Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute of Dental Research e craniofacciale.

Parte 1: Microscopio e Preparazione del Setup Imaging <ol><li> Qualsiasi microscopio confocale invertito dovrebbe essere adatto per IVM. In questo studio è stato usato un microscopio Olympus IX81 invertito, dotato di una unità di scansione laser confocale FluoView-1000. Per ottenere la migliore risoluzione possibile, si raccomanda l&#39;uso di obiettivi alti NA, come l&#39;acqua-immersion UPLSAPO 60x/1.20 NA, e l&#39;immersione olio Plan-Apo 60x/1.42 NA. Obiettivi ad immersione olio hanno efficienze di raccolta più elevati e anche se richiedono l&#39;uso di un coprioggetto tra il tessuto e l&#39;obiettivo, prevedono la migliore qualità dell&#39;immagine quando impiegati in aree dell&#39;immagine entro 15-20 micron dalla superficie. Inoltre, l&#39;uso di olio elimina la preoccupazione per l&#39;evaporazione dell&#39;acqua durante le sessioni di imaging più lunghi. Al fine di mantenere la temperatura e l&#39;umidità, il microscopio deve essere completamente chiusa e alimentato con aria calda e umidificata. In alternativa, l&#39;animale, la fase di microscopio, e laobiettivo deve essere riscaldato con altri mezzi. Ad esempio, pastiglie di calore chimica possono essere utilizzati per l&#39;animale e la fase, e riscaldatori oggettivi specificamente progettati possono essere utilizzati per l&#39;obiettivo (Figura 1A). Il riscaldatore obiettivo deve essere acceso 30 min prima di iniziare la procedura. Nota: quando le pastiglie di calore sono utilizzati per mantenere l&#39;animale caldo una garza deve posizionare tra il pad e la pelle. La pelle deve essere monitorato per le ustioni. </li><li> Le fasi standard nella maggior parte dei microscopi confocali disponibili in commercio hanno un&#39;apertura che è utilizzata per inserire diversi supporti che vengono utilizzati per adattarsi diapositive, capsule Petri e piastre di dimensioni diverse. Per eseguire IVM, un inserto standard stadio 35 mm piastre Petri è invertita capovolta, coperto con un vetrino 40 mm, che viene poi fissato con grasso alto vuoto silicone o nastro adesivo (Figura 1A). Un inserto personalizzato può anche essere fabbricato a partire da 3 millimetri piastra in alluminio di spessore. La superficie di vetro è poi cleaned con 70% etanolo e strisciato con un Kimwipe. </li><li> Fabbricazione un supporto personalizzato per l&#39;immobilizzazione SGS (stabilizzatore). Lo scopo del supporto è di stabilizzare SGS in atto e rigidamente loro coppia sul palco e il vetrino. Il supporto può essere costituito da una piastra di Petri 60 millimetri di plastica. In primo luogo, il fondo del piatto è rotto lontano dalle pareti e tagliato in rettangoli di circa 15 x 10 mm. Poi, i bordi sono arrotondati e lucidati utilizzando carta vetrata fine. Quattro distanziatori (1,5-2 mm) sono costruiti togliendo la punta in gomma di 1 ml stantuffi delle siringhe. Utilizzando carta vetrata fine, la superficie dei distanziatori ei quattro angoli del pezzo di plastica sono lucidate. I distanziali sono poi incollati mediante colla gelatinosa, e poi lisciato con carta vetrata fine su una superficie piana. Si noti, che per animali più vecchi, la dimensione dei supporti ed i distanziatori possono dover essere aumentato per tener ghiandole leggermente più grandi. </li><li> Preparazione del gel di accoppiamento ottico. 