Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 HG002995 &quot;coltivare la Zebrafish Genoma: un approccio Reverse Genetics&quot; per CBM.

Parte A: Soluzioni di congelamento dello sperma 1. Ginsberg Pesce Ringers (Fai fresco ogni 3 giorni; Ginsburg, 1963) NOTA: ORDINE DI OLTRE è importante per evitare PRECIPITAZIONE In 450 ml sterile ddH2O sciogliere: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Poi aggiungere: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Portare il volume finale a 500 ml con ddH2O sterile e conservare a 4 ° C. 2. Media congelamento (Fai fresca al giorno) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> SENZA Metanolo <ul><li> Pesce Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente). </li><li> Latte scremato in polvere 1,5 gr </li></ul></li><li> Con metanolo NOTA: ORDINE DI OLTRE è importante per evitare PRECIPITAZIONE <ul><li> Pesce Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente). </li><li> 1 ml di metanolo </li><li> Latte scremato in polvere 1,5 g </li></ul> Dopo il montaggio dei media congelamento, mescolate bene per 20 minuti. su agitatore orbitale o bilancieri. Prima di utilizzare, in aliquote da 1 ml provette Eppendorf, evitando le bolle di superficie. </li></ol> Parte B: Materiale necessario per il congelamento degli spermatozoi Materiali necessari per il congelamento degli spermatozoi <ol><li> 10 pipette monouso microlitri (cat Fisherbrand # 22-358697) </li><li> Bicchieri da 250 ml per i pesci di acqua contenente MESAB / Tricaine </li><li> orologi occhiali (Pyrex cat # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (o equivalente) e suggerimenti </li><li> Spugna titolare pesce (di sesso maschile, mentre a tenere spremitura) </li><li> Dissezione microscopio con illuminazione stadio sopra </li><li> Forcipe piatto (ad esempio di tipo Millipore) </li><li> 2,0 ml fiale criogenico (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 cryoboxes (Nalgene cat # 03-337-7AA) </li><li> Contenitore di polistirolo pieno di ~ 15 cm finemente triturato secco ice1 </li><li> 15 ml coniche tubi (Falcon # 352099) </li><li> Dewar pallone contenente azoto liquido </li><li> Pinze lunghe (ad esempio CMS Fisher gatto Health Care # 10-316b) </li><li> Cryogloves </li><li> Serbatoio di recupero per i maschi </li><li> Un tubo eppendorf riempito con i media congelamento senza metanolo </li><li> Un tubo eppendorf riempito con i media di congelamento con metanolo </li><li> Cryofreezer (ad esempio Taylor-Warton serie K) </li></ol> 1 Un metodo semplice per fare finemente triturato ghiaccio secco è quello di avvolgerla in un asciugamano e polverizzare con un martello. Un metodo più efficiente è quello di utilizzare una smerigliatrice di ghiaccio secco, ad esempio, il modello Clawson RE-2. Parte C: metodo di congelamento dello sperma <ol><li> MARK TUBI CAPILLARI: Prima di iniziare, contrassegnare i tubi capillari 10μl con una penna di laboratorio a livello di 3,33 microlitri (cioè 16,7 millimetri dal fondo; vedi Fig. 1.1.). </li><li> Anestetizzare MASCHILE: maschio Luogo (s) in un bicchiere contenente MESAB / tricaine diluito in acqua pesce (ricetta in &quot;Il libro Zebrafish&quot;) </li><li> SECCO DI PESCE: Una volta anestetizzato, ascensore pesce fuor d&#39;anestetico con un cucchiaio di plastica e con delicatezza macchia pesce secco su un tovagliolo di carta, con particolare attenzione per asciugare il lato ventrale. Acqua attiva sperma quindi è importante asciugare completamente intorno alla cloaca. Pesce posizione sul supporto spugna, in crescita del lato ventrale (fig. 1.2). Se la regione attorno a pinna anale è ancora umida, leggermente asciutto con kimwipe. Fare attenzione a non spremere sperma prematuramente! </li><li> Luogo segnato capillare in bocca adattatore pipetta in gomma che è incluso con tubi capillari. L&#39;adattatore è un tubo di gomma che ha un boccaglio da un lato e un supporto capillare dall&#39;altro. In alternativa, il capillare può essere collegato ad una siringa Hamilton 50μl attraverso un breve pezzo di tubo Tygon del diametro adeguato. </li><li> Maschio luogo nell&#39;ambito di applicazione ed esporre l&#39;apertura urogenitale con attenzione la diffusione della pinne pelviche a parte utilizzando le estremità del tubo capillare. </li><li> RACCOLTA SPERMA: Espellere sperma accarezzando delicatamente ai lati del pesce con una pinza liscia (ad esempio Millipore), oppure