Cryosectionnement direct des têtes de drosophile pour une coloration par fluorescence cérébrale et une immunocoloration améliorées

Résumé

Cette étude présente un protocole simplifié pour le traitement des tissus impliquant la décapitation, la fixation, la cryosection, la coloration par fluorescence, l’immunocoloration et l’imagerie, qui peut être étendu à l’imagerie confocale et multiphotonique. La méthode maintient une efficacité comparable à celle des dissections complexes, en contournant le besoin de motricité avancée. L’analyse quantitative d’images offre un vaste potentiel d’investigation.

Résumé

L’immunomarquage du cerveau de Drosophila melanogaster est essentiel pour explorer les mécanismes à l’origine de comportements complexes, de circuits neuronaux et de modèles d’expression protéique. Les méthodes traditionnelles comportent souvent des défis tels que la réalisation de dissections complexes, le maintien de l’intégrité des tissus et la visualisation de modèles d’expression spécifiques pendant l’imagerie haute résolution. Nous présentons un protocole optimisé qui combine la cryosectionnement avec la coloration par fluorescence et l’immunomarquage. Cette méthode améliore la préservation des tissus et la clarté du signal et réduit le besoin de dissection laborieuse pour l’imagerie cérébrale de la drosophile. La méthode implique une dissection rapide, une fixation optimale, une cryoprotection et une cryosection, suivies d’une coloration fluorescente et d’une immunocoloration. Le protocole réduit considérablement les lésions tissulaires, améliore la pénétration des anticorps et produit des images nettes et bien définies. Nous démontrons l’efficacité de cette approche en visualisant des populations neuronales spécifiques et des protéines synaptiques avec une grande fidélité. Cette méthode polyvalente permet d’analyser divers marqueurs protéiques dans le cerveau adulte sur plusieurs plans z et peut être adaptée à d’autres tissus et organismes modèles. Le protocole fournit un outil fiable et efficace pour les chercheurs qui mènent des études d’immunohistochimie de haute qualité dans les études de neurobiologie de la drosophile. La visualisation détaillée de cette méthode facilite l’analyse complète de la neuroanatomie, de la pathologie et de la localisation des protéines, ce qui la rend particulièrement précieuse pour la recherche en neurosciences.

Introduction

Les comportements complexes allant des interactions sociales¹, de la perception et du traitement sensoriels², de l’apprentissage³ au mouvement⁴ sont pilotés par le cerveau. Les troubles neurologiques sont également de plus en plus fréquents et devraient augmenter avec le temps ^5,6. Il est essentiel d’étudier le fonctionnement du cerveau dans la santé et la maladie. Le dogme central de la biologie moléculaire suggère que l’une des fonctions les plus importantes des unités biologiques est la protéine⁷, et que la quantité et l’endroit où elles sont exprimées sont essentiels pour comprendre le fonctionnement du cerveau.

Drosophila melanogaster, communément appelée mouche des fruits, est un modèle très précieux pour l’étude de la fonction cérébrale dans des conditions de vieillissement et de physiopathologie⁸. La disponibilité d’outils génétiques avancés chez la drosophile permet aux chercheurs d’explorer la fonction de presque toutes les protéines⁹, avec des bibliothèques génétiques complètes pour presque tous les gènes facilement accessibles¹⁰. Associées à sa courte durée de vie et à son taux de reproduction élevé, ces caractéristiques font de la drosophile un modèle exceptionnel pour la recherche sur le cerveau¹¹. Cela a conduit à des réalisations importantes, notamment le développement d’une carte cérébrale complète de la mouche¹², et a même contribué à un prix Nobel pour l’élucidation des mécanismes neuronaux des rythmes circadiens et des horloges moléculaires 13,14,15. En conséquence, la drosophile reste un système puissant et polyvalent, faisant progresser notre compréhension du fonctionnement du cerveau et fournissant des informations sans précédent sur les processus neurologiques.

