La microscopia a cellule vive consente ai ricercatori di studiare la dinamica nucleare del lievito di fissione in mitosi e meiosi in tempo reale. La forza di questo metodo deriva dallo studio dei processi nucleari nelle cellule viventi in normali condizioni fisiologiche che eliminano la necessità di fissanti e macchie tossiche. Questa tecnica affronta questioni relative alla tempistica, alla stabilità e alla mobilità delle proteine che potrebbero non essere suscettibili alla manipolazione genetica o biomeccanica.
È fondamentale prestare molta attenzione alla salute e all'idoneità delle cellule del lievito di fissione prima dell'imaging. Esaminare sempre la morfologia e le caratteristiche di crescita per garantire la coerenza dei risultati tra gli esperimenti. Questo protocollo mostra il modo relativamente semplice per preparare diapositive al microscopio che, se padroneggiate correttamente, possono migliorare la coerenza e la riproducibilità dell'imaging prolungato delle cellule vive.
Per iniziare a raccogliere la materia cellulare dalla piastra di risveglio criogenica, strisciarla su piastre SI e incubarla a 25 gradi Celsius o 32 gradi Celsius a seconda del genotipo del lievito per svegliare i ceppi di lievito di fissione dalla conservazione criogenica. Quindi utilizzare un anello sterile per prelevare le cellule dalle singole colonie nei ceppi di lievito di fissione risvegliati e inocularle in provette contenenti tre millilitri di mezzo liquido SI. Posizionare i tubi in uno shaker a 150-220 giri/min per crescere a 25 o 32 gradi Celsius durante la notte fino alla fase di log tardiva con una lettura della densità ottica desiderata da 0,7 a 1,0.
Trasferire 10 microlitri della coltura su una diapositiva del microscopio. Indossare un coverslip e metterlo al microscopio per verificare la corretta morfologia cellulare e lo stato nutrizionale. Per impostare uno scivolo al microscopio per l'analisi della mitosi o della meiosi aggiungere prima due grammi di agarosio nel pallone da 500 millilitri contenente 100 millilitri di mezzo minimo più integratori per mitosi o mezzo sporulante liquido per la meiosi.
Riscaldare la soluzione di agarosio in un forno a microonde con una potenza del 60% in incrementi di 10 secondi o posizionare il becher in un bagno d'acqua di 55 gradi Celsius per 10 minuti. Ruotare la soluzione per garantire una fusione efficiente. Impostare due diapositive al microscopio su un supporto per la punta della pipetta con la diapositiva superiore appoggiata su due pile di nastro da laboratorio ad entrambe le estremità come supporto per creare una forma incrociata.
Regolare la distanza tra le due diapositive a maggiore di due millimetri per formare un pad spesso nei seguenti passaggi per l'imaging prolungato. Dopo aver raffreddato l'agarosio fuso per un minuto a temperatura ambiente, rimuovere lo scivolo superiore e utilizzare una punta di pipetta ad ampio foro per erogare da 50 a 100 microlitri sullo scivolo inferiore per creare un punto. Prima che l'agarosio si raffredda, posizionare lo scivolo superiore in alto per generare una spalmazione di circa uno e 1/2 a due centimetri di diametro.
L'imaging ottimale delle cellule vive è fondamentale per le successive fasi di elaborazione dei dati. Assicurarsi di eliminare eventuali palline d'aria nell'agarosio fuso e creare un pad sottile per periodi di imaging superiori a quattro ore. Per esaminare gli eventi mitotici crescono le cellule dalle colture di avviamento in EMM liquido o PMG più integratori durante la notte.
Trasferire un millilitro della coltura in una cuvetta, e misurare sullo spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 595 nanometri. La crescita cellulare è considerata fase a metà log quando la densità ottica raggiunge 0,4. Quindi centrifugare un millilitro della sospensione cellulare a 1.375 volte g per un minuto.
Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un mezzo minimo più integratori per un volume finale di 100 microlitri. Per immagini eventi meiotici crescono cellule da colture di avviamento in mezzo minimo più integratori durante la notte. La crescita cellulare è considerata fase a log tardivo quando la densità ottica a 595 nanometri è compresa tra 0,7 e uno.
Successivamente, dalle colture a log tardivo ottengono 500 microlitri di ogni ceppo di tipo mate, H negativo e H positivo, e si combinano per fare una sospensione cellulare millilitro. Centrifugare le cellule a 1.375 volte g per un minuto. Rimuovere il supernatante e risospendare il pellet in un millilitro di estratto liquido di maltosio.
Ripetere il lavaggio dell'estratto di maltosio altre tre volte per garantire un'efficiente rimozione dei nutrienti. Dopo l'ultimo estratto di maltosio lavare risosopendare le cellule in un millilitro di estratto di maltosio e trasferire la miscela in un matraccio da 50 millilitri contenente nove millilitri di estratto di maltosio. Incubare per 12-16 ore a 22-25 gradi Celsius a una velocità di rotazione minima tra 50 e 100 giri/min.
La comparsa di molti grumi rotondi di lievito di fissione derivanti da abbondante auto-flocculazione indica un accoppiamento efficiente. Quindi, prendi un campione di un millilitro della coltura di accoppiamento e della centrifuga a 1.375 volte g per un minuto. Rimuovere 750 microlitri del supernatante e rimescolare le cellule nel supernatante rimanente.
Vortice vigorosamente per cinque secondi per interrompere i grumi. Erogare 20 microlitri di una sospensione cellulare mitotica o meiotica su un tampone di agarosio al 2%. Rimuovere qualsiasi mezzo in eccesso invertendo la diapositiva e mettendola sulla parte superiore del tovagliolo di carta privo di pelucchi per due o tre secondi.
