Criosezione diretta delle teste di Drosophila per una migliore colorazione a fluorescenza cerebrale e immunocolorazione

Riepilogo

Questo studio presenta un protocollo semplificato per l'elaborazione dei tessuti che coinvolge la decapitazione, la fissazione, la criosezione, la colorazione a fluorescenza, l'immunocolorazione e l'imaging, che può essere esteso all'imaging confocale e multifotonico. Il metodo mantiene un'efficacia paragonabile alle dissezioni complesse, bypassando la necessità di capacità motorie avanzate. L'analisi quantitativa delle immagini offre un ampio potenziale di indagine.

Abstract

L'immunocolorazione del cervello di Drosophila melanogaster è essenziale per esplorare i meccanismi alla base di comportamenti complessi, circuiti neurali e modelli di espressione proteica. I metodi tradizionali spesso comportano sfide come l'esecuzione di dissezioni complesse, il mantenimento dell'integrità dei tessuti e la visualizzazione di modelli di espressione specifici durante l'imaging ad alta risoluzione. Presentiamo un protocollo ottimizzato che combina la criosezione con la colorazione a fluorescenza e l'immunocolorazione. Questo metodo migliora la conservazione dei tessuti e la chiarezza del segnale e riduce la necessità di laboriosa dissezione per l'imaging cerebrale di Drosophila. Il metodo prevede una dissezione rapida, una fissazione ottimale, una crioprotezione e una criosezione, seguite da colorazione fluorescente e immunocolorazione. Il protocollo riduce significativamente il danno tissutale, migliora la penetrazione degli anticorpi e produce immagini nitide e ben definite. Dimostriamo l'efficacia di questo approccio visualizzando specifiche popolazioni neurali e proteine sinaptiche con alta fedeltà. Questo metodo versatile consente l'analisi di vari marcatori proteici nel cervello adulto su più piani z e può essere adattato ad altri tessuti e organismi modello. Il protocollo fornisce uno strumento affidabile ed efficiente per i ricercatori che conducono immunoistochimica di alta qualità negli studi di neurobiologia della Drosophila. La visualizzazione dettagliata di questo metodo facilita l'analisi completa della neuroanatomia, della patologia e della localizzazione delle proteine, rendendolo particolarmente prezioso per la ricerca neuroscientifica.

Introduzione

I comportamenti complessi che vanno dalle interazioni sociali¹, alla percezione e all'elaborazione sensoriale², all'apprendimento³, al movimento⁴ sono guidati dal cervello. Anche i disturbi neurologici sono sempre più comuni e si prevede che aumenteranno con il tempo ^5,6. È fondamentale studiare come funziona il cervello sia in salute che in malattia. Il dogma centrale della biologia molecolare suggerisce che una delle funzioni più importanti delle unità biologiche sono le proteine⁷, e sia quanto che dove sono espresse sono fondamentali per capire come funziona il cervello.

La Drosophila melanogaster, comunemente nota come moscerino della frutta, è un modello di grande valore per lo studio della funzione cerebrale in condizioni di invecchiamento e fisiopatologiche⁸. La disponibilità di strumenti genetici avanzati in Drosophila consente ai ricercatori di esplorare la funzione di quasi tutte le proteine⁹, con librerie genetiche complete per quasi tutti i geni facilmente accessibili¹⁰. Insieme alla sua breve durata di vita e all'alto tasso di riproduzione, queste caratteristiche rendono la Drosophila un modello eccezionale per la ricerca sul cervello¹¹. Ciò ha portato a risultati significativi, tra cui lo sviluppo di una mappa cerebrale completa della mosca¹², e ha persino contribuito a un premio Nobel per aver chiarito i meccanismi neuronali dei ritmi circadiani e degli orologi molecolari 13,14,15. Di conseguenza, la Drosophila rimane un sistema potente e versatile, che fa progredire la nostra comprensione della funzione cerebrale e fornisce intuizioni senza precedenti sui processi neurologici.