0,3% Carbomer-940 (Tabella 2) gel viene preparato mediante riscaldamento 100 ml di acqua ultra-pura e sciogliendo 5,47 g di D-sorbitolo. Poi, si aggiungono 0,3 g di Carbomer-940. Il bicchiere deve essere coperto e collocato su una piastra di agitazione (impostazione più caldo) per diverse ore o fino a quando tutti i grumi carbomer sono completamente sciolto. Infine, Trietanolamine viene aggiunto goccia a goccia agitando moderatamente, fino a raggiungere un pH di circa 7,4. Il gel viene conservato a 4 ° C 13. </li></ol> Parte 2: Animali ed Anestesia <ol><li> Prima di eseguire eventuali esperimenti con gli animali, i protocolli dovrebbero essere approvati dalla vostra cura degli animali e comitato etico locale. È importante sottolineare che i ricercatori dovrebbero essere adeguatamente formati per eseguire le procedure chirurgiche e dovrebbero consultare il proprio comitato di cura degli animali locale o istituto veterinario prima di procedere con la procedura. </li><li> In questo studio, un modello murino (GFP / mTomato-mouse) derivato dall&#39;incrocio topi FVB che esprimono GFP solubile (GFP-mouse) with topi C57B6 esprimono un peptide membrana mirati fusa con la proteina fluorescente tandem-pomodoro (mTomato-mouse) 6 è stato utilizzato. Nota: prende solitamente 20-30 minuti per l&#39;animale a diventare completamente anestetizzato e predisposto per l&#39;imaging </li><li> I topi sono alloggiati in un ambiente controllato nella struttura animale e possono acclimatare per una settimana prima dell&#39;esperimento. Questo passaggio è necessario per l&#39;imaging SGS dato alcun risultato soccorso in una maggiore attività secretoria 12. Acqua e cibo sono forniti ad libitum. I maschi di 2 -5 mesi verranno usati per esperimenti di imaging (20-30 g). </li><li> Prima dell&#39;anestesia, pesare gli animali per stabilire il corretto dosaggio di anestetico. </li><li> Poiché lo stress indotto dalla somministrazione di anestetici iniettabili può compromettere l&#39;attività secretoria della SGS, indurre pre-anestesia per inalazione isoflurano, seguito dall&#39;iniezione di anestetici. A tale scopo, posizionare i topi molto delicatamente nella camera di vaporizzazione, eattivare il flusso di ossigeno (800-900 mmHg). Impostare i livelli di isoflurano al 3% per iniziare l&#39;induzione pre-anestesia. </li><li> Una volta che gli animali sono inconscia, iniettare una miscela di 100 mg / kg di ketamina e 20 mg / kg xilazina nella cavità peritoneale (25 ago G). Anestetici sono preparati diluendo 100 mg / xilazina ml a 20 mg / ml in soluzione salina e poi mescolandolo con la ketamina. Questa miscela viene ulteriormente diluito 1:1 con soluzione salina e una quantità appropriata viene iniettata in base al peso animale. Questa diluizione aiuta a prevenire sovradosaggio accidentale. Si noti che la miscela perde la sua efficacia dopo 20 min. </li><li> Osservare gli animali per i segni di veglia e di iniettare la miscela più di anestetico se stanno venendo fuori di anestesia (circa il 75% della dose iniziale entro 45 minuti dopo la prima iniezione, e il 50% ogni ora successiva). Controllare la profondità dell&#39;anestesia ogni 15 min premendo la zampa e osservando la risposta. Nota: somministrare sempre pomata oftalmica per preveniresecchezza oculare. </li><li> Anestetici indurre ipotermia, che può condizionare la riproducibilità degli esperimenti e la salute dell&#39;animale. Pertanto, i topi devono essere tenuti sotto la lampada di calore o su un tappetino riscaldato per tutta la durata dell&#39;esperimento. Nota: la lampada di calore deve essere di almeno 12-18 centimetri dalla animale per prevenire la combustione </li><li> La temperatura corporea degli animali deve essere controllata con un termometro dotato di sonda temperatura rettale. </li></ol> Parte 3: Chirurgia animali e Posizionamento per intravitale Microscopia <ol><li> Preparare l&#39;area di lavoro con tutti gli strumenti chirurgici (Tabella 1) che dovrebbero essere pulito e sterile. </li><li> Radere la zona del collo del mouse con un tagliatore elettrico. Pulire la faccia ventrale del collo del mouse anestetizzato con una garza imbevuta di etanolo al 70%. Asciugare l&#39;eccesso con un Kimwipe. </li><li> Con pinzette ricurve sordo sollevare un piccolo pezzo di