Ringraziamo Drs. Yuh-gen Nung e Wes Grueber per la fornitura di scorte di volo utilizzato in questo studio. Gli autori riconoscono la F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust per il supporto di questa ricerca (DNC) e l&#39;Ufficio George Mason University Provost (EPRI).

Commenti generali su Magnetic Ordinamento Bead della Drosophila neuroni periferici (Timing totale per il completamento del protocollo: 2,5-3 ore) Procedure standard di laboratorio per il mantenimento di un ambiente pulito e libero RNAse devono essere osservate in ogni momento per evitare la degradazione dell&#39;RNA. Quando la cuticola larvale Drosophila viene sezionato e posto nel buffer di dissociazione delle cellule, i neuroni periferici sono una delle celle ultima a staccarsi dalla cuticola. Abbiamo sfruttato questa proprietà e progettato questo protocollo per rimuovere la maggior parte dei non-specifico le cellule dalla cuticola come il muscolo e grasso prima di isolare i neuroni da. Con la pratica, il protocollo intero può essere completato con successo nel giro di circa 2,5 ore. La preparazione di perline legate agli anticorpi devono essere completate prima che l&#39;esperimento comincia. 1. Preparazione Perline magnetica per celle Rilegatura: Questo passaggio deve essere completato prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. Le perle preparato possono essere preparati e conservati a 4 ° C fino al momento. <ol><li> Lavare 100 ml di Dynabeads M-280 beads Streptavidin ricoperto per tre volte in PBS da resuspending in 500 ml di PBS fresco e cubettatura è in un forte campo magnetico ogni volta. </li><li> Infine risospendere le sfere direttamente in 100 ml di anticorpi di ratto non diluito biotinilato anti-topo-CD8a (concentrazione di anticorpi è 100 mg / ml). </li><li> Incubare la miscela per 1 ora su ghiaccio con occasionali vortex da lieve a evitare la sedimentazione. [1 ml di Dynabeads M-280 può legare 0,05-0,10 mg di anticorpo biotinilato]. </li><li> Lavare il tallone-anticorpo miscela tre volte come descritto al punto 1.1 per rimuovere l&#39;anticorpo in eccesso. Le sfere magnetiche sono rivestiti con anticorpo e pronto per essere utilizzato. Conservare il cordone-anticorpo miscela in 100 ml di PBS 1X a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 2. Selezione e lavaggio Larve: (10-15 minuti) <ol><li> Scegli stessa età 30-50 larve terzo instar e metterli in una provetta per microcentrifuga 1.6ml con 1-1,2 ml di 1X Phosphate Buffered Saline (PBS). (3-5 minuti) </li><li> Tappare la provetta e vortice che al valore massimo tre volte per 1 secondo ciascuna. </li><li> Utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur scartare il surnatante completamente. Ripetere il lavaggio (2,1) e vortex (2,2) passi 3-4 volte fino a quando il surnatante è visibilmente chiaro di particelle di cibo e detriti. </li><li> Brevemente ripetere il lavaggio con 1 ml di etanolo al 70% e scartare il surnatante. </li><li> Lavare le larve due volte con 1 ml di ddH2O e scartare il surnatante. </li><li> Brevemente ripetere il lavaggio, ancora una volta con 1 ml di RNAsi-AWAY e scartare il surnatante. </li><li> Lavare le larve tre volte in 1 ml di ddH2O per assicurare la rimozione completa di RNAsi-AWAY. </li></ol> 3. Dissezione: (10-12 minuti) <ol><li> Luogo 10-12 larve al centro di un piatto rivestito Sylgard 35 millimetri Petri. Posizione leggermente distanza gli uni dagli altri. [Punto Critico: Eliminare qualsiasi larve che non sembrano essere al momento opportuno di sviluppo] </li><li> Taglio aperto la punta anteriore delle larve con un paio di forbici dissezione bene per tutte le larve. </li><li> Utilizzando un paio di sordo Dumont n ° 5 pinze invertire le larve dentro-fuori. Inserire una pinza all&#39;interno della cuticola larvale fino alla fine posteriore. Pizzicare la punta delle pinze insieme per afferrare l&#39;estremità posteriore della cuticola (Figura 1a) (provate a premere la cuticola sulla superficie Sylgard per rendere più facile). Utilizzando la seconda coppia di pinze, spingere le cuticole larvali dentro e fuori. [Punto Critico: Prova pratica di questo metodo un paio di volte prima di tentare l&#39;esperimento di isolamento delle cellule. Cercare di ottenere le larve completamente invertito, per garantire che tutti i tessuti molli sono esposti a una soluzione per una facile dissociazione.] </li><li> Dopo la dissezione larve 3-4, trasferirli immediatamente a fresco, ghiacciato PBS (posizionare il tubo in ghiaccio) in una provetta da microcentrifuga 1,6 ml. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,4 fino a che tutte le larve richiesti sono raccolti (30-40 larve in questo protocollo). [Fase critica:. Anticipare la perdita di 10-20% durante la dissezione e la dissociazione, e pianificare di conseguenza] </li></ol> 4. Rimozione di vagamente aderente non specifiche cellule: (2-3 minuti) [Questa fase aiuta la compensazione di vagamente aderente non specifici tessuti come corpi grassi e del SNC.] <ol><li> Prendere la microcentrifuga 1,6 ml tubo contenente le cuticole invertita larvale e sostituire il surnatante con circa 700-800 ml di fresca ghiacciata PBS. </li><li> Pulse-vortice nella provetta per microcentrifuga 5 volte (3 secondi per impulso) a piena velocità. </li><li> Eliminare il supernatante e sostituirlo con circa 700-800 microlitri fresca, ghiacciata PBS. </li><li> Ripetere i passi 4.2 e 4.3 per tre volte. </li><li> Resuspend le cuticole larvali in 400 ml di fresco, ghiacciato PBS </li></ol> 5. Dissociare il tessuto in una sospensione singola cella: (18-20 minuti) [Punto Critico: Over-dissociazione può causare la perdita della superficie cellulare marcatore porta alla produzione di cellule poveri e vitalità cellulare basso. Il tessuto larvale può essere dissociata da una dissociazione meccanica (sonicazione, douncing), dissociazione enzimatica (tripsina, collagenasi, ecc) o una combinazione di entrambi. Poiché questi tessuti larvali sono difficile dissociare, abbiamo scoperto che una combinazione di entrambi meccanica e dissociazione enzimatica ha dato i migliori risultati.] <ol><li> Aggiungere 1,5 ml di Liberase Blendzyme 1X 3 (28 W unità nsch / fiala) per la cuticola larvale sospesi in 400 ml di PBS. </li><li> Vortex la soluzione 2-3 volte per 1 secondo ciascuno al valore massimo (Questo dovrebbe rimuovere le cellule aderenti liberamente dalla cuticola nella soluzione). </li><li> Incubare la soluzione a temperatura ambiente (22-25 ° C) per 5 minuti. [Punto Critico: I tempi di incubazione influenza notevolmente l&#39;efficienza finale separazione delle cellule. Il tempo di incubazione raccomandato dovrebbe essere sufficiente per allentare il tessuto. Non superare i 15 minuti.] </li><li> Pulse-vortice del tubo 20-30 volte con impostazioni al massimo per 2 secondi per impulso a tutta velocità. Questo dovrebbe rilascia i muscoli e altri tessuti nella soluzione. Ispezionare un piccolo campione dalla soluzione sotto un fluorescente stereo-microscopio ad ogni passo. (Con l&#39;esperienza si dovrebbe essere in grado di determinare il livello di dissociazione osservando la provetta da microcentrifuga direttamente sotto una fluorescenza abilitato stereomicroscopio) </li><li> Lavare le cuticole larvali 2-3 volte fresca, ghiacciata PBS e infine li risospendere in 500 ml di fresca, ghiacciata BSA PBS contenente 1%. </li><li> Per evitare la cuticola larvale attaccarsi alla superficie del vetro del 2 ml tessuto Kontes macina e il pestello spazio di grandi dimensioni, pre-coat la smerigliatrice tessuti e pestello con una BSA 1% in soluzione PBS e dopo un breve risciacquo scartare la soluzione di BSA. Successivamente, utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur, trasferire le cuticole dal punto 5.5 al BSA rivestite grinder tessuti. [Fase critica: Pre-raffreddare la smerigliatrice tessuto / pestello ponendolo in ghiaccio per qualche minuto per evitare danni alle cellule / lisi]. </li><li> Dounce il tessuto con tratti lento e costante, evitando la formazione di schiuma (circa 20-30 colpi). [Punto Critico:. Dounce lentamente e costantemente, altrimenti le cellule possono lisare] </li><li> Per valutare i livelli di cellule dissociazione, pulire il muro esterno della smerigliatrice tessuto con un tessuto Kimwipe pulire ed esaminare sotto un fluorescente stereo-microscopio. I neuroni dovrebbe avere staccato dalla cuticola, e può essere visto nella soluzione. Se questo si trova ad essere difficile, in alternativa pipetta da un piccolo campione della soluzione, e osservare sotto un fluorescente stereo-microscopio. Una buona indicazione di cellula dissociazione è l&#39;assenza di neuroni dalla cuticola larvale. Tuttavia, se si osserva ancora i neuroni attaccati alla cuticola, o osserva le cellule non completamente dissociato, dounce ulteriormente fino a quando le cellule ottenere una sospensione singola cellula. </li><li> Triturare la soluzione 5 volte con un incendio lucidato pipetta Pasteur ridotto a circa il 50% del diametro della punta standard, seguito da 10 volte con un fuoco lucidato pipetta Pasteur ridotto a circa il 25% del diametro della punta standard. [Punto Critico: triturazione Forceful possono danneggiare le cellule. Monitorare le cellule tra i passaggi, e regolare la procedura di conseguenza]. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso un filtro a 30 micron cellulari e raccogliere le cellule filtrato in una provetta da microcentrifuga 1,6 ml. La soluzione risultante deve essere costituito da una sospensione singola cellula ed è ora pronto per l&#39;ordinamento delle cellule magnetica. </li></ol> 6. Magnetici Ordinamento Bead Cell: (45 - 75 minuti, dipendente dal tempo di incubazione degli anticorpi) <ol><li> Aggiungere 15 ml di anticorpi sfere rivestiti magnetico a 500 l di sospensione cellulare (punto 5.10). I restanti anticorpi coniugati perline magnetiche possono essere conservati fino al momento della cella di isolamento successive. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi sfere rivestiti magnetico per 30-60 minuti in ghiaccio con occasionali miscelazione manuale. [Fase critica: incubazione ad una temperatura più alta o più a lungo tempo può causare legame aspecifico degli anticorpi.] </li><li> Collocare la provetta da microcentrifuga in un forte campo magnetico per 2 minuti. Tutte le cellule positivamente selezionato insieme con perline legato separerà al lato del tubo. </li><li> Lentamente pipetta il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Lavare le cellule 3-4 volte in acqua dolce, ghiaccio, freddo PBS per rimuovere qualsiasi residuo non specifiche cellule. </li><li> Risospendere le cellule in 30 ml di fresco, ghiacciato PBS. </li><li> Per approssimare la purezza e la resa delle celle, pipettare 5 ml di sosp della cellulaENSIONE sulla superficie levigata di un emocitometro e contare tutte le cellule fluorescenti visibili sotto un fluorescente stereo-microscopio. Anche controllare la quantità di cellule non fluorescente e tutti i segni di impurità. In genere il campione sarà fortemente arricchito per le cellule fluorescenti. </li></ol> 7. Isolamento RNA da cellule magnetica Bead ordinato: (60 - 75 minuti) <ol><li> Dopo il conteggio, agglomerare le cellule in un campo magnetico, scartare il surnatante e aggiungere 20 ml di tampone di estrazione dal ™ PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). A seconda del numero di cellule che si possano desiderare per aggiungere un maggiore volume di tampone di estrazione. </li><li> Vortex il tubo alla massima velocità per consentire la miscelazione di pellet con tampone di estrazione. </li><li> Incubare la provetta a 42 ° C per 30 minuti. </li><li> Per assicurare la rimozione degli sfere magnetiche prima colonna purificazione del RNA (vedi punto 7.5), il tubo viene brevemente centrifugata a 2.000 (x) g per 2 minuti per far sedimentare le sfere magnetiche. Il tubo viene quindi posto in un forte campo magnetico per mantenere il pellet, e il supernatante è trasferito in una provetta da microcentrifuga nuovo. </li><li> Estrarre e purificare l&#39;RNA colonna secondo le istruzioni del produttore estrazione PicoPure RNA kit. DNAsi trattamento è facoltativo, e può essere eseguita su colonna durante la purificazione di RNA secondo le esigenze di analisi. Infine, eluire l&#39;RNA totale legato in un piccolo volume (11-30 mL) di tampone di eluizione e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. Se lo si desidera un 1 microlitri aliquota può essere utilizzato per valutare la qualità totale RNA su un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Rappresentante dei risultati: Magnetici ordinamento cordone è stato utilizzato per isolare Drosophila da neuroni (Figura 1). L&#39;RNA purificato da questi neuroni isolati da (Figura 2a) è risultato essere di ottima qualità, come indicato dalla presenza di forte 5.8S, 18S e 28S picchi di RNA ribosomiale se analizzato su un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). A partire da 30-40 larve terzo instar siamo stati capaci di isolare in media 300-500 classe IV neuroni da utilizzando il PPK-GAL4 driver e 1500-2000 da neuroni (Classe I, II, III e IV) con il pan- da neurone specifico GAL4 21-7 driver. Per valutare l&#39;neuronali