L'immunoistochimica e l'immunofluorescenza sono strumenti fondamentali per studiare l'espressione proteica in situ. A differenza di tecniche come il Western Blot, che consente solo l'analisi semiquantitativa ed è tipicamente condotto in tessuto di massa¹⁶, o tecniche complicate e costose come la spettrometria di massa per misurare il livello di proteina¹⁷, l'immunoistochimica è relativamente semplice e consente sia la quantificazione dell'espressione proteica che la misurazione della localizzazione di una proteina all'interno di un tessuto o di una cellula. È importante sottolineare che l'immunoistochimica fluorescente può anche essere multiplexata per misurare più proteine per identificare tipi di cellule e tessuti specifici o rispondere a più domande nello stesso tessuto. Inoltre, la fissazione tissutale può consentire confronti tra diverse condizioni sperimentali, genotipi, età e punti temporali circadiani. Tuttavia, l'immunoistochimica fluorescente può essere impegnativa e molti fattori possono influenzare la qualità dell'immagine. Questo protocollo ottimizzato di criosezione e immunocolorazione per il cervello di Drosophila mira a migliorare l'imaging ad alta risoluzione migliorando la conservazione dei tessuti, la penetrazione degli anticorpi e la visualizzazione delle popolazioni neurali e dei marcatori proteici. Sviluppato per affrontare le sfide dei metodi tradizionali, come la dissezione complessa, il danno tissutale e la risoluzione di imaging limitata associata alle montature dell'intero cervello¹⁸. Questo protocollo combina la criosezione con la colorazione a fluorescenza per garantire l'integrità strutturale e l'imaging nitido su più piani z. Rispetto alle preparazioni a montatura intera, questo metodo riduce al minimo la distorsione, facilita una diffusione più profonda degli anticorpi e fornisce chiare analisi neuroanatomiche e di localizzazione delle proteine¹⁸. La sua versatilità consente l'adattamento ad altri tessuti e organismi modello, offrendo uno strumento affidabile ed efficiente per la ricerca neuroscientifica ^19,20. Può essere adattato per esaminare quasi tutte le proteine e applicato per studiare qualsiasi condizione, malattia o modello.

Protocollo

1. Preparazione dell'attrezzatura

1. Assicurarsi che il criostato sia acceso e impostato a -20 °C. Accendere lo scaldavetrini o una piccola incubatrice, assicurandosi che sia impostato a 37 °C.
   NOTA: In questa fase, i vetrini etichettati possono essere posizionati sullo scaldavivande o sull'incubatrice e lasciati a tempo indeterminato fino al sezionamento.

2. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare 50 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, da 10x PBS. Preparare una soluzione di Paraformaldeide al 4% in PBS con un volume finale di 10 mL.
2. Preparare una soluzione detergente di etanolo al 70% in acqua in un flacone spray. Preparare una soluzione bloccante (albumina sierica bovina (BSA) al 3% in soluzione salina tamponata con Tris da 20x stock). Preparare una soluzione di anticorpi primari (la diluizione dipende dall'esperimento). In questo caso, viene utilizzata una diluizione 1:250 dell'anticorpo di topo ApoE in BSA al 3% in TBS.
3. Preparare una soluzione di anticorpi secondari (la diluizione dipende dall'esperimento). Qui viene utilizzata una diluizione 1:500 di Alexa Flour 750 A21037 Goat Anti-Mouse Secondary al 3% di BSA in TBS.
4. Preparare una soluzione di colorante fluorescente (la diluizione dipende dall'esperimento). Qui viene preparata una soluzione di 5 μg/mL di rosso del Nilo in PBS.
   NOTA: Tutte le soluzioni, in particolare quelle fluorescenti, devono essere refrigerate e conservate in un contenitore refrigerato scuro. Dovrebbero anche essere portati a temperatura ambiente appena prima dell'uso.

