Riconosciamo l&#39;appoggio di ricerca dal Programma di Ricerca Intramurale NIBIB, NIH.

Esempio di assemblaggio delle celle e di coppia <ol><li> Iniziamo la costruzione delle cellule del campione, mettendo insieme due assemblee finestra. Inserire una guarnizione finestra nel supporto finestra. Posizionare il rivestimento finestra (o è talvolta chiamato un cuscino finestra) dentro il titolare finestra in modo che l&#39;apertura del rivestimento è di fronte alla cava del titolare. Con una leggera angolazione, posizionare la finestra nel supporto allineando la tracciatura della finestra con il modo in chiave del titolare finestra. Premere delicatamente ai bordi molto su entrambi i lati della finestra. </li><li> Per garantire la chiusura e la coppia accurata della cella campione, abbiamo coprire leggermente la guarnizione corpo e l&#39;anello a vite con lubrificante Spinkote. Stendere una piccola quantità di Spinkote tra il pollice e l&#39;indice. Rivestire le filettature anello con una sottile pellicola invisibile di Spinkote. Allo stesso modo, cappotto la guarnizione alloggi. Eliminare ogni lubrificante visibile. </li><li> Iniziare il montaggio delle cellule campione facendo scorrere uno di assemblaggio finestra, con la finestra rivolta verso l&#39;alto verso di voi, nella custodia del cellulare allineando la linguetta con la chiave di casa. Allineare la scanalatura centrale con la chiave di casa e lasciarlo cadere delicatamente sulla parte superiore della finestra di montaggio all&#39;interno della cellula. </li><li> Non usare mai alcun tipo di strumento per spingere il fulcro nella sede della cella. Ciò potrebbe causare danni permanenti al CP con conseguente perdita durante gli esperimenti. Girare la seconda assemblea finestra in modo che la finestra è rivolta verso il centro, lontano da voi, allineare cava con chiave alloggi e farlo scorrere verso il basso sulla parte superiore del centro. Inserire una guarnizione alloggiamento sulla parte superiore, poi, un anello a vite in modo che il &quot;Out&quot; è visibile. Usando le dita e uno strumento di allineamento, la mano stringere l&#39;anello di vite. Se il CP non scivola facilmente nel barile abitazioni, prima allineare, poi, luogo la seconda assemblea finestra su di esso. Applicando leggera pressione al ribasso sul gruppo finestra, far scorrere entrambi nella custodia del cellulare allo stesso tempo. In questo modo, evitiamo premendo direttamente sul PC. Ora è un buon momento per guardare all&#39;interno della cellula per la polvere, lanugine e impronte digitali. Noterete anche Newton Anelli che indicano che c&#39;è ancora aria tra il CP e le finestre. Questi scompaiono dopo l&#39;applicazione della coppia. </li><li> Con l&#39;anello a vite e la parola &quot;fuori&quot; visibile, mettere la cella del campione fino in fondo nella pinza cellula coppia dello stand di coppia. Tenere in luogo delle cellule, applicando una pressione costante sul manico supporto della coppia. In un movimento continuo, stringere l&#39;anello di vite tra i 120-140 in-lbs. Se si utilizza una chiave dinamometrica regolabile micrometrico, è impostato tra i 120-140 in / lbs e stringere la ghiera fino a chiave &quot;click&quot; che indica la coppia impostata è stata raggiunta. Rilasciare la maniglia stare coppia e rimuovere con attenzione la cellula campione senza toccare