specifici per l&#39;arricchimento delle nostre cellule isolate abbiamo eseguito trascrizione inversa PCR quantitativa (QRT-PCR) utilizzando due neuronale gene-specifici marcatori (ELAV e futsch). Queste analisi hanno rivelato significativo arricchimento piega di entrambi i geni marker che indica un arricchimento altamente specifico per i neuroni da rispetto al fluire attraverso usando il nostro protocollo (Figura 3). Infine, l&#39;RNA isolato da entrambi i pan-da neuroni e di classe IV da neuroni è stato utilizzato per eseguire il profiling trascrizionale dell&#39;espressione su Agilent Drosophila melanogaster intero genoma oligo microarray (4 x 44K) (Figura 4). Queste analisi hanno identificato numerosi regolatori precedentemente implicato della morfogenesi da neurone dendrite oltre ad un ampio spettro di molecole in precedenza e non caratterizzato putativo vie di trasduzione del segnale che potenzialmente svolgono importanti ruoli funzionali in fase di sviluppo da neurone. Studi volti a valutare il ruolo potenziale (s) di queste molecole non caratterizzato in precedenza nella mediazione da sviluppo dei neuroni, e specificamente la morfogenesi dendriti, sono attualmente in corso. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figura 1:. Schematica di smistamento magnetico goccia di Drosophila neuroni da (a) Età abbinati larve terzo instar porta il neurone specifico da GAL4, UAS-mCD8-GFP giornalista transgene sono sezionati invertendo la cuticola larvale inside-out, per esporre la PNS di dissociazione del buffer e conservati in ghiaccio PBS freddo. (b) dissociazione enzimatica è realizzato con l&#39;aggiunta Liberase Blendzyme 3 per la soluzione contenente cuticola larvale. (c) I tessuti larvali sono ulteriormente dissociato da una combinazione di vortex, triturazione e douncing per rimuovere i tessuti non specificamente etichettati come grassi corpi, intestino e sistema nervoso centrale. (d, e) Le cellule sono poi filtrati con un filtro da 30 micron cellula. La soluzione contiene un&#39;unica sospensione cellulare di diversi tipi di cellule tra cui epiteli, muscoli e neuroni. (F), anti-topo CD8a-anticorpi Dynabeads M-280 sono aggiunti alla sospensione cellulare, e incubate in ghiaccio per 30-60 minuti. ( g) Le sfere magnetiche si lega ai neuroni che esprimono da un mouse CD8 tag proteina di fusione GFP. (h, i) Le cellule del cordone magnetico rivestito sono separati ponendo la soluzione in un forte campo magnetico. Il supernatante viene scartato, e le cellule vengono lavate tre volte per rimuovere eventuali residui non specifica delle cellule, con conseguente (j) highly purificato da popolazioni di neuroni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figura 2: (a) immagine rappresentativa del positivamente selezionato, fluorescente GFP classe IV neuroni da cellule isolate dalla dissociazione e magnetici ordinamento tallone. La popolazione risultante di neuroni è stato considerato altamente arricchito per la classe IV da neuroni con poca o nessuna impurità cellule contaminanti. (B) Un Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) elettroferogramma di RNA totale isolato da perla magnetica neuroni ordinati da , mostrando un ottimo rapporto qualità RNA totale, come indicato dalla presenza di 5.8S, 18S e 28S rRNA. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figura 3: qRT-PCR dell&#39;espressione neuronale gene marcatore in isolate da neuroni (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) e il flusso attraverso la frazione è stata eseguita in triplice copia. I livelli di espressione dei due neuronali specifici geni marcatori (ELAV e futsch) sono stati valutati da qRT-PCR. I valori ottenuti da queste analisi sono stati normalizzati al controllo endogeno (rp49), ed i livelli rispetto a quelli osservati in flusso attraverso frazione sono stati calcolati con il metodo ΔΔCτ 6. Sia ELAV e futsch erano significativamente arricchito in isolati popolazione da neurone rispetto al flusso attraverso la frazione. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figura 4: Rappresentante di classe IV da neuroni specifici Cy3 etichettati file immagine microarray. Qui è un Agilent Drosophila melanogaster intero genoma oligo microarray (4 x 44K) ibridato con Cy3-labeld RNA totale isolato dalla classe IV neuroni da purificata dalla magnetica ordinamento tallone. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 4.