Capovolgere lo scivolo e posizionare delicatamente un coverslip di vetro sulla parte superiore del pad, assicurandosi di non generare bolle d'aria. Per creare un monostrato di cella ruotare il coverslip in senso orario con l'indice per un giro completo per le cellule mitosi o due giri completi per le cellule di meiosi. Assicurarsi che la materia cellulare si disperdi attraverso il cuscinetto di agarosio consentendo una migliore separazione di singole cellule o asci.
Con l'aiuto di un piccolo bastoncino di legno erogare sigillante idrocarburi fuso lungo i bordi della coverslip per sigillare ogni tampone di agarosio. Una volta sigillato, il cuscinetto di agarosio lo posiziona sullo stadio del microscopio. Accendere la camera di temperatura e impostarla sulla temperatura desiderata.
Posizionare una piastra con un tovagliolo di carta bagnato nella camera per controllare l'umidità del sistema di microscopio. Lasciare equilibrare per 10-15 minuti alle condizioni di imaging appropriate. Ciò consente a tutte le bolle d'aria rimanenti di dissiparsi e di verificarsi qualsiasi cambiamento di agarosio dell'ultimo minuto.
Usa l'obiettivo 40X per trovare i campi di visualizzazione appropriati per l'immagine. Passare all'obiettivo 60X per iniziare l'acquisizione dei dati. Nel software che controlla la funzione del microscopio scegli i set di filtri al microscopio che meglio corrispondono ai fluorofori sotto osservazione.
Regolare le lunghezze d'onda di eccitazione in modo che corrispondano ai fluorofori utilizzati, utilizzare la potenza di eccitazione più bassa che produce un segnale coerente e utilizzare tempi di esposizione da quattro a otto ore per generare dati di imaging accettabili ma quantificabili e riproducibili. Raccogli almeno sei punti di tempo di acquisizione ogni ora. Nel software di raccolta delle immagini selezionare almeno un canale di fluorescenza da cui acquisire dati e utilizzare un materiale Z composto da 13 sezioni con spaziatura di 0,5 micrometri.
Nel software Fiji caricare un'immagine deconvolta selezionando la funzione Di importazione bio-formati nel menu dei plug-in. Nella finestra popup Opzioni importazione selezionare Hyperstack, Modalità colore predefinito, selezionare Scala automatica e premere il pulsante OK. Assicurarsi che la finestra visualizzata abbia il numero corretto di canali di fluorescenza e di frame di tempo scorrendo lateralmente sulle rispettive barre nella parte inferiore.
Salvare come file Tiff che non comprime i dati. Quindi, nel menu Analizza (Analyze), utilizzate l'opzione Imposta misure (Set Measurements) per scegliere parametri diversi. Ad esempio:Area, Valore grigio minimo minimo, Densità integrata, Valore grigio medio, Mediana, Posizione stack, Perimetro e Etichetta di visualizzazione.
Selezionate Colore (Color) e fate clic sullo strumento Canali (Channels Tool). Nella finestra popup Canali controllare il canale colore per il quale verrà misurata l'intensità o l'area. Selezionare Immagine, quindi Digitare e fare clic su 32 bit.
Selezionate le feature Regola (Adjust) e Soglia (Threshold) nel menu Immagine (Image). Selezionare la casella Sfondo scuro, selezionare il metodo Predefinito e selezionare Rosso per sovrapporre i segnali di interesse. Utilizzare lo strumento bacchetta per evidenziare ogni struttura di interesse e premere la lettera T sulla tastiera per aggiungere il ROI selezionato alla finestra di gestione del ROI popup.
Aprire quindi la cartella ROI compressa per caricare il gestore del ROI e fare clic su ogni identificatore ROI nel pannello laterale sinistro. Selezionate Misura (Measure) dal menu Analizza (Analyze) e ripetete questo comando su ogni identificatore roi per quantificare gli oggetti di interesse in tutte le sezioni dello stack di immagini. Salvare i risultati come file CSV per l'analisi statistica.
In questo studio se le cellule muoiono di fame a causa della limitazione dei nutrienti o della crescita eccessiva, mostreranno vacuoli in eccesso e una diminuzione delle dimensioni delle cellule. Le cellule logaritmiche mostrano la replicazione attiva del DNA e la divisione cellulare, così come l'espressione tos4-GFP pannucleare e la separazione dei focolai Sad1-DsRed. Il mancato accoppiamento, come nel caso in cui le cellule non siano sufficientemente affamate di azoto, impedirà loro di entrare nella meiosi.
Viene mostrata una coppia di cellule di fissione sottoposte a cariogamia. La robusta flocculazione della sospensione delle cellule di accoppiamento aumenta l'interazione tra cellule e quindi indica un accoppiamento riuscito e un'efficiente induzione meiotica. Gli asci zigotici prendono molteplici forme, tra cui le forme a zig-zag e a cellule di banana.
Nella mitosi come transizione cellulare dalla metafase alla telofasi, il primo cambiamento comporta una contrazione delle dimensioni nucleari nella metafase, mentre il secondo mostra il nucleo che si divide durante l'anafase. Oltre a condividere alcune dinamiche di segregazione con cellule mitotiche, le cellule meiotiche mostrano oscillazione nucleare durante la ricombinazione omologa e l'ulteriore riduzione dei nucleosidi alla fine dell'anafase II.It è responsabilità dei ricercatori garantire che i parametri dell'esperimento possano essere riprodotti attraverso gli esperimenti e che i dati raccolti siano adatti per l'analisi a valle. L'imaging a cellule vive ha permesso agli investigatori di esaminare in dettaglio la meccanica della divisione nucleare nella mitosi e nella meiosi.
Man mano che i tag fluorescenti e le capacità del microscopio migliorano il numero e il tipo di processi che possiamo osservare aumenteranno.
