1. Manutenzione: Culture osservare al microscopio <ol><li> Rimuovere una piastra di cellule hES dal 37 ° C incubatore e portare al microscopio. </li><li> Osservare le colonie a bassa potenza, con ingrandimento 2X o 5X, per valutare la qualità complessiva della cultura. Tenere presente quanto segue: colore normale media, assenza di contaminazione visibile, la dimensione complessiva colonia, qualità e densità, e altre osservazioni. </li><li> Osservare i cambiamenti di colore medio. A causa del cambiamento del pH e l&#39;esaurimento dei nutrienti nel terreno dopo una notte di incubazione con le cellule HES, la media cambierà da un colore rosso ad un colore &quot;paglia&quot;. Se il mezzo sembra viola, una variazione del pH di base si è verificato. Se il mezzo appare estremamente giallo, il mezzo si è acidificato. Mezzo molto giallo può essere il risultato di colonie di estremo sovraffollamento nel pozzo o di contaminazione. Il mezzo deve apparire chiaro in ogni momento. Anche se un certo livello di detriti cellulari nel mezzo è normale, non dovrebbe mai apparire nuvoloso. Se un alto livello di detriti cellulari si osserva, la cultura non è sano e può essere contaminato. </li><li> Se le culture non necessitano di manutenzione o passaging, possono essere adottate per la cappa di sicurezza biologica di essere alimentato (vedi sezione 2). </li><li> Se le culture contengono più del 10% circa differenziare le colonie, le cellule devono essere &quot;ripulita&quot; da rimuovere manualmente le zone differenziate (vedi sezione 3). </li><li> Se le culture contengono colonie di grandi dimensioni o dense o il livello alimentatore MEF è più di 12 giorni, le cellule dovrebbero essere diversi passaggi (vedi sezione 4). </li></ol> 2. Alimentazione hES Cellule <ol><li> In un armadio di sicurezza biologica sterile, rimuovere il coperchio del piatto cultura e aspirare il terreno spesi. Non lasciare che la punta della pipetta di toccare qualsiasi parte della targa diversa direttamente all&#39;interno dei pozzi. Se non vi è alcuna preoccupazione di contaminazione, passare a una nuova, pipetta sterile. </li><li> Utilizzando una pipetta sterile di vetro, aggiungere la giusta quantità di caldo terreno di coltura cellulare hES in ciascun pozzetto. Per le culture in un 6-pozzetti, aggiungere 2,5 ml di mezzo di ogni bene. </li><li> Riportare la piastra per l&#39;incubatore di rimanere a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 3. Rimozione differenziazione da colture di cellule hES <ol><li> Trasformare da 9 pollici in vetro pipette Pasteur in strumenti di raccolta per stampaggio le punte sopra la fiamma controllata di un bruciatore ad alcol. Assicurarsi che la punta della pipetta è sigillato per evitare contaminazione e arrotondati per evitare di graffiare la plastica del piatto cultura. Sterilizzare gli strumenti di raccolta prima dell&#39;uso utilizzando la fonte di luce UV nella cappa di sicurezza biologica o raccolta custodia. </li><li> Rimuovere le zone differenziate. La differenziazione avviene spesso in solo una parte di una colonia di cellule hES, di solito lungo i bordi o come punti isolati al centro. Se solo una parte di una colonia è differenziare, solo l&#39;area differenziata deve essere rimosso. La differenziazione può spesso sollevare la piastra in un foglio di &quot;appiccicoso&quot;, ed è utile per separare prima le cellule differenziate dal resto della colonia disegnando una linea attraverso la colonia con la fine dello strumento di prelievo. </li><li> Una volta che i pezzi della colonia sono separati, dolcemente scivolare lo strumento di raccolta lungo la piastra per staccare le cellule indesiderate. Fare attenzione a non raschiare troppo dello strato di alimentatore MEF tra le colonie in questo processo. </li><li> Quando tutte le cellule differenziate vengono rimosse dalla piastra (e galleggiante nel mezzo), riportare la cultura alla cappa di sicurezza biologica. Aspirare il terreno contenente le cellule differenziate e sostituire con nuove terreno di coltura di cellule HES. </li></ol> 4. Passaging hES Cellule Enzima Incubazione <ol><li> In un armadio di sicurezza biologica sterile, rimuovere il coperchio del 6 ben piatto cultura e aspirare il medio speso dai pozzi di essere diversi passaggi. Non lasciare che la punta della pipetta di toccare qualsiasi