le finestre. </li></ol> Carico e di tenuta della cella campione <ol start="6"><li> Per gli esperimenti velocità di sedimentazione, abbiamo regolarmente caricare un volume di 400ul in ogni settore del centrotavola 12 millimetri con una pipetta 200ul. Posizionare la cella campione con i fori di carico in alto e il &quot;fuori&quot; parola sull&#39;anello viti a vista. Far scorrere il modo puntale metà giù verso il settore centro sinistra attraverso i fori di carico e lentamente erogare 200ul di soluzione di riferimento. Ripetere una volta al totale 400ul. Utilizzando la punta della pipetta stessa e la stessa tecnica, con cura e lentamente riempire il settore DESTRA centrotavola con 400ul di soluzione campione. I volumi di 150-180 ul vengono utilizzati per esperimenti di equilibrio di sedimentazione, ma la stessa cura e la tecnica devono essere seguite. E &#39;indispensabile per soddisfare i volumi di soluzioni e del campione il più possibile. Montaggio la punta della pipetta saldamente la pipetta, lentamente carico e di erogazione di soluzioni, evitando le bolle di carico e usando la punta della pipetta stessa per entrambe le soluzioni di tutti gli aiuti a mantenere i volumi uguali possibile. </li><li> Sigillare il cellulare mettendo 2 nuovi rosso guarnizioni custodia connettore comodamente in ogni foro di carico assicurandosi che siano posizionati tra il pezzo centrale e l&#39;alloggiamento in alluminio. Coprire ciascuno con un tappo contenitore. Serrare a mano con un piccolo cacciavite a testa piatta. </li></ol> Esempio di allineamento in cella rotore <ol start="8"><li> Prima di caricare il rotore, assicurarsi che il contrappeso non è più di 0,5 g più leggere rispetto alla cella campione nella posizione opposta nel caso in cui le perdite delle cellule del campione. Iniziate con il saldo a zero. Prima pesare la cella campione che sarà in posizione di fronte al CB. Tarare la bilancia per sottrarre il peso delle cellule del campione, poi, pesa il CB. Aggiungere o sottrarre il peso del foro di fissaggio del contrappeso. Assicurarsi che i pesi non sporgono dalla parte superiore. Pesare per garantire che il peso finale è a controbilanciare 0,5 g più leggere rispetto alla cella campione opposto. </li><li> Utilizzando un 4-luogo rotore, posizionare il contrappeso in posizione 4, in modo che la freccia bianca è visibile e che vanno in tha la direzione della forza centrifuga. Assicurarsi che sia fino in fondo all&#39;interno del rotore. Delicatamente la vite di fissaggio, che si trova sulla parte superiore del contrappeso proprio di fronte alla freccia bianca, fino a quando il contrappeso è saldamente in posizione, ma ancora in grado di essere allineati. Posizionare la cella campione equilibrato con il corpo tappi di fronte al centro del rotore e il &quot;fuori&quot; parola sull&#39;anello viti a vista. </li><li> Guardando da sotto il rotore, allineare la presente all&#39;interno scriba (il marchio più vicino al centro del rotore) con la tracciatura sul contrappeso utilizzando uno strumento di allineamento. Stringere la vite per bloccare controbilanciare allineati in posizione. Allo stesso modo, allineare la cellula campione scriba marchio con il marchio all&#39;interno scriba in posizione 2 sul rotore. </li></ol> Per ulteriori informazioni, vedere <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