pelle sulla linea mediana (ravvicinavallo all&#39;estremità inferiore dei muscoli massetere), e fare una piccola incisione (Figura 1B). </li><li> Inserire le forbici nell&#39;apertura e separare la pelle dal tessuto sottostante aprendo le lame delle forbici. Evitare di danneggiare il tessuto ghiandolare sottostante indicando le forbici verso la parte inferiore della pelle. Ripetere questa operazione più volte fino a quando la pelle viene separato dai tessuti più profondi (Figura 1B). </li><li> Utilizzando le forbici, tagliare una striscia di pelle allentata di circa 3 mm e 10 mm di lunghezza. La pelle deve essere tagliato in modo che l&#39;apertura inizia vicino alla base del SGS dove il nervo, il condotto e vasi sanguigni collegano la ghiandola al resto del corpo. Dopo aver pulito la superficie della ferita, l&#39;apertura risultante sarà di forma ovale e misura circa 8 x 12 mm. Entrambi SG saranno visibili dopo l&#39;apertura (Figura 1B). </li><li> Con una siringa applicare il gel di accoppiamento ottico nel mezzo del taglio e pulirlo versol&#39;esterno con garza sterile. Pezzi puliti di garza devono essere utilizzati per ogni spazzolata per evitare l&#39;introduzione di capelli o sangue nel tessuto esposto. Ripetere questa operazione fino a quando tutti i capelli sciolti e il sangue viene rimosso. </li><li> Utilizzando # 7 pinzette, separare il tessuto connettivo dalla ghiandola sottomandibolare destra fino alla base della ghiandola (in alternativa questo protocollo può essere utilizzato su SGS sinistra). In primo luogo, trovare la punta del SG e afferrare il tessuto connettivo pochi millimetri sopra la punta della ghiandola. Strappare il tessuto connettivo intorno alla ghiandola senza ferire il parenchima. (Figura 1B). Una volta che la ghiandola è esposto, separare delicatamente il tessuto connettivo dalla ghiandola. Se si verifica sanguinamento, lavare via il sangue con soluzione fisiologica. Assicurarsi che tutti i tessuti connettivi vengono separati e la ghiandola è completamente esposti. Mantenere la ghiandola umido applicando gel accoppiamento ottico regolarmente. </li><li> Prima di portare l&#39;animale al microscopio, mettere un grosso pezzo di garza e heat imballare sul palco microscopio per mantenere una temperatura di 38 ± 2 ° C. La temperatura del pacco di calore chimica può essere regolata dalla dimensione dei tagli che espongono il sacchetto interno all&#39;atmosfera. Garza fornisce alcune isolamento del pacco di calore dalla fase metallica. Coprire la parte superiore del pacco di calore con un pezzo sottile di garza pure. </li><li> Posto l&#39;animale sul lato (lato destro per la ghiandola destra) e sulla garza. Posizionare l&#39;animale con la ghiandola salivare sottomandibolare posta al centro del vetrino (Figura 1C). </li><li> L&#39;animale deve essere fissato e stabilizzato in questa posizione prima immobilizzare ghiandola. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sul lato ventrale della zampa anteriore destro del mouse. Agganciare gli incisivi del mouse da una sutura di seta (Figura 1C, nel riquadro). Creare qualche tensione tra il filo di seta e la zampa e fissarle sul palco da nastro adesivo. Il SG deve essere appoggiato naturalmente nel mezzo dellacoprioggetto. La testa e il torace devono essere ulteriormente stabilizzata da cunei di plastica che possono essere accoppiati alla fase. </li><li> Mettere un piccolo pezzo di pulizia dell&#39;obiettivo tessuto sopra la ghiandola (Figura 1C). Estendere la ghiandola leggermente e inserire un supporto personalizzato sulla ghiandola. Strettamente coppia lo stabilizzatore sul palco con nastro adesivo. Accoppiamento può essere migliorata con una fascetta metallica collegata alla fase (Figura 1C). Angoli tensione e taglienti dovrebbero essere evitati in quanto possono compromettere il flusso di