3. Raccolta dei tessuti

1. Dopo aver ottenuto le mosche nelle fiale di invecchiamento, aprire la valvola sul tappetino di CO₂ e scaricare rapidamente le mosche sul tappetino per evitare la fuga. Aspetta che le mosche diventino per lo più incoscienti, cessando la maggior parte dei movimenti. Posizionare le mosche sotto il microscopio SZ61 spostando il tappetino sotto la lente dell'obiettivo. Regola l'ingrandimento e la messa a fuoco in modo che le mosche siano chiaramente visibili e comode da decapitare.
   NOTA: Le mosche utilizzate per questo esempio sono ELAV/+ e ELAV>ApoE4
2. Inserire le forbici a molla tra il torace e la testa, stringere con decisione e decapitare da 5 a 10 teste di mosca per gruppo sperimentale. Rimetti le mosche inutilizzate nella loro fiala invecchiata.
   NOTA: In caso di dubbi sulla penetrazione del fissativo, è possibile eseguire una piccola incisione sulla parte posteriore della testa per consentire una maggiore penetrazione dell'agente fissativo nel passaggio 4.1.
3. Utilizzando un pennello, posizionare delicatamente le testine in provette da 1,5 ml marcate su ghiaccio fino a quando non sono stati raccolti i gruppi ELAV/+ e ELAV>ApoE4.

4. Fissazione dell'intero tessuto

1. Rimuovere le provette dal ghiaccio e pipettare 100 μl di paraformaldeide al 4% in soluzione PBS in ciascuna provetta, assicurandosi che tutte le testine siano immerse nella soluzione. Se le testine aderiscono alle pareti del tubo ed evitano il contatto con la soluzione, utilizzare una spazzola per spingerle delicatamente verso il basso o picchiettare leggermente contro una superficie orizzontale per garantire un contatto appropriato.
2. Porre su uno shaker orbitale a temperatura media per 15 min. Dopo 15 minuti, scartare la soluzione di Paraformaldeide e sostituirla con 1x PBS per 10 minuti, assicurandosi che tutte le teste siano immerse nella soluzione.
3. Scartando ogni volta la soluzione precedente, lavare il fazzoletto con PBS 2x per 10 min ciascuno, per un totale di 3 lavaggi.
4. Dopo il lavaggio finale, trasferire le testine in una soluzione di saccarosio al 10% in PBS, assicurandosi che le testine siano immerse all'interno del tubo. Lasciali durante la notte per una saturazione ottimale.
   NOTA: Se si desidera l'imaging in giornata, l'infusione di saccarosio può essere ridotta; Tuttavia, anche gli effetti crioprotettori saranno ridotti proporzionalmente.

5. Preparazione dello stampo

1. Riempire uno stampo etichettato per circa il 50% con il composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT), permettendogli di diffondersi su tutti e 4 gli angoli dello stampo.
2. Usando un pennello, posizionare con cura le teste sulla superficie dell'OCT all'interno dello stampo. Quando si inseriscono più gruppi sperimentali nello stesso stampo, assicurarsi che questi gruppi siano separati all'interno dello stampo per evitare confusione.
   NOTA: È importante prevenire la diluizione del composto OCT attraverso la contaminazione con la precedente soluzione di saccarosio tramite la spazzola. Inoltre, il posizionamento in profondità nell'OCT con il pennello può creare molte bolle attorno alle testine. Evita questi errori per evitare problemi di sezionamento in seguito.
3. Usando la punta della pinza, spingi lentamente ciascuna testina verso il fondo dello stampo con gli occhi rivolti verso il fondo. Questo orientamento è selezionato per un taglio attraverso il piano coronale.
4. Evitare di forare o schiacciare le teste contro il fondo dello stampo durante questo processo. Allinea tutte le teste nelle dimensioni X, Y e Z in modo che ogni sezione contenga tutti i soggetti contemporaneamente. Garantire un'immersione lenta per ridurre la formazione di bolle d'aria.
5. Una volta che tutte le teste sono allineate correttamente, posizionare con cura gli stampi direttamente a -20 °C per congelarli.
   NOTA: Se si nota che l'allineamento delle teste è significativamente fuori posto durante il sezionamento, considerare l'uso di ghiaccio secco o azoto liquido per il congelamento iniziale dello stampo.
6. Una volta che lo stampo si è quasi congelato, riempire il resto con OCT e lasciarlo congelare prima di riporlo a lungo termine a - 80 °C.

