Прямая криосекция голов дрозофил для усиленного флуоресцентного окрашивания мозга и иммуноокрашивания

Резюме

В этом исследовании представлен упрощенный протокол обработки тканей, включающий обезглавливание, фиксацию, криосекцию, флуоресцентное окрашивание, иммуноокрашивание и визуализацию, который может быть расширен до конфокальной и многофотонной визуализации. Метод сохраняет эффективность, сравнимую со сложными вскрытиями, минуя необходимость в продвинутых моторных навыках. Количественный анализ изображений обеспечивает широкие исследовательские возможности.

Аннотация

Иммуноокрашивание мозга Drosophila melanogaster имеет важное значение для изучения механизмов, лежащих в основе сложного поведения, нейронных цепей и паттернов экспрессии белков. Традиционные методы часто сопряжены с такими проблемами, как выполнение сложной диссекции, поддержание целостности тканей и визуализация конкретных паттернов экспрессии во время визуализации с высоким разрешением. Мы представляем оптимизированный протокол, который сочетает в себе криосекцию с флуоресцентным окрашиванием и иммуноокрашиванием. Этот метод улучшает сохранность тканей и четкость сигнала, а также снижает потребность в трудоемком вскрытии для визуализации мозга дрозофилы. Метод включает в себя быструю диссекцию, оптимальную фиксацию, криопротекцию и криосекцию с последующим флуоресцентным окрашиванием и иммуноокрашиванием. Протокол значительно снижает повреждение тканей, усиливает проникновение антител и позволяет получать четкие, четко определенные изображения. Мы демонстрируем эффективность этого подхода, визуализируя конкретные нейронные популяции и синаптические белки с высокой точностью. Этот универсальный метод позволяет анализировать различные белковые маркеры в мозге взрослого человека в нескольких z-плоскостях и может быть адаптирован для других тканей и модельных организмов. Протокол предоставляет надежный и эффективный инструмент для исследователей, проводящих высококачественную иммуногистохимию в нейробиологических исследованиях дрозофилы. Детальная визуализация этого метода способствует всестороннему анализу нейроанатомии, патологии и локализации белков, что делает его особенно ценным для исследований в области нейробиологии.

Введение

Сложное поведение, начиная от социальных взаимодействий¹, сенсорного восприятия и обработки^{информации2, обучения 3} и заканчивая движением4, управляется мозгом. Неврологические расстройства также становятся все более распространенными и, по прогнозам, со временем будут увеличиваться ^5,6. Крайне важно изучить, как мозг работает как в здоровом, так и в болезнетворном состоянии. Центральная догма молекулярной биологии предполагает, что одной из наиболее важных функций биологических единиц являются^белки-7, и как их количество, так и место их экспрессии имеет решающее значение для понимания того, как работает мозг.

Drosophila melanogaster, широко известная как плодовая муха, является очень ценной моделью для изучения функции мозга в условиях старения и патофизиологических состояний⁸. Наличие передовых генетических инструментов у дрозофил позволяет исследователям изучать функцию практически любого белка⁹, с обширными генетическими библиотеками почти для каждого гена, которые^{легко доступны.} В сочетании с короткой продолжительностью жизни и высокой скоростью размножения эти особенности делают дрозофилу исключительной моделью^{для исследования мозга}. Это привело к значительным достижениям, в том числе к разработке полной карты мозга мухи¹², и даже способствовало присуждению Нобелевской премии за выяснение нейронных механизмов циркадных ритмов и молекулярных часов 13,14,15. В результате, дрозофила остается мощной и универсальной системой, способствующей нашему пониманию функций мозга и обеспечивающей беспрецедентное понимание неврологических процессов.