L’immunohistochimie et l’immunofluorescence sont des outils fondamentaux pour étudier l’expression des protéines in situ. Contrairement à des techniques telles que le Western Blot, qui ne permet qu’une analyse semi-quantitative et est généralement effectuée dans le tissu en vrac¹⁶, ou des techniques compliquées et coûteuses comme la spectrométrie de masse pour mesurer le niveau^{de protéine 17}, l’immunohistochimie est relativement simple et permet à la fois de quantifier l’expression des protéines et de mesurer la localisation d’une protéine dans un tissu ou une cellule. Il est important de noter que l’immunohistochimie fluorescente peut également être multiplexée pour mesurer plusieurs protéines afin d’identifier des types de cellules et de tissus spécifiques ou de répondre à plusieurs questions dans le même tissu. De plus, la fixation tissulaire peut permettre des comparaisons entre différentes conditions expérimentales, génotypes, âges et points circadiens. Cependant, l’immunohistochimie fluorescente peut être difficile et de nombreux facteurs peuvent influencer la qualité de l’image. Ce protocole optimisé de cryosection et d’immunomarquage pour le cerveau des drosophiles vise à améliorer l’imagerie à haute résolution en améliorant la préservation des tissus, la pénétration des anticorps et la visualisation des populations neuronales et des marqueurs protéiques. Développé pour relever les défis des méthodes traditionnelles, telles que la dissection complexe, les lésions tissulaires et la résolution d’imagerie limitée associée aux montures du cerveau entier¹⁸. Ce protocole combine la cryosection avec la coloration par fluorescence pour garantir l’intégrité structurelle et une imagerie nette sur plusieurs plans z. Par rapport aux préparations entières, cette méthode minimise la distorsion, facilite la diffusion plus profonde des anticorps et fournit des analyses neuroanatomiques et de localisation des protéines claires18. Sa polyvalence permet de s’adapter à d’autres tissus et organismes modèles, offrant un outil fiable et efficace pour la recherche en neurosciences^19,20. Il peut être adapté pour examiner presque n’importe quelle protéine et appliqué pour étudier n’importe quelle condition, maladie ou modèle.

Protocole

1. Préparation de l’équipement

1. Assurez-vous que le cryostat est sous tension et réglé à -20 °C. Allumez le chauffe-lames ou un petit incubateur, en vous assurant qu’il est réglé à 37 °C.
   REMARQUE : À ce stade, les lames étiquetées peuvent être placées sur le réchaud ou l’incubateur et laissées indéfiniment jusqu’à la section.

2. Préparation des solutions

1. Préparez 50 ml de 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, à partir de 10 fois le stock de PBS. Préparer une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS avec un volume final de 10 ml.
2. Préparez une solution de nettoyage à 70 % d’éthanol dans de l’eau dans un flacon pulvérisateur. Préparez une solution bloquante (3 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution saline tamponnée au Tris à partir de 20 fois le stock). Préparez une solution primaire d’anticorps (la dilution dépend de l’expérience). Ici, une dilution de 1:250 de l’anticorps ApoE de souris dans 3 % de BSA dans le TBS est utilisée.
3. Préparez une solution secondaire d’anticorps (la dilution dépend de l’expérience). Ici, une dilution de 1:500 de Alexa Flour 750 A21037 Goat Anti-Mouse Secondary dans 3 % BSA in TBS est utilisée.
4. Préparez une solution de coloration fluorescente (la dilution dépend de l’expérience). Ici, une solution de 5 μg/mL de rouge du Nil dans du PBS est préparée.
   REMARQUE : Toutes les solutions, en particulier les fluorescentes, doivent être réfrigérées et stockées dans un récipient réfrigéré sombre. Ils doivent également être portés à température ambiante juste avant utilisation.

3. Prélèvement de tissus

1. Après avoir obtenu des mouches dans des flacons de vieillissement, ouvrez la valve sur le tapis de CO₂ et déversez rapidement les mouches sur le tapis pour éviter de vous échapper. Attendez que les mouches deviennent la plupart du temps inconscientes, cessant la plupart des mouvements. Positionnez les mouches sous le microscope SZ61 en déplaçant le tapis sous l’objectif. Ajustez le grossissement et la mise au point de manière à ce que les mouches soient clairement visibles et confortables à décapiter.
   REMARQUE : Les mouches utilisées pour cet exemple sont ELAV/+ et ELAV>ApoE4
2. Insérez des ciseaux à ressort entre le thorax et la tête, pressez fermement et décapitez 5 à 10 têtes de mouches par groupe expérimental. Remettez les mouches inutilisées dans leur flacon de vieillissement.
   REMARQUE : S’il existe des préoccupations concernant la pénétration du fixateur, une petite incision peut être pratiquée sur la partie postérieure de la tête pour permettre une pénétration accrue de l’agent fixateur à l’étape 4.1.
3. À l’aide d’un pinceau, placer délicatement les têtes dans des tubes de 1,5 mL étiquetés sur de la glace jusqu’à ce que les groupes ELAV/+ et ELAV>ApoE4 aient été recueillis.