premendo delicatamente ai lati del pesce tra il dito indice e il pollice. Raccogliere lo sperma in tubo capillare in quanto viene espulso tramite aspirazione delicata (fig. 1.2). Evitare di feci che può essere espulso con lo sperma. </li><li> NORMALIZE VOLUME SPERMA A microlitri 3.3: Se il volume di sperma raggiunge o supera il marchio penna sul tubo capillare (cioè 16,7 millimetri o superiore), poi passare al punto 8. Se il volume di sperma non raggiunge volume di destinazione, poi normalizzare il volume a segnare con la penna Media congelare senza metanolo (fig. 1.3). Quantità minima di spermatozoi che sia accettabile varia con la qualità degli spermatozoi. Spermatozoi buoni è bianco e opaco. Spermatozoi poveri sembra acquoso. In generale, accettiamo come minimi: 1 microlitri spermatozoi buoni (o 1 / 3 di destinazione) e 2 spermatozoi microlitri poveri (o 2 / 3 di destinazione). Il volume è ormai normalizzata a 3,3 microlitri. </li><li> AGGIUNGI crioprotettore A SPERMA: Suck up medio di congelamento CON Metanolo al marchio arancione (circa il volume totale è ora di 20 l;. Fig. 1.4). Espellere miscela sperma e crioprotettore sulla zona pulita di un vetro da orologio, prestando particolare attenzione a non introdurre bolle. Mescolare delicatamente pipettando su e giù ~ 4 volte (evitare l&#39;introduzione di bolle). </li><li> LUOGO 10μl SPERMA IN OGNI DI 2 CRYOVIALS: Pipettare 10 ml di sperma: soluzione crioprotettore nella parte inferiore di due cryovials separati che sono stati etichettati con le informazioni rilevanti (Fig. 1.5). Muoversi rapidamente, fiale cappuccio e rilasciarli nella parte inferiore della temperatura ambiente 15 ml Falcon tubi-uno provetta Microbank ™ / tubo. Cap Falcon tubo ed inserire la coppia di provetta Microbank ™ contenenti tubi Falcon schiacciato in ghiaccio secco. </li><li> FERMO DI SPERMA PER 20 MIN. In ghiaccio secco: Il ghiaccio secco deve essere sotto forma di polvere fine, non pellet. I tubi deve essere inserito il ghiaccio secco abbastanza profondo che solo i loro berretti show (fig. 1.6). Al fine di tenere traccia di tubi in ghiaccio secco, dare ad ogni coppia di tubi Falcon un numero da 1-20 (scritto sul caps) e registrare il tempo vanno in ghiaccio secco. </li><li> CRYOVIALS LUOGO IN AZOTO LIQUIDO:. Dopo lo sperma è stato congelato in ghiaccio secco per 20 minuti, trasferirli ad un liquido contenente azoto vaso Dewar. Spermatozoi viene memorizzato qui fino al momento di mettere in freezer azoto liquido. Quando si posizionano nelle caselle congelatore, congelatore box posto in un bagno di azoto liquido in modo che i campioni non riscaldano. Utilizzare pinze di metallo lungo per recuperare fiale da vaso Dewar e maneggiare con cryogloves. In alternativa, cryovials possono essere trasferiti direttamente dal ghiaccio secco nella casella congelatore se la casella congelatore è tenuta immersa in azoto liquido in un contenitore di polistirolo. </li><li> Cryovials memorizzare a lungo termine in un congelatore criogenico di azoto liquido. Per mantenere la vitalità degli spermatozoi, è importante che i flaconcini sono conservati immersi in azoto liquido. Nella nostra esperienza, fiale memorizzato nella fase vapore perdono vitalità nel tempo. La velocità è importante! Il tempo tra l&#39;aggiunta del crioprotettore e l&#39;immissione fiale di sperma in ghiaccio secco (cioè passi 6-10) dovrebbe essere non più di 30 sec. </li></ol> Parte D: metodo di fecondazione in vitro con lo sperma crioconservati Troviamo che questo funziona meglio con due persone. Una persona spreme le uova da femmine, mentre l&#39;altra persona si scioglie lo sperma. <ol><li> Impostare un bagno d&#39;acqua a 33 ° C. </li><li> Togliere dal freezer provetta Microbank ™ azoto liquido e il trasferimento di liquidi contenenti azoto vaso Dewar fino al momento di disgelo. </li><li> Spremere le uova dalle femmine in 35 millimetri piatto di plastica di Petri. Se possibile, cerca di ottenere 3 grinfie di uova e si combinano in un piatto. Se non è possibile ottenere tre frizioni buon entro 1 minuto della vostra prima frizione, poi passare al punto 4 (una frizione buona è sufficiente). Definizione di una buona frizione:&gt; 150 uova in modo uniforme carina (cioè giallastro, senza residui bianchi indicativo del degrado). Tenere piatto coperto mentre lo sperma è stato scongelato. </li><li> Rimuovere fiala da azoto liquido e rimuovere il tappo. Fiala rapidamente immergere ~ 1 / 2 strada nel bagno d&#39;acqua a 33 ° C per 8-10 secondi. </li><li> Aggiungere rapidamente 70 microlitri temperatura ambiente Hanks a fiala e mescolare pipettando su e giù. Aggiungere immediatamente alle uova e mescolare delicatamente con la punta della pipetta. </li><li> Senza indugio, attivare lo sperma e le uova con l&#39;aggiunta di acqua 750 microlitri di pesce. Mescolare. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 5 minuti, riempire con acqua piatto di pesce e piatti incubare a 28 ° C. Dopo 2-3 ore, il conteggio e il trasferimento degli embrioni fertili ai piatti 100mm (50/dish). Conte uova sterili in modo che la frequenza fecondazione può essere determinato. </li><li> Abbiate cura delle larve! Per i primi 5 giorni, cambiare l&#39;acqua ogni giorno ed eliminare embrioni morti. Mettete solo le larve che hanno vesciche natatorie in vivaio il giorno 5. </li></ol> Parte E: Risultati Rappresentante Abbiamo utilizzato questa metodologia crypreservation per fare una libreria di 8600 campioni di sperma congelato per TILLING tra gli anni 2001 e 2003. Abbiamo scongelati 106 di questi campioni e determinato la loro fertilità. La fertilità è il rapporto degli embrioni vitali prodotto in fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova che sono stati fecondati con lo sperma congelato. Fresco (non cryporeserved) di solito ha la fertilità dello sperma&gt; 95%; spermatozoi crioconservati ha fertilità molto più basso: una media del 29% (n = 106 fiale). Il flaconcino a fiala variabilità della fertilità è di grandi dimensioni, che vanno da meno dell&#39;1% a un massimo del 62%. Questa variabilità è rappresentato dal grande barre di errore rappresentano la deviazione standard in fig. 2. Tuttavia in 106 campioni di sperma scongelato fino ad oggi abbiamo solo una volta sperimentato 0% la fertilità in entrambi i campioni di sperma e non è riuscito a recuperare la mutazione corrispondente TILLING. Con lo scongelamento fiale di sperma dalla nostra biblioteca, nel corso di diversi anni (2001-2008) abbiamo trovato che la fertilità media dei campioni di sperma congelato da questo metodo rimanestabile nel tempo (Fig. 2). La fertilità media dei campioni di sperma congelato scongelati nel 2001 è stato del 23,5% (basato su 11 campioni di sperma) e nel 2008 era del 25% (sulla base di 21 campioni di sperma). Un certo numero di altri ricercatori stanno utilizzando questo protocollo di congelamento degli spermatozoi nei loro laboratori. Alcuni hanno riportato un buon successo con tassi di fertilità e il campione a campione variabilità simile a quello che abbiamo osservato. Altri hanno riferito non è riuscito a rendere questo protocollo di lavoro nelle loro mani. Crediamo che probabili fonti di problemi sono: <ol><li> Il mancato utilizzo della cryovials esatta o tubi conici abbiamo suggerito nel protocollo, porta a un diverso tasso di raffreddamento quando in ghiaccio secco; </li><li> Il mancato uso di polvere di ghiaccio secco, portando ad una sub-ottimale velocità di raffreddamento; </li><li> Utilizzando pesci di sesso maschile con scarsa fertilità: si dovrebbe ottenere almeno 1 ml di sperma da un singolo maschio. È inoltre possibile verificare la fertilità maschile facendo una fecondazione in vitro con lo sperma fresco, tuttavia questo può essere fuorviante, perché ci vuole molto poco sperma fresco per arrivare vicino al 100% la fertilità. </li><li> Utilizzando sub-standard uova di qualità nella fecondazione in vitro. Utilizzando tutt&#39;altro che perfetto frizioni porta sempre al vicino allo 0% la fertilità, anche da campioni di sperma che in realtà hanno una buona fertilità (in base alla fertilità del flaconcino duplicato). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schematica della metodologia di congelamento dello sperma. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fertilità dello sperma crioconservati rimane stabile nel tempo. Fertilità per cento è il numero di embrioni vitali prodotto in fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova che sono stati fecondati con lo sperma congelato. &quot;N&quot; si riferisce al numero di flaconcini spermatozoi crioconservati cui fertilità è stato testato nel corso dell&#39;anno corrispondente. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Dal momento che ogni fiala di sperma è diverso da un maschio, fiala a fiala variabilità si osserva.