6. Criosezione di stampi

NOTA: In genere si consiglia di preparare e tagliare uno stampo vuoto prima di tagliare gli stampi del gruppo sperimentale. Ciò consente di garantire la corretta funzionalità della ruota, della lama e del vetro antirollio immediatamente prima del sezionamento del tessuto.

1. Fissare la punta del mandrino allo stampo applicando una generosa quantità di OCT allo stampo e posizionando la punta sopra, premendola in piano. Lasciarlo congelare completamente nel criostato, di solito entro 5 minuti.
2. Rilasciare la punta e il blocco OCT dallo stampo e posizionarlo nel mandrino, assicurandosi che lo stampo rimanga orientato correttamente dall'alto verso il basso. Serrare la chiave del mandrino finché la punta non è fissata.
3. Allineare il blocco con la lama utilizzando le manopole di regolazione e i controlli della profondità del mandrino.
4. Impostare la larghezza della sezione su 20 μm. Taglia ogni fetta con un movimento lento ma costante, consentendo al vetro antirollio di catturare ogni fetta. Cattura le sezioni utilizzando le diapositive riscaldate toccando la diapositiva fino al bordo più vicino della sezione e lasciando che la sezione si sollevi sulla diapositiva. È possibile inserire fino a otto sezioni su una guida di dimensioni standard (25 mm x 75 mm x 1 mm) se distanziate in modo appropriato.
   NOTA: C'è una questione di scelta da fare quando si scelgono le sezioni da raccogliere. Come risultato dell'orientamento dell'inclusione, le sezioni precedenti saranno dalla parte anteriore e le sezioni successive saranno dalle porzioni posteriori della testa. Pertanto, se l'interesse risiede in una particolare area piuttosto che in un'altra, la selezione della sezione può essere regolata di conseguenza. In alternativa, tutte le sezioni possono essere raccolte su più vetrini fino a quando non rimane più tessuto.
5. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per almeno 30 minuti ma non più di 1 ora.

7. Colorazione e IHC

NOTA: Per questo protocollo, il metodo descriverà in dettaglio l'IHC utilizzando un anticorpo primario non coniugato. Gli anticorpi coniugati con fluorocromo, o altre colorazioni di fluorescenza che possono essere eseguite in un unico stadio, devono essere utilizzati insieme all'anticorpo secondario se entrambi devono essere utilizzati insieme.