sangue. Subito dopo la stabilizzazione controllare il flusso di sangue sia esaminando visivamente ghiandola (dovrebbe mantenere colorazione rosa) o da epifluorescenza. Nel topo GFP / m-pomodoro, alterazioni lordo del flusso sanguigno può essere facilmente valutati dal momento che entrambi i vasi sanguigni e molte delle cellule del sangue sono etichettati con il m-pomodoro. </li><li> Coprire l&#39;animale con una garza e un pad riscaldato. Misurare la temperatura della ghiandola esposto usando un termometro attrezzata won una piccola sonda a termocoppia flessibile posto a contatto con un lato della ghiandola esposta. </li></ol> Parte 4: parametri di imaging <ol><li> Uso epifluorescenza illuminazione fuoco sulla superficie della ghiandola sia usando il GFP o il set di filtri RFP. Trova superficie della SG, e valutare il flusso di sangue nei capillari e la morfologia complessiva del tessuto. Segni di danno tissutale includono membrana blebbing o la comparsa di grandi vacuoli. </li><li> Valutare la stabilità del tessuto sia tramite epifluorescenza o pre-scansione dell&#39;area selezionata. Una preparazione stabile è essenziale, dal momento che la maggior parte degli artefatti da movimento non possano essere rimossi o corretti per l&#39;analisi dei dati di post-elaborazione. Se la preparazione non è stabile, sono necessari aggiustamenti. </li><li> Per trovare l&#39;immagine piano focale adeguata le ghiandole in modalità pre-scansione (1X zoom), e spostare progressivamente l&#39;obiettivo verso il vetrino fino a quando le strutture acinose, i granuli di secreto e il pmembrana Lasma diventa chiaramente visibile (Figura 2). </li><li> I parametri di imaging per il time-lapse dipendono dal singolo esperimento. All&#39;immagine della dinamica dei granuli secretori utilizzano una velocità di scansione di 0,5-2 sec / frame e 256 x 256 pixel con una scala spaziale 0,2 micron / pixel (campo visivo di circa 50 um x 50 um). Per la visualizzazione ottimale dei granuli e la membrana plasmatica, lo spessore ottico va posizionato tra 0,9-1,2 micron. Per eccitare la GFP e la tandem-pomodoro, si può utilizzare una lunghezza d&#39;onda di 488 nm e 561 nm, rispettivamente. La potenza di picco è impostato circa 0,5 mW per la 488 nm e 1 mW per il 561 nm. Questo assicura photobleaching minimo. </li><li> Le impostazioni del rivelatore devono essere regolati per mantenere il segnale entro la gamma dinamica e dipende dalla luminosità del campione. </li><li> Una volta che tutti i parametri sono impostati, imaging può essere avviato. In primo luogo, prendere un&#39;istantanea del campo di vista per essere utilizzato come punto di riferimento. Mentreimaging time lapse, può verificarsi deriva del tessuto in XY e Z. Questo può essere compensato manualmente regolando l&#39;area di scansione e la posizione Z. Gli adeguamenti devono essere effettuati gradualmente e da piccoli incrementi per evitare artefatti. Inoltre, l&#39;immagine di riferimento può essere utilizzato per determinare se si verifica fotoscolorimento. Se significativo fotoscolorimento viene rilevato (riduzione maggiore del 15-20% in fluorescenza), ridurre la potenza del laser di 0,1 mW. </li><li> Per stimolare esocitosi, un&#39;iniezione sottocutanea di 0,1 mg / kg di una soluzione preparata di isoproterenolo in soluzione salina. Esocitosi viene attivato circa 1 minuto dopo l&#39;iniezione. Granuli secretori di fusione con la membrana plasmatica saranno rilevati da un aumento di fluorescenza GFP attorno ai granuli e la diffusione dei peptidi tandem-pomodoro nelle loro membrane limitanti (Figura 3). Si consiglia di acquisire 3-4 sequenze time-lapse nella stessa zona, 10 min ciascuno. </li><li> Dopo la sessione di imaging, eutanasia l&#39;anesthetized animale da CO 2 inalazione in una camera di eutanasia (10-12 mmHg per 10 min). </li></ol>