L&#39;assemblea cellula corretta, l&#39;inserimento del campione e l&#39;allineamento delle cellule nel rotore è fondamentale per gli esperimenti di alta qualità AUC. Questo è vero, in particolare, per esperimenti che richiedono un&#39;analisi molto dettagliata dei dati acquisiti su profili sedimentazione del macromolecolari, per esempio, quando si studiano le interazioni delle proteine ​​e determinare gli importi globali traccia. Spesso la qualità della configurazione sperimentale è limitante per l&#39;accuratezza e la precisione dei risultati dello studio AUC. Per i dettagli sulla progettazione pratica e l&#39;ulteriore esecuzione di esperimenti AUC, vedere Riferimenti 1 - 3. Workshop che copre la configurazione pratica, teoria e analisi dei dati di esperimenti AUC si terranno due volte l&#39;anno presso il nostro laboratorio presso il National Institutes of Health [4].

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

Il ultracentrifuga analitica (AUC) è un potente strumento biofisico che ci permette di registrare profili sedimentazione macromolecolare durante la centrifugazione ad alta velocità. Se correttamente progettato ed eseguito, una velocità di sedimentazione AUC o esperimento equilibrio di sedimentazione in grado di rivelare una grande quantità di una proteina in quanto a dimensioni e la forma, la purezza del campione, coefficiente di sedimentazione, afferma oligomerizzazione e interazioni proteina-proteina. Questa tecnica, tuttavia, richiede un livello di attenzione rigorosa tecnica. Celle campione possesso di un pezzo sectored centro a sandwich tra due assemblee finestra. Essi sono sigillati con una pressione di coppia di circa 120-140 in / lbs. Tampone e del campione vengono caricati nei settori centrale e poi, dopo di tenuta, le cellule sono perfettamente allineati in un rotore in titanio in modo che i sistemi di rilevamento ottico di scansione sia di esempio e di buffer di riferimento sulla linea mediana stesso percorso radiale attraverso ogni settore centrale durante la rotazione a velocità fino a 60, 000 giri al minuto e sotto vuoto molto alto Non solo è corretto montaggio cella campione critici, i componenti delle cellule del campione sono molto costosi e devono essere adeguatamente curato per garantire che siano in ottimali condizioni di lavoro al fine di evitare perdite e rotture durante gli esperimenti. Maneggiare con cura le finestre, perché anche la minima crepa o graffio può portare alla rottura nella centrifuga. Il contatto tra il centro e le finestre devono essere il più stretto possibile, cioè gli anelli di Newton non s dovrebbe essere visibile dopo che la pressione viene applicata una coppia. Polvere, lanugine, graffi e oli su entrambi i finestrini o il fulcro ogni compromesso questo contatto e può facilmente portare a perdite di soluzioni da un settore all&#39;altro o fuoriuscire il centro tutti insieme. Non solo i campioni preziosi persi, perdite di soluzioni durante un esperimento causerà uno squilibrio di pressione nella cella che spesso porta a vetri rotti e centrotavola. Inoltre, guarnizioni spina e prese alloggio deve essere saldamente in atto per evitare soluzioni di essere tirato fuori dal settore centrale attraverso i fori di carico dal vuoto spinto nella camera di centrifuga. Rivestimenti finestra e le guarnizioni devono essere privi di rotture e crepe che potrebbero causare il movimento con conseguente rottura dei vetri. Questo video dimostra le nostre procedure di assemblaggio campione di cellule, di coppia, il caricamento e l&#39;allineamento del rotore per ridurre al minimo i danni ai componenti, la soluzione di perdite e rotture durante l&#39;esperimento perfetto AUC.

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Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Il ultracentrifuga analitica (AUC) delle cellule del campione tiene campione e tampone di riferimento e durante gli esperimenti, ed è esposto a alto vuoto e velocità del rotore fino a 60.000 giri al minuto. Questo video dimostra l&#39;attenzione rigorosa ai dettagli necessari per l&#39;assemblaggio, il caricamento e l&#39;allineamento di questa componente molto importante di un esperimento AUC.

Assemblaggio, carico, allineamento e di una cella analitica del campione Ultracentrifuga

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

assembly-loading-alignment-an-analytical-ultracentrifuge-sample

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Views.  Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science. Il ultracentrifuga analitica (AUC) delle cellule del campione tiene campione e tampone di riferimento e durante gli esperimenti, ed è esposto a alto vuoto e velocità del rotore fino a 60.000 giri al minuto. Questo video dimostra l'attenzione rigorosa ai dettagli necessari per l'assemblaggio, il caricamento e l'allineamento di questa componente molto importante di un esperimento AUC.

Video: Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Ricerca

Biologia

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Assemblea, Tuning e utilizzo di un microscopio Apertureless Near Field Infrared for Imaging Proteine

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine ​​FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l&#39;analisi TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Caricamento criogenico del campione in uno spettrometro a risonanza magnetica nucleare ad angolo magico che preserva la vitalità cellulare

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...