetta (Figura 2A).
   5. Quindi, tenere la bocca del topo chiusa con il pollice per far inalare forte il naso in modo che la soluzione del virus H1N1 nella cavità nasale venga completamente inalata nei polmoni (Figura 2B).
   6. Ripetere i passaggi 1.2.4 e 1.2.5 nell'altra cavità nasale dei topi.
   7. Quando tutto il virus H1N1 preparato al punto 1.2.1 viene instillato per via intranasale nei polmoni del topo, metterlo in posizione supina per il riposo (Figura 2C).
3. Misurare la sensibilità alla tosse del topo dopo l'istituzione del modello utilizzando il sistema di pletismografia per tutto il corpo di piccoli animali Buxco. Il giorno 21, anestetizzare intraperitonealmente il topo con pentobarbital sodico (150 mg·^kg-1). Raccogliere ed elaborare sangue, milza, BALF, polmoni e tessuti della trachea (Figura 1).

2. La misurazione della sensibilità alla tosse

1. Preparare l'acido citrico (0,4 M): Mettere 0,1537 mg di acido citrico in una provetta da centrifuga da 5 ml e aggiungere soluzione fisiologica normale a un volume di 2 ml.
2. Ispezione degli strumenti
   1. Controllare i canali: collegare le camere del pletismografo di tutto il corpo secondo le istruzioni del produttore e fare clic sul pulsante di calibrazione: il pulsante di calibrazione cambia da arancione a verde, indicando che la calibrazione è riuscita (Figura 3A).
   2. Calibrare il nebulizzatore:
      1. Dopo aver collegato il nebulizzatore, aggiungere 500 μl di soluzione fisiologica normale nel nebulizzatore e fare clic sul pulsante di nebulizzazione.
      2. Quando il liquido nel nebulizzatore è completamente aerosolizzato, fare nuovamente clic sul pulsante di nebulizzazione per vedere la potenza del nebulizzatore, che generalmente è di circa 0,3 ml/min. Fare nuovamente clic sul pulsante di nebulizzazione per accettare l'attuale potenza di nebulizzazione.
   3. Dopo aver controllato i canali, assicurarsi che il valore di errore sia inferiore allo 0,5%.
3. Impostazione dei parametri
   1. Fare clic su Crea nuovo studio, selezionare l'opzione Tosse , selezionare Topo in Specie e fare clic su Avanti.
   2. Selezionare i parametri CCnt : impostare la durata del periodo di acclimatazione a 1 min, il tempo di risposta a 10 min, il volume dell'aerosol a 1 mL e la durata dell'erogazione a 10 min.
   3. Posizionare il topo cosciente e non trattenuto in singole camere pletismografiche trasparenti per tutto il corpo. Immettere il peso e l'ID soggetto del mouse e fare clic su Avanti.
   4. Aggiungere 1 mL di soluzione di acido citrico (0,4 M) al nebulizzatore e osservare le variazioni in tempo reale di CCnt (Figura 3B).
   5. Dopo che l'acido citrico è stato completamente utilizzato, fare clic su File e termina sessione per completare l'esperimento.