1. Subito dopo il periodo di asciugatura, rimuovere l'OCT dai bordi del vetrino utilizzando una lametta, lasciando spazio a un bordo idrofobo. Disegna un bordo idrofobico su ogni diapositiva usando il pennarello. Lasciare asciugare per 5 minuti.
2. Lavare tutti i vetrini 3 volte per 5 minuti ciascuno con PBS pipettandoli delicatamente sulla parte superiore del vetrino, evitando di pipettare direttamente sulla parte superiore del tessuto quando possibile.
   NOTA: La pipetta da 1000 μl è molto utile in questo caso. Un vetrino di dimensioni standard con tessuto deve essere completamente coperto con 750 μl di qualsiasi soluzione. È possibile utilizzare anche rastrelliere e secchi per scivoli.
3. Dopo che i vetrini sono stati lavati, pipettare sui vetrini il 3% di BSA in soluzione bloccante TBS. Lasciare incubare per 30 minuti.
4. Eliminare la soluzione bloccante e pipettare la soluzione di anticorpi primari sui vetrini. In questo caso, una diluizione 1:250 di SC-13521 ApoE in BSA al 3% in TBS. Lasciare incubare l'anticorpo per una notte a 4 °C o per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare salviette umidificate o salviette di carta per evitare che la soluzione si secchi durante la notte.
5. Scartare l'anticorpo primario e utilizzando la pipetta, lavare 3 volte per 5 minuti ciascuna con PBS.
6. Aggiungere la soluzione di anticorpi secondari. In questo caso, una diluizione 1:500 di AF 750 Goat Anti-Mouse oltre a una concentrazione di 5 μg/mL di Nile Red, il tutto in BSA al 3% in TBS. Lasciare incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   NOTA: Incubiamo contemporaneamente un colorante fluorescente e un anticorpo secondario nello stesso tampone, BSA al 3% in TBS. Questo è preferibile purché non ci siano conflitti noti tra i due reagenti. In caso di conflitti, incubare separatamente ed eseguire altri 3 lavaggi tra le incubazioni.
7. Lavare i vetrini 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Dopo il lavaggio finale, lasciare una piccola quantità di PBS sul vetrino.

8. Montaggio e preparazione per l'imaging

1. Utilizzando una pipetta da 1000 μl, aggiungere 3-5 gocce di terreno di montaggio indurente contenente DAPI (0,9 μg/ml), in modo uniforme sul vetrino evitando la caduta diretta sul tessuto.
2. Posizionare il vetrino coprioggetti sul vetrino, evitando la formazione di bolle d'aria.
   NOTA: L'uso di una pinza può aiutare in questo senso, consentendo al vetrino coprioggetti di scivolare vicino alla superficie del vetrino prima di sganciarlo definitivamente.
3. Maneggiare con cura le guide appena montate e conservarle in piano fino a completa asciugatura. Sigillare i vetrini con lo smalto per unghie se si prevede una conservazione a lungo termine.
4. Acquisisci le immagini il prima possibile per evitare il decadimento fluorescente.

9. Acquisizione delle immagini

NOTA: Per l'acquisizione delle immagini, verrà descritto in dettaglio l'uso del software Olympus Cell Sense Dimensions.

1. Prima dell'imaging, ispezionare i vetrini e pulirli utilizzando etanolo al 70% in soluzione acquosa. Se le diapositive vengono visualizzate immediatamente dopo il montaggio, prestare particolare attenzione durante la pulizia per evitare di disturbare il vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare le superfici del vetrino e del vetrino coprioggetti per 5 minuti prima di eseguire l'imaging.
2. Selezionare ciascun canale desiderato per l'acquisizione, in questo caso i canali per DAPI, Nile Red e AF 750.
   1. Selezionare l'ingrandimento desiderato come descritto di seguito. La scelta dell'ingrandimento dipende dall'esperimento; Qui, usa l'ingrandimento 10x.
      NOTA: Tutti gli ingrandimenti sono utilizzabili, comprese le lenti a base di olio. Se lo si desidera, applicare olio da immersione sulla superficie del vetrino.
   2. Per ciascun canale, calibrare i tempi di esposizione corretti in base ai soggetti con fluorescenza più luminosi in un esperimento. Evitare la sovraesposizione generando un'immagine il più luminosa possibile.
      NOTA: In generale, i due principali fattori determinanti di una scarsa acquisizione del processo sono la sovraesposizione, con conseguente perdita di definizione, e l'eccesso di segnale di fondo, che è difficile da separare dal segnale reale. Inoltre, le esposizioni devono essere impostate in modo indipendente per ogni ingrandimento unico utilizzato.
   3. Seleziona la cartella da salvare e assegna un nome alle immagini unite all'interno del menu. Dopo l'acquisizione, tutte le immagini si troveranno in questa cartella e porteranno il nome qui definito.
   4. Cattura le immagini mettendo a fuoco prima un soggetto nel canale che consente il miglior punto focale e quindi inizia la raccolta. Mantenere la procedura di concentrarsi su ciascun argomento nello stesso canale per coerenza in tutto l'esperimento.
   5. Cattura tutti i gruppi sperimentali utilizzati per i confronti successivi nello stesso giorno per evitare il decadimento fluorescente tra i gruppi confrontati.