parte della targa diversa direttamente all&#39;interno dei pozzi. </li><li> Utilizzando una pipetta sterile di vetro, aggiungere 1 ml di collagenasi IV riscaldato in ciascun pozzetto di essere diversi passaggi. </li><li> Ritorna la piastra ai 37 ° C incubatore per 5 minuti. </li></ol> Raschiatura e pooling delle Cellule hES <ol start="4"><li> Dopo aver incubato le cellule con collagenasi, osservare le colonie al microscopio. L&#39;enzima dovrebbe causare un cambiamento sottile ma visibile nei bordi colonia. </li><li> Nella cappa di sicurezza biologica, delicatamente aspirato l&#39;enzima di ogni bene e sostituirlo con medie 2,0 ml di coltura cellulare hES. </li><li> Pendere l&#39;ago della piastra di coltura leggermente verso voi e prendere il medium da 2,0 ml nel primo pozzo con una pipetta di vetro 5 ml. Tenendo la pipetta perpendicolare al fondo del piatto, delicatamente scivolare la punta della pipetta tutto il bene mentre rilasciando lentamente il mezzo. </li><li> Ripetere la raschiatura e pipettitempi di movimento ng 3-4 finché tutte le colonie sono state rimosse dal pozzo. Pipettare delicatamente per evitare di rompere le colonie in troppo piccoli pezzi. Quando le cellule sono state rimosse dal primo pozzo, lasciare i contenuti nel bene e iniziare raschiare le cellule off del prossimo bene. </li><li> Quando tutti i pozzi da diversi passaggi sono stati raschiati, piscina per il supporto contenente i pezzi colonia di ogni bene in un tubo sterile 15 ml. </li><li> Sciacquare i pozzi raschiata con l&#39;aggiunta di 1 ml di terreno di coltura cellulare hES in ciascun pozzetto. Raccogliere questa risciacquare e trasferimento al tubo conico. </li><li> Pipettare delicatamente le cellule nel tubo di rompere i pezzi colonia fino alla dimensione desiderata. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 x g. </li></ol> Placcatura Celle cella hES <ol start="12"><li> Mentre le cellule hES sono nella centrifuga, preparare un nuovo cambio a 6 pozzetti alimentatore MEF. Etichettare il piatto con le informazioni appropriate cellule hES: linea cellulare, numero nuovo passaggio, il passaggio e la data. Aspirare il terreno MEF dai pozzetti e aggiungere 1,0 ml di PBS in ciascun pozzetto. Capovolgere delicatamente il tampone intorno ai pozzi ed aspirare il lavaggio PBS. Aggiungere 1,5 ml di cellule hES terreno di coltura in ciascun pozzetto e impostare il piatto da parte. </li><li> Quando le cellule sono finiti hES centrifugazione, portare la metropolitana per tornare alla cabina di sicurezza biologica. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il vagamente ricco di pellet. </li><li> Risospendere le cellule del pellet con il mezzo sufficiente per 1 ml di terreno di coltura di cellule hES per bene a essere placcato. Quando si divide in 6 nuovi pozzi, risospendere il pellet in 6 ml di mezzo. </li><li> Delicatamente e in modo uniforme aggiungere 1 ml di sospensione cellulare ad ogni preparato pozzetto della piastra di alimentazione MEF. </li><li> Collocare la piastra nel 37 ° C incubatore e con attenzione scorrere la piastra in avanti a indietro, e un lato all&#39;altro per distribuire uniformemente le cellule in tutto il bene. </li><li> Permettono alle cellule di fissare a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Cellule indifferenziate hES sono piccoli, fitto, e di solito consistono di diffusione più grande, più le cellule. La differenziazione può avvenire all&#39;interno di una colonia (Figura 1A) o tra le colonie (Figura 3B). Morhopologies differenti può essere visto sotto bassi ingrandimenti al microscopio. Una buona morfologia cellulare, come si vede nella Figura 2A, contiene piccole celle fitto che crescono in un monostrato. Le cellule devono essere puliti, bordi definiti, con poco o nessun differenziazione. Le cellule mostrato nella figura 2B sono pronti per passaging, e le cellule mostrato nella Figura 2C sono sovraffollati. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Differenziazione nelle culture hES. (A) la differenziazione di una colonia (B) differenziazione tra colonie. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Morfologie visto nelle culture hES. (A) la morfologia cellulare buono (B), le cellule hES che sono pronti per passaging (C) celle sovraffollate.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

