Questo protocollo descrive un metodo per lo screening rapido di migliaia di genomi utilizzando lo sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR. Questa tecnica è vantaggiosa nella sua accessibilità. Piuttosto che costosi approcci specializzati basati sul sequenziamento, il nostro metodo utilizza enzimi di restrizione PCR ed elettroforesi su gel per lo screening dei portatori maschi F0 per indels o modifiche specifiche del genoma.
La parte più difficile di questa procedura è solo ottenere rapidamente lo sperma, ma diventa una buona tecnica per la fecondazione in vitro se lavoriamo con molti pesci dismorfici, e quindi è un modo semplice per noi di incrociare i pesci che ci stanno dando problemi. Inizia allestendo vasche di riproduzione sia per il tipo selvatico che per i pesci F0 e incubare le vasche durante la notte. Dopo aver anestetizzato il pesce maschio il giorno successivo, utilizzare un mestolo forato per trasferirlo su una pila di asciugamani di carta pulita.
Rotolare delicatamente il pesce per rimuovere l'acqua in eccesso. Rimuovere l'acqua asciugandola con un fazzoletto piegato pulito. Usando il mestolo forato, trasferire il pesce nella spugna preparata.
Posizionare il pesce con il lato ventrale verso l'alto e asciugare delicatamente l'area intorno alle pinne anali con una carta velina piegata pulita. Per raccogliere lo sperma, utilizzare un tubo capillare per spostare delicatamente le pinne pelviche lontano dalla linea mediana, esponendo la cloaca. Posizionare il tubo capillare vicino alla cloaca.
Con le dita o un paio di pinze da filtro, spremere delicatamente i lati del pesce dalle branchie verso il basso. Utilizzando l'azione capillare, raccogliere lo sperma nel tubo e metterlo in una provetta PCR contenente 40 microlitri di soluzione di idrossido di sodio 50 millimolare, quindi espellere il campione nella provetta. Dopo aver fatto girare i campioni di sperma in una mini centrifuga, posizionare i tubi PCR in un termociclatore.
Far funzionare il ciclatore riscaldando i campioni per 40 minuti a 95 gradi Celsius seguito da raffreddamento a 25 gradi Celsius. Dopo aver rimosso i campioni dal ciclatore, neutralizzare il pH aggiungendo 10 microlitri di un molare tris cloridrato di pH otto. Mescolare aspirando la sospensione e quindi centrifugare i campioni.
Impostare il termociclatore a 95 gradi Celsius per il preriscaldamento. E nel frattempo, preparare 25 microlitri della miscela di reazione PCR per ogni campione di sperma. Mescolare bene pipettando su e giù, quindi girare i campioni.
Posizionare i campioni nel termociclatore preriscaldato e impostare il ciclo. Per ottenere una soluzione di gel, microonde una soluzione di gel di agarosio al 4% preparata mescolando polvere di agarosio, colorazione di gel e tampone TBE. Versare la soluzione di gel in un telaio di fusione in gel e inserire un pettine su un lato.
Dopo la solidificazione del gel, rimuovere con cura il pettine. Posizionare il gel in un impianto di elettroforesi in modo tale che i pozzetti siano più vicini all'elettrodo negativo. Versare il buffer di funzionamento TBE nel carro fino a quando i pozzi non sono completamente sommersi.
Inizia a caricare il gel pipettando cinque microlitri di scala del DNA nel primo pozzetto. Caricare i pozzetti rimanenti con 5-10 microlitri di prodotto PCR. Far funzionare il gel per 1 ora a 150 volt per garantire un'adeguata separazione degli ampliconi.
Utilizzare l'imager gel per visualizzare le bande del DNA. L'analisi del locus p2ry12 ha mostrato che l'amplicone wild-type mostrava una singola banda di 250 coppie di basi mentre gli ampliconi maschi iniettati con F0 contenenti indels funzionavano come bande multiple. L'analisi del locus DNA10 ha mostrato che l'amplicone wild-type funziona come una singola banda lunga di 400 coppie di basi.
Gli ampliconi maschili iniettati con F0 contenenti indels funzionavano come bande multiple o come una singola banda con ridotta mobilità del gel. Il maschio iniettato con F0 numero uno aveva una banda aggiuntiva nel prodotto digerito, che era assente nel prodotto PCR, rendendolo il miglior candidato fondatore per la creazione di linee knock-in mutanti. Se un pesce maschio non produce spermatozoi quando viene spremuto, è meglio riposare il pesce per una settimana e riprovare invece di schiacciarli troppo forte e rischiare di ferirli.
Una volta che il fondatore FC o maschio è outcross, gli alleli devono essere verificati in sequenza nella progenie F1. Sequenziare direttamente gli ampliconi F1 ed eseguire l'analisi degli alleli eterozigoti è un modo semplice per farlo.