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция являются основополагающими инструментами для изучения экспрессии белков in situ. В отличие от таких методов, как вестерн-блоттинг, который позволяет проводить только полуколичественный анализ и обычно проводится на объемных тканях¹⁶, или сложных и дорогостоящих методов, таких как масс-спектрометрия для измерения уровня белка¹⁷, иммуногистохимия относительно проста и позволяет как количественно оценить экспрессию белка, так и измерить локализацию белка в ткани или клетке. Важно отметить, что флуоресцентная иммуногистохимия также может быть мультиплексирована для измерения нескольких белков для идентификации конкретных типов клеток и тканей или ответа на несколько вопросов в одной и той же ткани. Кроме того, тканевая фиксация может позволить сравнивать различные экспериментальные условия, генотипы, возраст и циркадные временные точки. Тем не менее, флуоресцентная иммуногистохимия может быть сложной задачей, и многие факторы могут влиять на качество изображения. Этот оптимизированный протокол криосекции и иммуноокрашивания мозга дрозофил направлен на улучшение визуализации с высоким разрешением за счет улучшения сохранности тканей, проникновения антител и визуализации нейронных популяций и белковых маркеров. Разработан для решения проблем при использовании традиционных методов, таких как сложная диссекция, повреждение тканей и ограниченное разрешение визуализации, связанное с монтированием всего мозга¹⁸. Этот протокол сочетает в себе криосекцию с флуоресцентным окрашиванием для обеспечения структурной целостности и четкого изображения в нескольких z-плоскостях. По сравнению с цельными препаратами, этот метод сводит к минимуму искажения, способствует более глубокой диффузии антител и обеспечивает четкий нейроанатомический анализ и анализ локализации белков¹⁸. Его универсальность позволяет адаптироваться к другим тканям и модельным организмам, предлагая надежный и эффективный инструмент для исследований в области нейробиологии^19,20. Он может быть адаптирован для изучения практически любого белка и применен для изучения любого состояния, болезни или модели.

протокол

1. Подготовка оборудования

1. Убедитесь, что криостат включен и установлен на -20 °C. Включите подогреватель слайдов или небольшой инкубатор, установив его на 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе промаркированные предметные стекла можно поместить на обогреватель или инкубатор и оставить на неопределенный срок до разделения.

2. Приготовление растворов

1. Приготовьте 50 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4, из 10x запаса PBS. Приготовьте раствор 4% Параформальдегида в PBS с конечным объемом 10 мл.
2. Приготовьте чистящий раствор 70% этанола в воде в пульверизаторе. Приготовьте блокирующий раствор (3% бычий сывороточный альбумин (БСА) в трис-буферном физрастворе из 20-кратного запаса). Приготовьте первичный раствор антитела (разведение зависит от эксперимента). Здесь используется разведение мышиного антитела ApoE в соотношении 1:250 в 3% BSA при TBS.
3. Приготовьте вторичный раствор антитела (разведение зависит от эксперимента). Здесь используется разведение 1:500 Alexa Flour 750 A21037 Goat Anti-Mouse Secondary в 3% BSA в TBS.
4. Приготовьте раствор флуоресцентного морилки (разведение зависит от эксперимента). Здесь готовится раствор нильского красного в концентрации 5 мкг/мл в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, особенно флуоресцентные, следует хранить в холодильнике и хранить в темном охлажденном контейнере. Их также следует довести до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

3. Забор ткани

1. После получения мушек во флаконах для старения откройте клапан на коврике CO₂ и быстро сбросьте мух на коврик, чтобы избежать побега. Подождите, пока мухи потеряют сознание и перестанут двигаться. Положение перемещается под микроскопом SZ61 путем перемещения коврика под линзой объектива. Отрегулируйте увеличение и сфокусируйтесь так, чтобы мухи были хорошо видны и их было удобно обезглавливать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере используются мухи ELAV/+ и ELAV>ApoE4
2. Вставьте пружинные ножницы между грудной клеткой и головой, плотно сожмите и обезглавьте от 5 до 10 головок мух в каждой экспериментальной группе. Верните неиспользованных мух в их стареющий флакон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если существуют опасения по поводу проникновения фиксатора, можно сделать небольшой разрез на задней части головки, чтобы обеспечить более высокую проникаемость фиксирующего агента на шаге 4.1.
3. С помощью щетки аккуратно поместите головки в пробирки объемом 1,5 мл на лед до тех пор, пока не будут собраны группы ELAV/+ и ELAV>ApoE4.