4. Fixation du tissu entier

1. Retirer les tubes de la glace et pipeter 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans une solution de PBS dans chaque tube, en veillant à ce que toutes les têtes soient immergées dans la solution. Si les têtes adhèrent aux parois du tube et évitent tout contact avec la solution, utilisez une brosse pour les pousser doucement vers le bas ou tapotez légèrement contre une surface horizontale pour assurer un contact approprié.
2. Placer sur un agitateur orbital à l’aide d’un réglage moyen pendant 15 min. Après 15 min, jetez la solution de paraformaldéhyde et remplacez-la par 1x PBS pendant 10 min, en vous assurant que toutes les têtes sont immergées dans la solution.
3. En jetant la solution précédente à chaque fois, lavez le mouchoir avec du PBS 2x pendant 10 min chacun, pour un total de 3 lavages.
4. Après le lavage final, transférez les têtes dans une solution de saccharose à 10 %, en vous assurant que les têtes sont immergées dans le tube. Laissez-les toute la nuit pour une saturation optimale.
   REMARQUE : Si l’imagerie le jour même est souhaitée, la perfusion de saccharose peut être réduite ; Cependant, les effets cryoprotecteurs seront également réduits proportionnellement.

5. Préparation du moule

1. Remplissez un moule étiqueté à environ 50 % avec un composé à température de coupe optimale (OCT), ce qui lui permet de s’étendre aux 4 coins du moule.
2. À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement les têtes à la surface de l’OCT à l’intérieur du moule. Lorsque vous placez plusieurs groupes expérimentaux dans le même moule, assurez-vous que ces groupes sont séparés à l’intérieur du moule pour éviter toute confusion.
   REMARQUE : Il est important d’éviter la dilution du composé OCT par contamination par la solution de saccharose préalable via la brosse. De plus, le placement profond dans l’OCT à l’aide de la brosse peut créer de nombreuses bulles autour des têtes. Évitez ces erreurs pour éviter des problèmes de sectionnement plus tard.
3. À l’aide de la pointe de la pince, poussez lentement chaque tête vers le fond du moule, les yeux tournés vers le bas. Cette orientation est sélectionnée pour une coupe à travers le plan coronal.
4. Évitez de perforer ou d’écraser les têtes contre le fond du moule pendant ce processus. Alignez toutes les têtes dans les dimensions X, Y et Z de sorte que chaque section contienne tous les sujets simultanément. Assurez une immersion lente pour réduire la formation de bulles d’air.
5. Une fois que toutes les têtes sont correctement alignées, placez soigneusement les moules directement à -20 °C pour les congeler.
   REMARQUE : Si l’alignement des têtes est noté comme étant significativement décalé pendant le sectionnement, envisagez l’utilisation de glace sèche ou d’azote liquide pour la congélation instantanée initiale du moule.
6. Une fois que le moule est presque gelé, remplissez le reste d’OCT et laissez-le congeler avant de le stocker à long terme à -80 °C.

6. Cryosectionnement des moules

REMARQUE : Il est généralement conseillé de préparer et de découper un moule vierge avant de découper des moules de groupe expérimentaux. Cela permet de s’assurer du bon fonctionnement de la roue, de la lame et du verre anti-roulis immédiatement avant de sectionner les tissus.

1. Fixez le mandrin au moule en appliquant une quantité généreuse d’OCT dans le moule et en plaçant le foret sur le dessus, en le pressant à plat. Laissez-le geler complètement dans le cryostat, généralement dans les 5 minutes.
2. Libérez le foret et le bloc OCT du moule et placez-le dans le mandrin, en veillant à ce que le moule reste correctement orienté de haut en bas. Serrez la clé du mandrin jusqu’à ce que l’embout soit bien fixé.
3. Alignez le bloc avec la lame à l’aide des boutons de réglage et des commandes de profondeur du mandrin.
4. Réglez la largeur de section sur 20 μm. Coupez chaque tranche en utilisant un mouvement lent mais constant, permettant au verre anti-roulis de capturer chaque tranche. Capturez des sections à l’aide des diapositives réchauffées en touchant la diapositive sur le bord le plus proche de la section et en laissant la section s’élever sur la diapositive. Jusqu’à huit sections peuvent être montées sur une glissière de taille standard (25 mm x 75 mm x 1 mm) lorsqu’elles sont espacées de manière appropriée.
   REMARQUE : Il y a une question de choix à faire lors du choix des sections à collecter. En raison de l’orientation de l’encastrement, les sections antérieures produiront de la partie antérieure et les sections ultérieures des parties postérieures de la tête. Ainsi, si l’intérêt réside dans un domaine particulier plus qu’un autre, la sélection des sections peut être ajustée en conséquence. Alternativement, toutes les sections peuvent être collectées sur plusieurs lames jusqu’à ce qu’il ne reste plus de tissu.
5. Laisser sécher les lames à température ambiante pendant au moins 30 minutes mais pas plus de 1 h.