<ol>
	<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists.">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li></ol>

Finora strutture cellulari sono stati in gran parte ripreso in vitro (cioè colture cellulari) o ex vivo (cioè organo-culture, fette di tessuto, preparazioni acinose) sistemi modello che spesso non ricapitolano le caratteristiche del intatti tessuti vivi 6. A tale riguardo, l&#39;approccio qui presentato rappresenta un importante passo avanti in quanto consente imaging delle dinamiche di una determinata tratta passo membrana (esocitosi cioè regolata) in topi vivente. <p class=...

Negli ultimi due decenni, l&#39;avvento della microscopia diretta e l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti hanno portato a importanti progressi in ogni processo cellulare immaginabile, facendo progredire la nostra comprensione della biologia cellulare 1. Questo campo ha beneficiato enormemente dall&#39;utilizzo di colture di cellule di mammiferi che sono estremamente potenti sistemi modello, in particolare quando si tratta di manipolazioni sperimentali. Tuttavia, essi spesso non forniscono una rappresentazione fedele della biologia dei complessi organismi pluricellulari 2. Questo problema ha cominciato ad essere affrontati con lo sviluppo della microscopia intravitale (IVM), che ha aperto la porta ad indagare principali questioni biologiche in campi quali la neurobiologia, immunologia e biologia del tumore 3. Finora, la maggior parte degli studi basati su IVM sono state eseguite a livello dei tessuti e cellule individuali, senza fornire alcuna informazione circa la dinamica dei compartimenti subcellulari. Recentemente, il nostro laboratorio e altris hanno sviluppato tecniche di IVM capaci di immagini strutture subcellulari nei roditori vivi 4-7, 13-15 e permettendo manipolazioni farmacologiche e genetiche in vivo. Questo approccio è stato utilizzato da noi per studiare il traffico di membrana in vivo, e più specificamente endocitosi e esocitosi regolata 6,7. Il nostro sistema modello sperimentale si basa sull&#39;esposizione, la stabilizzazione e l&#39;imaging delle ghiandole salivari sottomandibolare (SGS) di roditori anestetizzati. La scelta del SGs come modello organo per IVM è dovuto al fatto che le ghiandole sono facilmente accessibili eseguendo una chirurgia minore, può essere esteriorizzato senza compromettere la loro fisiologia, e stabilizzato per ridurre gli artefatti da movimento dovuti il ​​battito cardiaco e la respirazione. Inoltre, SGS è selettivamente manipolato geneticamente iniettando vettori basati sia virali o non virali attraverso il condotto salivare 8,9. Infine, SGS sono ghiandole esocrine composte epith polarizzataElial cellule, che formano acini e dotti, cellule mioepiteliali, e conta complesso di cellule stromali. Per questa ragione, sono un ottimo modello per studiare esocitosi, endocitosi, la consegna del gene, e citoscheletro di actina, come evidenziato nei nostri recenti studi 10, e di offrire l&#39;opportunità di studiare aspetti della biologia cellulare come polarità cellulare, divisione cellulare, cellula- giunzioni cellulari e canali ionici. In questo lavoro descriviamo in dettaglio un protocollo di imaging per il raggiungimento di risoluzione subcellulare nell&#39;epitelio delle SG di un topo vivo. In particolare, mostriamo come immagine granuli di secrezione nelle cellule acinose del SG durante esocitosi regolata. Come precedentemente indicato, dopo stimolazione con agonisti del recettore beta-adrenergico, granuli secretori fondono con la membrana plasmatica apicale e gradualmente collassano, rilasciando il loro contenuto nel canalicoli acinose 6. Il nostro obiettivo è quello di fornire gli strumenti di base per gli investigatori con mesperienza inimal nelle procedure chirurgiche e di trattamento degli animali, in modo da poter eseguire con successo IVM ad una risoluzione subcellulare. Poiché la parte più impegnativa in IVM è la preparazione dell&#39;animale, qui ci concentriamo sulla descrizione delle procedure chirurgiche di base che sono utilizzati per esporre e immobilizzare SGS senza compromettere la loro funzione. Per quanto riguarda le procedure di etichettare strutture subcellulari, diverse strategie, come la distribuzione sistemica di sonde fluorescenti, impiego di animali transgenici, o una combinazione di entrambi, sono state descritte altrove 7,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