4. Фиксация всей ткани

1. Извлеките пробирки изо льда и нанесите пипеткой 100 мкл 4% параформальдегида в растворе PBS в каждую пробирку, следя за тем, чтобы все головки были погружены в раствор. Если головки прилипают к стенкам трубки и избегают контакта с раствором, используйте щетку, чтобы аккуратно надавить на них вниз, или слегка постучите по горизонтальной поверхности, чтобы обеспечить надлежащий контакт.
2. Поместите на орбитальный шейкер со средним режимом на 15 минут. Через 15 минут выбросьте раствор параформальдегида и замените его 1x PBS на 10 минут, убедившись, что все головки погружены в раствор.
3. Каждый раз отбрасывая предыдущий раствор, промойте салфетку PBS 2x по 10 минут каждая, всего 3 стирки.
4. После окончательной промывки переложите головки в 10% сахарозу в растворе PBS, убедившись, что головки погружены в трубку. Оставьте их на ночь для оптимального насыщения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется визуализация в тот же день, инфузию сахарозы можно уменьшить; Тем не менее, эффекты криопротектора также будут пропорционально снижены.

5. Подготовка формы

1. Заполните этикетированную форму примерно на 50% составом для оптимальной температуры резки (OCT), чтобы он распределился по всем 4 углам формы.
2. С помощью щетки осторожно поместите головки на поверхность ОКТ внутри формы. При помещении нескольких экспериментальных групп в одну и ту же форму убедитесь, что эти группы разделены внутри формы, чтобы избежать путаницы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно предотвратить разведение соединения ОКТ из-за загрязнения предыдущим раствором сахарозы через щетку. Кроме того, при глубоком введении в ОКТ с помощью щетки может образоваться множество пузырьков вокруг головок. Избегайте этих ошибок, чтобы предотвратить проблемы с разделами в будущем.
3. С помощью кончика щипцов медленно прижмите каждую головку ко дну формы глазами, обращенными ко дну. Эта ориентация выбирается для разреза в корональной плоскости.
4. Избегайте прокола или раздавливания головок о дно формы во время этого процесса. Выровняйте все заголовки в измерениях X, Y и Z так, чтобы в каждой секции одновременно находились все объекты. Обеспечьте медленное погружение, чтобы уменьшить образование пузырьков воздуха.
5. После того, как все головки будут правильно выровнены, осторожно поместите формы непосредственно в температуру -20 °C для замораживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время секционирования наблюдается значительное смещение соосных частей, рассмотрите возможность использования сухого льда или жидкого азота для первоначального мгновенного замораживания формы.
6. После того, как форма в основном застынет, заполните оставшуюся часть OCT и дайте ей застыть перед хранением в течение длительного времени при температуре -80 °C.

6. Криосекция форм

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, рекомендуется подготовить и вырезать заготовку формы перед резкой экспериментальных групповых форм. Это позволяет обеспечить надлежащую функциональность колеса, лезвия и стекла с защитой от скручивания непосредственно перед разделкой ткани.

1. Прикрепите биту патрона к форме, нанеся на форму большое количество OCT и поместив биту сверху, прижав ее плашмя. Дайте ему полностью застыть в криостате, обычно в течение 5 минут.
2. Извлеките биту и блок OCT из формы и поместите его в патрон, убедившись, что форма остается правильно ориентированной сверху вниз. Затяните ключ патрона до упора.
3. Совместите блок с лезвием с помощью ручек регулировки и регуляторов глубины патрона.
4. Установите ширину сечения равной 20 мкм. Разрежьте каждый ломтик медленным, но последовательным движением, позволяя стеклу с защитой от перекатов захватить каждый кусочек. Снимайте секции с помощью подогретых слайдов, прикоснувшись слайдом к ближайшему краю секции и позволив секции подняться на слайд. На затворе стандартного размера (25 мм x 75 мм x 1 мм) можно разместить до восьми секций при правильном расстоянии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе разделов для сбора необходимо сделать выбор. В результате ориентации встраивания более ранние срезы будут находиться с передней, а более поздние срезы будут с задних частей головы. Таким образом, если интерес к одной конкретной области лежит больше, чем к другой, выбор раздела может быть скорректирован соответствующим образом. В качестве альтернативы, все срезы можно собрать на нескольких предметных стеклах, пока не останется ткани.
5. Дайте предметным стеклам высохнуть при комнатной температуре не менее 30 минут, но не более 1 часа.

