La quiescenza del ciclo cellulare è una caratteristica chiave delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo aiuta a comprendere il comportamento degli HSC umani quiescenti in vitro in condizioni quasi fisiologiche. Utilizzando questo protocollo, i ricercatori possono testare l'effetto di vari composti, nutrienti o proteine che regolano lo stato del ciclo cellulare e la differenziazione degli HSC in modo scalabile senza utilizzare modelli animali.
I farmaci antitumorali hanno effetti variabili sulla sopravvivenza degli HSC quiescenti e dei progenitori ciclistici. Questo protocollo consente di trovare agenti che risparmiano HSC quiescenti o agenti che danneggiano selettivamente le cellule staminali leucemiche quiescenti. A dimostrare la procedura sarà Hiroshi Kobayashi, ricercatore senior del Laboratorio Takubo.
Per iniziare, sciogliere 16 milligrammi per millilitro palmitato di sodio, 30 milligrammi per millilitro di sodio oleato e quattro milligrammi per millilitro colesterolo in metanolo in tubi di vetro. Conservare le soluzioni lipidiche a -30 gradi Celsius e scongelarle prima dell'uso. In un tubo di vetro fresco, mescolare le soluzioni lipidiche per ottenere la concentrazione finale di 100 microgrammi per palmitato millilitro, 100 microgrammi per millilitro oleato e 20 microgrammi per colesterolo millilitro.
Evaporare il metanolo passando il gas azoto attraverso la soluzione lipidica. Evaporare completamente il metanolo rimanente riscaldando il tubo di vetro in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Preparare il mezzo DMEM/F-12 con HEPES e glutammina.
Aggiungere penicillina e solfato di streptomicina per una concentrazione finale rispettivamente di 50 unità e 50 microgrammi per millilitro. Il mezzo può essere conservato a quattro gradi Celsius per almeno due mesi. Aggiungere il 4% di BSA al mezzo DMEM/F-12 con HEPES e glutammina, quindi regolare il pH del mezzo a 7,6 utilizzando la soluzione di idrossido di sodio.
Aggiungere il mezzo al tubo di vetro con i lipidi. Sciogliere completamente i lipidi per sonicazione. Se il mezzo è opaco dopo la sonicazione, prolungare il tempo di sonicazione.
Quando la BSA e i lipidi vengono sciolti, i campioni devono essere conservati a -80 gradi Celsius e utilizzati entro due mesi. Aggiungere 0,001X di insulina, transferrina, selenite di sodio e miscela di emina di etanolo al DMEM/F-12, quindi filtrare il mezzo misto utilizzando un filtro da 0,22 micrometri. Prima dell'uso, aggiungere il fattore delle cellule staminali umane o SCF e la trombopoietina umana o TPO ai mezzi di coltura ad una concentrazione finale di tre nanogrammi per millilitro ciascuno.
Trasferire 200 microlitri dei mezzi di coltura precedentemente preparati con citochine su piastre flat bottom da 96 pozzi. Per evitare l'evaporazione del mezzo, riempire tutti i pozzi inutilizzati con da 100 a 200 microlitri di PBS. Rimescolare le cellule staminali ematopoietiche ordinate o HSC nei mezzi di coltura senza citochine a 60 cellule per microlitro.
Aliquota 600 celle in ogni pozzo. Meno di 300 cellule porteranno a maggiori variazioni tecniche e la coltivazione di più di 1.000 cellule in un singolo pozzo dovrebbe essere evitata a causa della privazione di nutrienti o dell'accumulo di citochine o chemiochine sfavorevoli. Coltura delle cellule in un incubatore multi-gas umidificato a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica del 5% e dell'1%.
Dopo sette giorni di ristrutturazione degli HSC purificati, fino all'80% delle celle ha visualizzato fenotipi positivi al marcatore CD34 e CD38 negativi. Il numero totale di cellule dipendeva dalla concentrazione di citochine. Concentrazioni più elevate di SCF e TPO hanno indotto l'ingresso nel ciclo cellulare, la proliferazione e la differenziazione.
Il numero di HSC fenotipi caratterizzati dal marcatore CD34 positivo, CD38 negativo, CD90 positivo e CD45 RA fenotipi negativi è aumentato in proporzione alle concentrazioni di SCF o TPO, mentre la frequenza tra le cellule totali è diminuita. Dopo tre mesi di trapianto di HSC di midollo osseo adulto coltivato, la ricostituzione può essere valutata in funzione della loro frequenza nel sangue periferico del murino positivo CD45 umano, cellule negative ter119 negative CD45. Tre lignaggi tra cui cellule B positive CD19, cellule mieloidi positive CD13 negative CD33 e cellule T positive CD3 sono state ricostituita in topi NOG trapiantati con HSC appena scongelati o coltivati.
Seguendo la cultura, gli HSC possono essere sottoposti a profilazione dell'espressione genica come pcr in tempo reale e sequenziamento dell'RNA. Può anche essere eseguita la convalida funzionale utilizzando il trapianto in topi immuno-carenti. I ricercatori possono confrontare direttamente gli HSC ciclistici e quiescenti in condizioni definite regolando le concentrazioni di citochine.
Questo aiuterà a comprendere i programmi di auto-rinnovamento quiescenti specifici dell'HSC, i meccanismi di resistenza allo stress e le proprietà metaboliche, che sono difficili da testare in contesti in vivo.