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Il protocollo presentato qui è ottimizzato per l&#39;isolamento e la purificazione dei neuroni periferici che aderiscono strettamente alla superficie interna della cuticola terzo Drosophila instar larvale con una perla magnetica strategia di separazione delle cellule. Mentre abbiamo usato questo protocollo per isolare specificamente Drosophila neuroni da applicazioni di questo protocollo per l&#39;isolamento di altri tipi di cellule che aderiscono alla cuticola in stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, ...

Attrezzatura <ul><li> (10) blocco magneti al neodimio (Magnetics K &amp; J, Inc., cat. # B444B), in alternativa DynaMag ™ -2 (Invitrogen, cat. N. 123-21D), può essere utilizzato. </li><li> Kontes Grinder tessuto di vetro, 2 ml di lavoro, con pestello spazio di grandi dimensioni (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtri di cellule, ad esempio, MACS pre-filtro di separazione (Miltenyi Biotec, cat. # 130-041-407) </li><li> 35 millimetri petri-piatti rivestiti con Sylgard (Dow Corning Corporation, cat. # 3097358-1004) </li><li> Strumenti di dissezione: due paia di pinzette Dumont n. 5 (Strumenti Scienza Fine, Cat # 11251-20). </li><li> Vännäs primavera micro-dissezione forbici (Strumenti Scienze Arti, cat. # 15000-08) </li><li> Pipette (P-1000, P-100, P-10) con punte monouso </li><li> Emocitometro standard per contare le cellule e la purezza stima </li><li> Pipette Pasteur con punte fuoco lucido di diametro standard, ridotto a circa il 50% del diametro standard e ridotto a ~ 25% del diametro standard per la triturazione </li><li> Piano micro-centrifuga (1-16,000 (x) g) </li><li> Vortice </li><li> Fluorescente stereo-microscopio (un MZ16FA Leica è stato utilizzato in questo protocollo) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Sistema nervoso periferico (PNS) è un modello potente per indagare i complessi processi di sviluppo neuronale e morfogenesi dendrite a livello funzionale e molecolare. Per facilitare queste analisi, abbiamo sviluppato una strategia per l&#39;isolamento di una sottoclasse di neuroni PNS chiamato arborizzazione dendritica (bis) i neuroni che sono stati ampiamente utilizzati per studiare la morfogenesi dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Questi neuroni sono molto difficili da isolare come una popolazione pura, dovuto in parte al loro verificarsi estremamente bassa e la loro difficile da raggiungere, posizione sotto la cuticola chitinosa dura larvale. Il nostro metodo di nuova concezione supera queste sfide, e si basa su un arricchimento delle cellule veloce e specifici utilizzando sfere magnetiche legate agli anticorpi. Per i nostri studi magnetici ordinamento tallone, abbiamo usato pari età larve terzo instar esprimere un mouse CD8 tag proteina di fusione GFP (<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sotto il controllo sia della arborizzazione dendritica classe IV (bis)-neurone specifico<em&gt; Borseggiatore (PPK)-GAL4</em&gt; Autista<sup&gt; 4</sup&gt; O il controllo del pan-da neuroni specifici GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Autista<sup&gt; 5</sup&gt;. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per isolare le cellule PNS che sono attaccati alla parete interna della cuticola larvale, variando alcuni parametri, il protocollo di poter essere utilizzata per isolare molti tipi cellulari diversi collegato alla cuticola a stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, muscolo, oenocytes ecc), o altri tipi di cellule di organi larvale a seconda della GAL4 specifico modello di driver di espressione. L&#39;RNA isolato con questo metodo è di alta qualità e può essere facilmente utilizzata per analisi genomiche a valle, come gli studi di espressione genica profiling microarray. Questo approccio offre un nuovo e potente strumento per svolgere studi di isolati<em&gt; Drosophila</em&gt; Arborizzazione dendritica (bis) i neuroni fornendo così nuove intuizioni sui meccanismi molecolari alla base della morfogenesi dendrite.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento e la purificazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni periferici utilizzando un digiuno perla magnetica assistita strategia di separazione delle cellule. RNA ottenuti da cellule isolate possono essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle comprese le analisi di microarray.

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K Views.  George Mason University. In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la purificazione di Drosophila Neuroni periferici utilizzando un digiuno perla magnetica assistita strategia di separazione delle cellule. RNA ottenuti da cellule isolate possono essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle comprese le analisi di microarray.

Video: Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti<em&gt; Drosophila</em&gt; Teste

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per l'isolamento delle popolazioni cellulari Scleractiniane

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...