7. Окрашивание и ИГХ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола метод будет детализировать ИГХ с использованием неконъюгированного первичного антитела. Флюорохромные конъюгированные антитела или другие флуоресцентные красители, которые могут быть выполнены в одну стадию, следует использовать вместе со вторичным антителом, если оба они должны использоваться вместе.

1. Сразу после высыхания удалите ОКТ с краев предметного стекла с помощью бритвенного лезвия, оставив место для гидрофобной границы. Нарисуйте гидрофобную границу на каждом слайде с помощью маркера. Дайте ему высохнуть в течение 5 минут.
2. Промойте все предметные стекла 3 раза в течение 5 минут каждый с помощью PBS, аккуратно нанося пипетирование на верхнюю часть предметного стекла, по возможности избегая пипетирования непосредственно поверх ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь наиболее полезна пипетка объемом 1000 μл. Предметное стекло стандартного размера с салфеткой должно быть полностью покрыто 750μл любого раствора. Также можно использовать выдвижные решетки и ведра.
3. После того, как предметные стекла будут промыты, нанесите пипетку 3% BSA в блокирующем растворе TBS на предметные стекла. Дайте поинкубироваться в течение 30 минут.
4. Выбросьте блокирующий раствор и нанесите первичный раствор антитела на предметные стекла. В этом случае разведение SC-13521 ApoE в соотношении 1:250 в 3% BSA при TBS. Дайте антителу инкубироваться в течение ночи при 4 °C или в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте влажные салфетки или бумажные полотенца, чтобы раствор не высох за ночь.
5. Выбросьте первичное антитело и с помощью пипетки промойте 3 раза по 5 минут каждый PBS.
6. Добавьте вторичный раствор антитела. В этом случае разведение AF 750 Goat Anti-Mouse в соотношении 1:500 в дополнение к концентрации 5 мкг/мл Nile Red, все в 3% BSA в TBS. Дайте ему инкубироваться в течение 1 часа при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы одновременно инкубируем флуоресцентный краситель и вторичное антитело в одном буфере, 3% BSA в TBS. Это предпочтительно до тех пор, пока нет известных конфликтов между двумя реагентами. Если конфликты существуют, инкубируйте отдельно и выполняйте дополнительно 3 промывки между инкубациями.
7. Промойте слайды 3 раза PBS по 5 мин каждая. После окончательной промывки оставьте небольшое количество PBS на предметном стекле.

8. Монтаж и подготовка к визуализации

1. С помощью пипетки объемом 1000 мкл добавьте 3-5 капель затвердевающего монтажного материала, содержащего DAPI (0,9 мкг/мл), равномерно по предметному стеклу, избегая прямого попадания капель на ткань.
2. Поместите покровное стекло на предметное стекло, не допуская образования пузырьков воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование щипцов может помочь в этом, позволяя покровному стеколу скользить близко к поверхности предметного стекла, прежде чем окончательно освободиться.
3. Осторожно обращайтесь со свежеустановленными горками и храните их в горизонтальном положении до полного высыхания. Заклейте горки лаком для ногтей, если предполагается длительное хранение.
4. Делайте снимки как можно скорее, чтобы избежать флуоресцентного распада.

9. Получение изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений будет подробно описано использование программного обеспечения Olympus Cell Sense Dimensions.