3. Raccolta di sangue, milza, BALF, polmoni e tessuti della trachea del topo (Figura 4)

1. Raccogli il sangue.
   1. Dopo il rilevamento della tosse, anestetizzare il topo con pentobarbital sodico (150 mg·^kg-1) mediante iniezione intraperitoneale. Raccogliere il sangue dalle orbite del topo profondamente anestetizzato. Miscelare 1 mL di sangue in 0,1 mL di tampone anticoagulante (9,9 mg/mL di eparina sodica disciolta in PBS) a 4 °C (Figura 4A).
   2. Agitare la provetta per la raccolta del sangue per mescolare completamente il sangue e l'anticoagulante per prevenire la coagulazione del sangue.
   3. Centrifugare il sangue raccolto a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante, conservarlo a -80 °C (utilizzato per la misurazione delle citochine) e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione di D-Hank. Distribuire 10 μl della sospensione di cellule del sangue sul vetrino per determinare i profili cellulari.
2. Raccogli la milza.
   1. Apri il torace del topo, raccogli il sangue ed essangua attraverso l'arteria (Figura 4B).
   2. Rimuovere il padiglione auricolare sinistro, quindi perfondere la circolazione polmonare e sistemica con 5 mL di soluzione fisiologica normale (Figura 4C, D). Rimuovere l'intera milza dal topo utilizzando una pinza chirurgica (Figura 4E).
   3. Dopo aver misurato il peso della milza, tagliarla in due metà. Fissare la prima metà con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente (RT) per l'analisi istopatologica. Conservare la seconda metà a -80 °C per la misurazione delle citochine.
3. Lavaggio broncoalveolare
   1. Realizzare il tubo di lavaggio broncoalveolare utilizzando una pipetta Pasteur. Scaldare la pipetta Pasteur con una lampada ad alcool. Quando diventa morbido, allungatelo fino a formare un tubo sottile. La lunghezza del tubo di lavaggio broncoalveolare è di 5 cm. Il diametro superiore è di 5 mm e il diametro inferiore è di 1 mm (Figura 5).
   2. Per la raccolta del BALF, separare il polmone destro legando il bronco principale destro. Raccogliere il BALF dai polmoni sinistri lavando tre volte con 0,5 ml di PBS pre-raffreddato su ghiaccio. Il tasso di recupero del BALF è superiore all'80% (Figura 4F).
   3. Centrifugare il BALF raccolto a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Raccogli il surnatante e misura la concentrazione proteica totale, la concentrazione di acido urico, l'attività LDH e le concentrazioni di citochine.
      NOTA: I marcatori infiammatori, tra cui la concentrazione proteica totale, la concentrazione di acido urico e l'attività LDH nel surnatante BALF, vengono rilevati utilizzando il kit di test secondo le linee guida del produttore²⁴.
   4. Risospendere il pellet in 200 μL di PBS e contare i leucociti in BALF con l'aiuto di un vetrino di conteggio.
   5. Per determinare i profili cellulari mediante conta differenziale, spalmare 50 μl della sospensione cellulare sui vetrini e lasciarla asciugare.
   6. Fissare il vetrino con il 4% di paraformaldeide durante la notte, quindi colorare con l'ematossilina-eosina (HE). Classificare almeno 400 cellule in neutrofili, macrofagi, linfociti o eosinofili per vetrino.
4. Prelievo dei tessuti polmonari e tracheali per l'analisi istopatologica
   1. Dopo la raccolta del BALF, rimuovere e fissare metà del polmone destro (Figura 4G) e della trachea (Figura 4H) con paraformaldeide al 4% alla RT per l'analisi istopatologica. Conservare l'altra metà a -80 °C per il western blotting, la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Risultati

La Figura 6 mostra immagini rappresentative di cambiamenti patologici nel polmone colorato con HE (Figura 6A, B), nella trachea (Figura 6C, D) e nella milza (Figura 6E, F). L'infezione da virus H1N1 ha provocato alterazioni infiammatorie nei polmoni di topo, tra cui edema e molti linfociti e infiltrazione di neutrofili. L'infezione da virus H1N1 ha anch...

Discussione

Alcune tosse cronica refrattaria e post-infettiva sono condizioni comuni associate all'infezione da virus respiratorio²⁷. Al fine di valutare meglio la sensibilità alla tosse e l'infiammazione delle vie aeree, in questo studio è stato stabilito un modello murino di tosse utilizzando il virus H1N1. Modelli di tosse murina appropriati dovrebbero essere selezionati per altri studi in base allo scopo dello studio. La maggior parte degli studi precedenti ha utilizzato la cavia come modello animale in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Buxco Small Animal Whole Body Plethysmography System	DSI	—
Calcium-free and magnesium-free Hank’s Balanced Salt Solution	Beyotime	C0219
Citric acid	Sigma-Aldrich	C2404
Hematoxylin-Eosin	BASO Biotechnology	BA-4098
Heparin sodium	Alfa Aesar	A16198
Influenza A/California/7/2009 (H1N1) virus	ATCC	VR-1894
Isoflurane	RWD	R510-22
Lactate dehydrogenase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A020-2-2
Normal saline	Guangzhou Zhongbo Biotechnology	1234-1
Pasteur pipet	NEST	318415
Pentobarbital sodium	Merck	P3761
Phosphate buffered saline	Meilunbio	MA0015
Total protein assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A045-3
Uric acid assay kit	Thermo Fisher Scientific	A22181