7. Coloration et IHC

REMARQUE : Pour ce protocole, la méthode détaillera l’IHC à l’aide d’un anticorps primaire non conjugué. Les anticorps conjugués au fluorochrome, ou d’autres colorations de fluorescence qui peuvent être réalisées en une seule étape, doivent être utilisés avec l’anticorps secondaire si les deux doivent être utilisés ensemble.

1. Immédiatement après la période de séchage, retirez l’OCT sur les bords de la lame à l’aide d’une lame de rasoir, en laissant de la place pour une bordure hydrophobe. Dessinez une bordure hydrophobe sur chaque diapositive à l’aide du marqueur. Laissez sécher pendant 5 min.
2. Lavez toutes les lames 3 fois pendant 5 minutes chacune avec du PBS en pipetant doucement sur le dessus de la lame, en évitant de pipeter directement sur le tissu lorsque cela est possible.
   REMARQUE : La pipette de 1000 μL est la plus utile ici. Une lame de taille standard avec du tissu doit être complètement recouverte de 750 μL de n’importe quelle solution. Des supports à glissières et des seaux peuvent également être utilisés.
3. Une fois les lames lavées, pipeter à 3 % de BSA dans une solution de blocage TBS sur les lames. Laisser incuber pendant 30 minutes.
4. Jetez la solution bloquante et pipetez la solution d’anticorps primaire sur les lames. Dans ce cas, une dilution de 1:250 de SC-13521 ApoE dans 3 % de BSA dans du TBS. Laisser l’anticorps incuber pendant une nuit à 4 °C ou pendant 1 h à température ambiante. Utilisez des lingettes humides ou des serviettes en papier pour éviter que la solution ne se dessèche pendant la nuit.
5. Jetez l’anticorps primaire et, à l’aide de la pipette, lavez-le 3 fois pendant 5 minutes chacune avec du PBS.
6. Ajouter la solution d’anticorps secondaire. Dans ce cas, une dilution de 1:500 d’AF 750 Goat Anti-Mouse en plus d’une concentration de 5 μg/mL de Nile Red, le tout dans 3 % de BSA dans du TBS. Laissez incuber pendant 1 heure à température ambiante.
   REMARQUE : Nous incubons simultanément un colorant fluorescent et un anticorps secondaire dans le même tampon, 3 % de BSA dans le TBS. Ceci est préféré tant qu’il n’y a pas de conflits connus entre les deux réactifs. En cas de conflit, incuber séparément et effectuer 3 lavages supplémentaires entre les incubations.
7. Lavez les lames 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. Après le lavage final, laissez une petite quantité de PBS sur la lame.

8. Montage et préparation pour l’imagerie

1. À l’aide d’une pipette de 1000 μL, ajoutez 3 à 5 gouttes de support de montage durcissant contenant du DAPI (0,9 μg/ml), uniformément sur la lame en évitant la chute directe sur le tissu.
2. Placez la lamelle sur la glissière, en évitant toute formation de bulles d’air.
   REMARQUE : L’utilisation de pinces peut aider à cela en permettant à la lamelle de glisser près de la surface de la glissière avant de finalement se libérer.
3. Manipulez les diapositives fraîchement montées avec soin et rangez-les à plat jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Scellez les lames à l’aide de vernis à ongles si un entreposage à long terme est prévu.
4. Capturez des images dès que possible pour éviter la pourriture fluorescente.

9. Acquisition d’images

REMARQUE : Pour la capture d’image, l’utilisation du logiciel Olympus Cell Sense Dimensions sera détaillée.