1. Перед визуализацией осмотрите предметные стекла и протрите их, используя 70% этанол в водном растворе. Если слайды отображаются сразу после монтажа, будьте особенно осторожны при очистке, чтобы не повредить покровное стекло. Дайте поверхностям предметного стекла и защитного стекла высохнуть в течение 5 минут перед нанесением изображения.
2. Выберите каждый нужный канал для захвата, в данном случае каналы для DAPI, Nile Red и AF 750.
   1. Выберите желаемое увеличение, как описано ниже. Выбор увеличения зависит от эксперимента; Здесь используйте 10-кратное увеличение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать все увеличения, включая масляные линзы. При желании нанесите на поверхность предмета горки иммерсионное масло.
   2. Для каждого канала откалибруйте правильное время экспозиции на основе самых ярких флуоресцентных объектов в эксперименте. Избегайте передержки при создании как можно более яркого изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, двумя основными факторами, определяющими некачественный захват процесса, являются переэкспонирование, приводящее к потере четкости, и слишком большой фоновый сигнал, который трудно отделить от истинного сигнала. Кроме того, экспозиция должна быть установлена независимо для каждого используемого уникального увеличения.
   3. Выберите папку для сохранения и присвойте имя объединенным изображениям в меню. После захвата все изображения будут находиться в этой папке и носить имя, указанное здесь.
   4. Делайте снимки, сначала сфокусировавшись на объекте в канале, который позволяет получить наилучшую точку фокусировки, а затем начните съемку. Поддерживайте процедуру концентрации внимания на каждом объекте в одном и том же канале для обеспечения согласованности на протяжении всего эксперимента.
   5. Захватите все экспериментальные группы, используемые для последующих сравнений, в тот же день, чтобы избежать распада флуоресценции между сравниваемыми группами.

10. Количественная оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка может быть выполнена с использованием различных программ. В этой статье рассматривается использование Olympus CellSense Dimensions.

1. После сбора просмотрите изображения. Удалите разделы, которые имеют дефекты или артефакты сечения, из папки количественного анализа. Выберите изображения, которые отражают цель количественной оценки. Примерами дефектов являются пузыри, разорванные участки, перекрывающиеся ткани, пыль или мусор.
   1. Чтобы выбрать подходящие изображения, убедитесь, что все изображения с изображением тканей мозга используются для количественной оценки, чтобы отразить общую экспрессию во всем мозге. В качестве альтернативы используйте изображения, отражающие только переднюю, среднюю или заднюю часть мозга, чтобы дать представление о различиях в экспрессии в этих областях.
2. В меню подсчета и измерения определите интересующие параметры и их границы для количественной оценки изображений.
   1. Для количественной оценки выражения ApoE путем сравнения средних значений интенсивности выберите пороговые значения таким образом, чтобы учитывались все пиксели для этого канала (0-бесконечность). Кроме того, очерчивайте области интереса с помощью доступных инструментов рисования.
3. Выполните подсчет и измерьте либо пакетно для всех файлов, либо по отдельности для каждого изображения.
   1. Для пакетной обработки запишите настройки и выполнение количественного анализа, а затем выберите папку для выполнения количественного анализа. Обработка в пакете доступна через вкладку «Менеджер макросов» и значительно ускоряет рабочий процесс.
4. Экспортируйте таблицу данных в таблицу для построения графика. Для этого используйте меню результатов подсчета и измерения при автоматическом открытии или экспорте в таблицу при выполнении в пакете. Эти таблицы данных будут содержать все выбранные параметры, выбранные на шаге 10.2.
5. Для статистического анализа и построения графиков отображайте данные с помощью электронной таблицы напрямую или с помощью другого программного обеспечения. Знакомство с выбранным программным обеспечением является ключом к созданию точного представления результатов эксперимента. Здесь абсолютные значения интенсивности экспрессии ApoE в мозге мутанта были нормализованы до контрольной группы, а затем построены с помощью GraphPad Prism.

Результаты

Описанный выше метод позволяет проводить флуоресцентную визуализацию мозга взрослых мух надежно и без утомительного вскрытия. Как показано на рисунке 1, этот метод прост и может быть выполнен быстро, если все образцы, оборудование и ?...

Обсуждение

В этой статье мы представляем протокол для точной флуоресцентной визуализации криосекционированных голов дрозофил. Это простой подход, который имеет несколько важных положительных моментов. А именно, методы достаточно просты, чтобы их мог пройти любой, кто про?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 uL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 uL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
AF750 Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Alexa Fluor	A21037
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
ApoE Mouse Primary Antibody	Santa Cruz	SC13521
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Distilled Water
Dry Ice	???	???
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Nile Red	Sigma	N3013
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Orbital Shaker	OHAUS	SHLD0415DG
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500