Qui si descrive un procedimento per immagine strutture subcellulari nei roditori vivi che si basa sull&#39;utilizzo di microscopia confocale intravitale. Come modello organo, usiamo le ghiandole salivari di topi vivi quanto forniscono diversi vantaggi. Primo, possono essere facilmente esposti per consentire l&#39;accesso alle ottiche, e stabilizzato per facilitare la riduzione degli artefatti da movimento dovuti il ​​battito cardiaco e la respirazione. Questo facilita notevolmente l&#39;imaging e il monitoraggio di piccole strutture subcellulari. In secondo luogo, la maggior parte delle popolazioni cellulari delle ghiandole salivari sono accessibili dalla superficie dell&#39;organo. Questo permette l&#39;utilizzo di microscopia confocale che ha una risoluzione spaziale di altre tecniche che sono state utilizzate per l&#39;imaging in vivo, come la microscopia a due fotoni. Infine, ghiandole salivari possono essere facilmente manipolati geneticamente e farmacologicamente, fornendo così un sistema robusto per studiare processi biologici a livello molecolare. In questo studio ci concentriamo su un protocollo progettato per seguire la cinetica di esocitosi di granuli secretori in cellule acinose e la dinamica della membrana plasmatica apicale in cui i granuli secretori fusibile a stimolazione dei recettori beta-adrenergici. In particolare, abbiamo utilizzato un topo transgenico che co-esprime citosolica GFP e un peptide membrana mirata fusa con la proteina fluorescente tandem-pomodoro. Tuttavia, le procedure che abbiamo usato per stabilizzare e l&#39;immagine delle ghiandole salivari può essere esteso ad altri modelli del mouse e accoppiati ad altri approcci per etichettare componenti cellulari in vivo, permettendo la visualizzazione di varie strutture subcellulari, come endosomi, lisosomi, mitocondri, e il citoscheletro di actina.

Nel topo GFP / mTomato, gli acini appaiono come strutture ben distinte, che esprimono GFP citosolica e di membrana mirati tandem-pomodoro peptide (Figura 2, linea tratteggiata). In acini individuo, le cellule acinose sono delineati dal peptide tandem-pomodoro. GFP è rilevata anche nei nuclei che sono chiaramente visibili all&#39;interno delle cellule acinose (Figura 2, frecce). GFP citosolico viene escluso dai granuli di secreto che appaiono vescicole circolari scure di circa 1-1.5 mic...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins at JoVE.com

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

La microscopia intravitale è un potente strumento che permette l&#39;imaging vari processi biologici di animali vivi. In questo articolo, presentiamo un metodo dettagliato per l&#39;imaging la dinamica di strutture subcellulari, come granuli secretori, nelle ghiandole salivari di topi vivi.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

intravital-microscopy-for-imaging-subcellular-structures-live-mice

Research

JoVE Journal

Biology

23.5K Views.  National Institutes of Health.  La microscopia intravitale è un potente strumento che permette l'imaging vari processi biologici di animali vivi. In questo articolo, presentiamo un metodo dettagliato per l'imaging la dinamica di strutture subcellulari, come granuli secretori, nelle ghiandole salivari di topi vivi. 

Video: Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Ricerca

Biologia

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Fotoconversione di proteine ​​purificate fluorescenti ed evidenziazione ottica dual-sonda in cellule vive

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recupero di fluorescenza dopo Photobleaching di giallo fluorescente proteine Tagged p62 in Aggresome-come le strutture indotta

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine fluorescenti