Sterilità deve essere mantenuto in ogni momento quando si lavora con le cellule HES. Pulire e sterilizzare la cappa di sicurezza biologica e tutte le attrezzature prima dell&#39;uso. Tutti i reagenti devono essere filtrati con un filtro di dimensione dei pori 0,22 micron prima dell&#39;uso. L&#39;uso di antiboiotics in coltura cellulare hES non è necessario e deve essere evitato. Un ambiente separato deve essere impostato come una stazione di raccolta designato. L&#39;involucro sterile per la stazione può essere un contenitore statico (come ad esempio una workstation PCR) con una sorgente di luce UV, una cappa a flusso laminare, o una cappa di sicurezza biologica. Un microscopio da dissezione all&#39;interno della stazione di prelievo è necessario per osservare le colonie come le zone differenziate vengono rimossi. Il pannello di vetro frontale di un contenitore statico o di una cappa di sicurezza biologica deve essere modificato per consentire la oculari del microscopio per estendere attraverso il pannello senza compromettere il corretto flusso e la sterilità. Per mantenere sano hES colture cellulari, le cellule devono essere diversi passaggi al momento ottimale, di solito ogni 4-7 giorni. In questo momento le colonie hanno raggiunto la loro dimensione massima e può iniziare ad unire. Colonie unite possono aumentare il tasso di differenziazione nella cultura. Rapporti di Spalato rientrano generalmente 1:03-1:05, a seconda del numero di colonie placcato, il tasso di espansione e condizioni di coltura. Colonie Overplated (rapporto di divisione troppo basso) probabilmente si fondono prematuramente e devono essere diversi passaggi prima che raggiungano la loro dimensione massima. Culture su uno strato alimentatore MEF che è più di 2 settimane di vita devono essere diversi passaggi a nuove MEF che sosterrà la crescita indifferenziata e la proliferazione. Dal momento che la differenziazione si verifica naturalmente in colture cellulari hES, una piccola quantità è previsto. Differenziazione frequente o eccessiva può verificarsi se le culture non ricevono cure adeguate. Le cellule devono essere nutriti ogni giorno, crescita eccessiva tra i passaggi dovrebbero essere evitati. Utilizzare sempre i reagenti freschi. Tutti i media, MEF e reagenti devono essere utilizzati entro 14 giorni di tempo per evitare la crescita delle cellule indifferenziate hES. Nuovi lotti di reagenti, come la sostituzione Knockout Serum, FBS e MEF, devono essere sottoposti a screening prima dell&#39;uso. Ricorda che tutte le cellule differenziate non rimossi prima passaging saranno trasferiti alle nuove culture. Inoltre, cercare di mantenere le cellule a 37 ° C, quando possibile. Ridurre al minimo il tempo le cellule passano al di fuori dell&#39;incubatore (ad esempio sul palco microscopio o nella cabina di sicurezza biologica.) Una fase microscopio riscaldata può essere molto utile se le cellule saranno dell&#39;incubatore per lunghi periodi di tempo. Osservando le colture cellulari hES sotto il microscopio, in primo luogo valutare la qualità complessiva e le dimensioni delle colonie vista con un basso consumo (2x o 5x) obiettivo. Se le cellule potenzialmente differenziati sono osservati a bassa potenza, confermare la morfologia differenziata con un obiettivo più alto ingrandimento (10X). Immediatamente dopo la rimozione di differenziazione, i bordi delle colonie possono apparire irregolari o danneggiati. Incubare le colonie durante la notte in un mezzo fresco per permettere alle cellule indifferenziate rimanenti per recuperare. Senza l&#39;influenza di differenziazione nella cultura, queste colonie rimanenti continueranno a proliferare normalmente. Se possibile, iniziare gli esperimenti con basso passaggio cellule HES. Cariotipo delle cellule prima e dopo tutti gli esperimenti più importanti.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

Staminali embrionali umane (HES), le cellule devono essere monitorati e curati al fine di mantenere sano, culture indifferenziato. Come minimo, le culture devono essere nutriti ogni giorno eseguendo un cambiamento completo di media per ricostituire i nutrienti perduti e per mantenere le culture senza fattori di differenziazione indesiderati. Sebbene una piccola quantità di differenziazione è normale e previsto in colture di cellule staminali, la cultura dovrebbe essere regolarmente ripulito da rimuovere manualmente, o &quot;picking&quot; zone differenziate. Identificare e rimuovere l&#39;eccesso di differenziazione da colture di cellule hES sono tecniche essenziali per il mantenimento di una popolazione sana di cellule.

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Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Questo protocollo dimostra come mantenere sani, indifferenziate staminali embrionali umane (ES) cellule.

Cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

culture-and-maintenance-of-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

47.5K Views.  Stemgent. Questo protocollo dimostra come mantenere sani, indifferenziate staminali embrionali umane (ES) cellule.

Video: Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

Ricerca

Biologia

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane per la Risonanza Magnetica

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...