10. Quantificazione

NOTA: La quantificazione può essere eseguita utilizzando una varietà di software. In questo caso, si fa riferimento all'uso di Olympus CellSense Dimensions.

1. Dopo la raccolta, rivedi le immagini. Rimuovere le sezioni che presentano imperfezioni o artefatti di sezionamento dalla cartella di quantificazione. Seleziona immagini che riflettano l'obiettivo della quantificazione. Esempi di imperfezioni sono bolle, sezioni strappate, tessuti sovrapposti e polvere o detriti.
   1. Per selezionare le immagini appropriate, assicurarsi che tutte le immagini con tessuto cerebrale siano utilizzate per la quantificazione per riflettere l'espressione complessiva in tutto il cervello. In alternativa, usa immagini che riflettono solo il cervello anteriore, medio o posteriore per dare un'idea delle differenze di espressione in queste aree.
2. All'interno dei menu di conteggio e misurazione, determinare i parametri di interesse e i relativi limiti per la quantificazione delle immagini.
   1. Per quantificare l'espressione di ApoE mediante il confronto del valore medio dell'intensità, selezionare valori di soglia tali da considerare tutti i pixel per quel canale (0-infinito). Inoltre, è possibile delineare le regioni di interesse utilizzando gli strumenti di disegno disponibili.
3. Eseguire il conteggio e la misurazione in batch per tutti i file o singolarmente su ogni immagine.
   1. Per l'elaborazione batch, registrare le impostazioni e l'esecuzione della quantificazione, quindi selezionare la cartella in cui eseguire la quantificazione. L'elaborazione in batch è accessibile tramite la scheda Macro Manager e accelera notevolmente il flusso di lavoro.
4. Esportare la tabella dati in un foglio di calcolo per la tracciatura. A tale scopo, utilizzare il menu Conta e misura i risultati durante l'apertura o l'esportazione automatica in una tabella durante l'esecuzione in batch. Queste tabelle di dati conterranno tutti i parametri selezionati scelti nel passaggio 10.2.
5. Per l'analisi statistica e la tracciatura, è possibile tracciare i dati utilizzando un foglio di calcolo direttamente o tramite altri software. La familiarità con il software scelto è la chiave per generare una rappresentazione accurata dei risultati sperimentali. Qui, i valori assoluti di intensità dell'espressione di ApoE nel cervello del mutante sono stati normalizzati al controllo e quindi tracciati utilizzando GraphPad Prism.

Risultati

Il metodo sopra descritto consente l'imaging a fluorescenza del cervello di mosca adulto in modo affidabile e senza noiosa dissezione. Illustrato semplicemente nella Figura 1, il metodo è semplice e può essere eseguito rapidamente se tutti i campioni, le attrezzature e i materiali sono prontamente disponibili. In alternativa, utilizzando la conservazione a -80 °C durante la fase di stampo OCT, i campioni possono essere con...

Discussione

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging fluorescente preciso di teste di Drosophila criosezionate. Si tratta di un approccio semplice che presenta diversi aspetti positivi importanti. Vale a dire, i metodi sono abbastanza semplici da poter essere completati da chiunque abbia una formazione di base sulla sicurezza in laboratorio, sono adattabili per misurare l'espressione di qualsiasi proteina per la quale esistono anticorpi di alta qualità e consentono una misurazione prec...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 uL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 uL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
AF750 Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Alexa Fluor	A21037
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
ApoE Mouse Primary Antibody	Santa Cruz	SC13521
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Distilled Water
Dry Ice	???	???
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Nile Red	Sigma	N3013
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Orbital Shaker	OHAUS	SHLD0415DG
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500