<ol>
	<li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes.">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li><li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol.">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li></ol>

Un certo numero di altri ricercatori stanno utilizzando questo protocollo di congelamento degli spermatozoi nei loro laboratori. Alcuni hanno riferito di fertilità simili e lo stesso campione a campione variabilità che abbiamo osservato. Altri hanno riferito non è riuscito a rendere questo protocollo di lavoro nelle loro mani. Crediamo che probabili fonti di problemi sono: <ol><li> Il mancato utilizzo della cryovials esatta o tubi conici abbiamo suggerito nel protocollo, porta a un diverso tasso di raffreddamento quando in ghiaccio secco; </li><li> Il mancato uso di polvere di ghiaccio secco, portando ad una sub-ottimale velocità di raffreddamento; </li><li> Utilizzando pesci di sesso maschile con scarsa fertilità: si dovrebbe ottenere almeno 1 ml di sperma da un singolo maschio. È inoltre possibile verificare la fertilità maschile facendo una fecondazione in vitro con lo sperma fresco, tuttavia questo può essere fuorviante, perché ci vuole molto poco sperma fresco per arrivare vicino al 100% la fertilità. Più grandi, i maschi più robusta di colore tipicamente dare di più spermatozoi di qualità superiore. </li><li> Utilizzando sub-standard uova di qualità nella fecondazione in vitro. Utilizzando tutt&#39;altro che perfetto frizioni porta sempre al vicino allo 0% la fertilità, anche da campioni di sperma che in realtà hanno una buona fertilità (in base alla fertilità del flaconcino duplicato). </li></ol>

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		<tr>
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		<th>Catalogue Number</th>
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<tr>
<td>10 &mu;l disposable pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-358697</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watch glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pyrex</td>
<td>9985-75</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430488</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 x 10 cryoboxes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>03-337-7AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tongs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Health Care</td>
<td>10-316B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryofreezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taylor-Warton</td>
<td>K-series</td>
<td>For example</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization

Questo è un metodo per la crioconservazione degli spermatozoi zebrafish che è un adattamento del metodo di Harvey (Harvey et al., 1982). Abbiamo introdotto due modifiche al protocollo originale che sia snellire la procedura e il campione uniformità aumentare. Per prima cosa, normalizzare tutti i volumi degli spermatozoi utilizzando supporti di congelamento che non contiene il crioprotettore. In secondo luogo, gli spermatozoi crioconservati sono memorizzati in cryovials invece di tubi capillari. I tassi di sperma congelamento e scongelamento (δ ° C / ora) sono probabilmente le due variabili più critiche per il controllo di questa procedura. Per questo motivo, non sostituire i tubi diversi per quelli specificati. Lavorare in team di 2, è possibile congelare lo sperma di 100 uomini per ogni squadra in circa 2 ore. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media di 25% la fertilità (misurata come il numero di embrioni vitali generati in una fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova fecondate) e questo fertilità per cento è stabile per molti anni.

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A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

30.8K Views.  University of California, Davis. Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Ricerca

Biologia

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...