1. Avant l’imagerie, inspectez les lames et essuyez-les avec de l’éthanol à 70 % dans une solution d’eau. Si les diapositives sont imagées immédiatement après le montage, faites très attention lors du nettoyage pour ne pas déranger la lamelle. Laissez sécher les surfaces de la lame et de la lamelle pendant 5 minutes avant l’imagerie.
2. Sélectionnez chaque canal souhaité pour capturer, dans ce cas, les canaux pour DAPI, Nile Red et AF 750.
   1. Sélectionnez l’agrandissement souhaité comme décrit ci-dessous. Le choix du grossissement dépend de l’expérience ; Ici, utilisez un grossissement de 10x.
      REMARQUE : Tous les grossissements sont utilisables, y compris les lentilles à base d’huile. Si vous le souhaitez, appliquez de l’huile d’immersion sur la surface de la lame.
   2. Pour chaque canal, calibrez les temps d’exposition appropriés en fonction des sujets fluorescents les plus brillants d’une expérience. Évitez la surexposition tout en générant une image aussi lumineuse que possible.
      REMARQUE : En général, les deux principaux facteurs déterminants d’une mauvaise capture de processus sont la surexposition, qui entraîne une perte de définition, et l’excès de signal de fond, difficile à séparer du signal réel. De plus, les expositions doivent être réglées indépendamment pour chaque grossissement unique utilisé.
   3. Sélectionnez le dossier à enregistrer et nommez les images fusionnées dans le menu. Après la capture, toutes les images seront situées dans ce dossier et porteront le nom défini ici.
   4. Capturez des images en vous concentrant d’abord sur un sujet dans le canal qui permet d’obtenir le meilleur point focal, puis commencez la collecte. Maintenez la procédure de mise au point sur chaque sujet dans le même canal pour assurer la cohérence de l’expérience.
   5. Capturer tous les groupes expérimentaux utilisés pour des comparaisons ultérieures le même jour afin d’éviter la désintégration fluorescente entre les groupes comparés.

10. Quantification

REMARQUE : La quantification peut être effectuée à l’aide de divers logiciels. Ici, l’utilisation d’Olympus CellSense Dimensions est référencée.

1. Après la collecte, examinez les images. Supprimez les sections qui présentent des imperfections ou des artefacts de coupe du dossier de quantification. Sélectionnez des images qui reflètent l’objectif de quantification. Des exemples d’imperfections sont les bulles, les sections déchirées, les tissus qui se chevauchent et la poussière ou les débris.
   1. Pour choisir les images appropriées, assurez-vous que toutes les images présentant du tissu cérébral sont utilisées pour la quantification afin de refléter l’expression globale dans tout le cerveau. Vous pouvez également utiliser des images reflétant uniquement le cerveau avant, moyen ou postérieur pour donner un aperçu des différences d’expression dans ces zones.
2. Dans les menus Comptage et Mesure, déterminez les paramètres d’intérêt et leurs limites pour la quantification des images.
   1. Pour quantifier l’expression ApoE par comparaison des valeurs d’intensité moyenne, sélectionnez des valeurs de seuillage telles que tous les pixels de ce canal soient pris en compte (0-infini). De plus, délimitez les régions d’intérêt à l’aide des outils de dessin disponibles.
3. Exécutez le décompte et la mesure soit par lots pour tous les fichiers, soit individuellement sur chaque image.
   1. Pour le traitement par lots, enregistrez les paramètres et l’exécution de la quantification, puis sélectionnez le dossier dans lequel effectuer la quantification. Le traitement par lots est accessible via l’onglet du gestionnaire de macros et accélère considérablement le flux de travail.
4. Exportez le tableau de données dans une feuille de calcul pour le traçage. Pour ce faire, utilisez le menu Compter et mesurer les résultats lors de l’ouverture ou de l’exportation automatique vers une table lors de l’exécution d’un lot. Ces tables de données contiendront tous les paramètres sélectionnés à l’étape 10.2.
5. Pour l’analyse statistique et le traçage, tracez les données à l’aide d’une feuille de calcul directement ou à l’aide d’un autre logiciel. La familiarité avec le logiciel choisi est essentielle pour générer une représentation précise des résultats expérimentaux. Ici, les valeurs d’intensité absolue de l’expression de l’ApoE dans le cerveau du mutant ont été normalisées par rapport au contrôle, puis tracées à l’aide de GraphPad Prism.

Résultats

La méthode décrite ci-dessus permet d’obtenir une imagerie par fluorescence du cerveau de mouches adultes de manière fiable et sans dissection fastidieuse. Illustrée simplement à la figure 1, la méthode est simple et peut être mise en œuvre rapidement si tous les échantillons, équipements et matériaux sont facilement disponibles. Alternativement, en utilisant un stockage à -80 °C pendant l’étape de moulage O...

Discussion

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie fluorescente précise de têtes de drosophiles cryosectionnées. Il s’agit d’une approche simple qui présente plusieurs avantages importants. À savoir, les méthodes sont suffisamment simples pour que toute personne ayant une formation de base en sécurité en laboratoire puisse les compléter, elles sont adaptables pour mesurer l’expression de n’importe quelle protéine pour laquelle des anticorps de haute qualité exist...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 uL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 uL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
AF750 Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Alexa Fluor	A21037
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
ApoE Mouse Primary Antibody	Santa Cruz	SC13521
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Distilled Water
Dry Ice	???	???
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Nile Red	Sigma	N3013
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Orbital Shaker	OHAUS	SHLD0415DG
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500