Name: isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
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The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Tutti gli esperimenti, tra cui soggetti umani sono stati approvati dal comitato etico locale (approvazione n. 3/2/14). Per la scelta dei pazienti si deve notare che diversi fattori quali l&#39;età, il sesso, regimi terapeutici attuali e molti altri possono influenzare la composizione MV nel sangue e quindi devono essere presi in considerazione prima del prelievo 22,23. 1. Preparazione dei campioni di plasma <ol><li> Pareggio 1 - 2 provette di sangue per donatore attraverso una 21-gauge farfalla ago in un tubo di raccolta del sangue Vacutainer contenente EDTA (1,6 mg / ml di sangue). Assicurati di invertire i tubi (s) più volte per garantire efficiente anticoagulante del sangue. NOTA: Il volume consigliato di sangue per la successiva citometria a flusso e Western Blot è di 5 - 15 ml. Al fine di prevenire il degrado e la perdita di MV, i campioni di sangue devono essere trattati &lt;30 min dopo il ritiro del sangue. </li><li> Preparare campioni di plasma mediante centrifugazione dei campioni per 15 min a 1200 xgatemperatura ambiente (RT). </li><li> Applicare un filtro della valvola al fine di aiutare la separazione del plasma (= strato superiore) rimanga cellule del sangue (= strato inferiore). </li><li> Trasferire il plasma in un tubo da 15 ml. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1500 xg, RT a pellet più grande detriti cellulari e rimuovere le piastrine rimanenti. </li><li> Trasferire il surnatante in un tubo da 15 ml e procedere direttamente con i campioni di isolamento o conservare MV per un massimo di 6 mesi a -20 ° C. NOTA: Il protocollo presentato può anche essere utilizzata per isolare MV (e Exos) da supernatanti di coltura cellulare. Per fare ciò, coltivare cellule a 60 - 80% di confluenza per 24 - 48 ore in terreno di coltura addizionato con vescicole impoverito FCS e raccogliere il surnatante. Centrifugare per 5 minuti a 750 xg, a 4 ° C per eliminare le cellule residue galleggianti, riempire il surnatante in una nuova provetta 15 mL e centrifugare ancora per 5 min a 1500 xg, a 4 ° C per sedimentare grande detriti cellulari. Questo supernatante può quindi essere utilizzato per l&#39;isolamento di MVcome descritto al punto 2,1-2,16. </li></ol> 2. Isolamento di MV <ol><li> Trasferire il campione di plasma in un tubo di centrifugazione adatto. Se necessario, riempire tubo con PBS per diluire il campione e prevenire il collasso dei tubi a parete sottile durante la procedura di centrifugazione. </li><li> Centrifugare per 35 minuti a 14000 g, 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante, mantengono tubi girato a testa in giù e mettere su un tovagliolo di carta. Attendere 3-5 minuti fino a quando tutti restante surnatante è stato immerso in un asciugamano e quindi rimosso dal campione. </li><li> Risospendere il pellet MV in 1,000 ml PBS, trasferire in una provetta da centrifuga e 1,5 ml per 35 min a 14.000 xg, a 4 ° C in una centrifuga da tavolo. </li><li> Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet MV nel 50 - 500 microlitri di PBS, a seconda delle dimensioni del pellet. In alternativa, lisare MV direttamente, ad esempio, in RIPA tampone (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-desossicolato / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7.2)per successiva analisi Western Blot. MV conservare a -20 ° C. Essi rimarranno stabili per diversi mesi, ma evitare ripetuti di congelamento e scongelamento cicli. </li><li> Opzionale: Determinare la concentrazione di proteine MV, con tenore di proteine (per esempio, Bradford o il metodo di Lowry) al fine di valutare le rese MT o dosare MV per successivi esperimenti. </li><li> Se Exos supplementari devono essere isolati dai campioni di plasma, decantare il surnatante dal punto 2.3 in una provetta ultracentrifugazione e centrifugare per 2 ore a 110.000 xg, 4 ° C. Decantare il surnatante come descritto al punto 2.3, risospendere Exo pellet in 1.000 ml di PBS e trasferire in piccole (1,5 ml) tubi ultracentrifugazione. <ol><li> Ultracentrifuga per 2 ore a 110.000 xg, 4 ° C, aspirare il surnatante e risospendere pellet in Exo 50 - 75 microlitri di PBS o tampone RIPA. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione di MV mediante citometria di flusso <ol><li> Trasferimento 15 microlitri di PBS + 1% vescicole-impoverito vitello siero fetale (FCS) in un tubo di citometria di flusso. NOTA: vescicole-impoverito FCS viene preparato mediante centrifugazione inattivato al calore (30 min a 56 ° C) FCS per 18 ore a 110.000 xg e filtrante il surnatante attraverso un filtro da 0,2 micron come descritto in precedenza 24. </li><li> Aggiungere 5 mg (in caso di basse rese 3 mg sono applicabili anche) di MV in PBS. </li><li> Incubare campioni per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifici sulla superficie MV e quindi ridurre la colorazione di fondo. </li><li> Aggiungere un anticorpo fluorescente contro l&#39;interesse della proteina-di-. Titolare la quantità di anticorpo utilizzato per la colorazione prima dell&#39;uso per determinare la concentrazione ottimale e garantire un basso razione segnale-rumore. Assicurati di includere anche un tubo con MV non colorati come controllo negativo e un tubo di MV colorate con l&#39;anticorpo di controllo isotipo corrispondente alla stessa concentrazione (per esempio, se si usa 1 mg di anticorpo, utilizzare anche 1 mg di un controllo isotipicotibody) per quantificare la colorazione di fondo. NOTA: È anche possibile eseguire il flusso multicolore citometria aggiungendo più anticorpi accoppiati a diversi fluorocromi. </li><li> Incubare per 20 minuti a RT al buio. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di PBS e procedere con la misurazione del campione usando un citometro a flusso. <ol><li> Nel caso in cui i campioni non possono essere misurati immediatamente, aggiungere 150 microlitri di PBS e 50 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) per fissare campioni e conservare a 4 ° C. ATTENZIONE: PFA è tossico. Utilizzare guanti e idonei dispositivi di protezione individuale. </li></ol></li><li> Ridurre la soglia del citofluorimetro al valore più basso possibile e cercare la popolazione MV utilizzando un forward scatter (FSC) rispetto side scatter (SSC) trama in scala logaritmica. Porta sulla popolazione MV e valutare il segnale fluorescente in un corrispondente istogramma. </li></ol> 4. Caratterizzazione di MV mediante western blotting <ol><li> Risospendere il pellet MV direttamenteun tampone di lisi adatto (per esempio, RIPA buffer). <ol><li> Nel caso il pellet MV è già stato risospeso in PBS, diluirlo almeno 1: 1 in un tampone di lisi adatto (per esempio, tampone RIPA). </li></ol></li><li> Determinare la concentrazione di proteine del campione MV, ad esempio, mediante saggio Lowry. </li><li> Preparare 10-20 mg di MV in 22,5 microlitri di buffer RIPA. Quindi aggiungere 7,5 microlitri di 4x Laemmli buffer di carico e di calore per 5 minuti a 95 ° C. </li><li> Caricare i campioni su un gel di poliacrilammide ed eseguire elettroforesi e immunoblotting secondo protocolli standard. </li><li> Dopo il trasferimento delle proteine ​​sulla membrana, eseguire una colorazione Ponceau come controllo di caricamento secondo protocolli standard. </li><li> Membrana Decolorare in TBST per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Block membrana per 30 minuti fino a 1 ora a RT in 5% BSA in TBST. </li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo primario a 4 ° C durante la notte o per 2 ore a RT. </li><li> Lavare la membrana con TBST 3 x 5 min.</li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo secondario HRP-accoppiata ad una diluizione di 1: 10.000 in 5% BSA. Nota: In caso di alte segnali di fondo, utilizzare il latte in polvere al posto di BSA. </li><li> Lavare la membrana con TBST 3x 5 min. </li><li> Sviluppare membrana con un reagente di rilevamento ECL e rilevare segnali su film chemiluminescenza o un sistema di imaging chemiluminescenza. NOTA: Al fine di discriminare MV da Exos, proteine come tubulina, actinina-4 o mitofilin può essere utilizzato quale devono essere presenti principalmente sulla MV 16,25. Fare attenzione che gli anticorpi più tetraspanine (ad esempio, CD9, CD81), utilizzati come marcatori per Exos, non funzionano in condizioni riducenti e devono quindi essere preparati in tampone non riducente di carico seguita da riscaldamento per 10 minuti a 70 ° C. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Recenti studi su EVs nel sangue hanno dimostrato che la composizione e conta EV cambiano durante la causa di numerose malattie. Pertanto, l&#39;analisi e l&#39;ulteriore caratterizzazione di questi veicoli elettrici sono di grande interesse per valutare ulteriormente il loro potenziale utilizzo come biomarcatori di malattia per la diagnosi e la prognosi o per valutare le risposte di terapia. Il protocollo qui presentiamo permette l&#39;isolamento di vescicole con un diametro fino a 600 nm, che non contengono organelli cellulari. Queste osservazioni sono in linea con l&#39;attuale definizione di MV ed escludono la presenza di corpi apoptotici 2. Utilizzando Western Blotting, siamo stati in grado di dimostrare che le MV isolate mostrano una elevata espressione di tubulina, mentre i tetraspanine CD9 e CD81 che vengono spesso utilizzati come marcatori Exo sono stati solo leggermente espressi. Ciò conferma che gli MV differiscono da Exos e si adatta alla recente caratterizzazione approfondita e il confronto di entrambe le popolazioni eV di proteomica 25. content &quot;&gt; Durante acquisizione di campioni di sangue, è fondamentale per mantenere il tempo tra l&#39;iniezione in vena e preparazione plasma più breve possibile per evitare la degradazione MV. Inoltre, conservazione prolungata dei campioni di sangue potrebbe portare all&#39;attivazione di cellule del sangue causando maggiore MV spargimento e infine apoptosi che provoca il rilascio di corpi apoptotici. Un&#39;altra considerazione importante per isolamento MV è di evitare contaminazioni di preparati MT con le proteine ​​plasmatiche o Exos piccoli. Pertanto, è fondamentale per rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile dopo la filatura giù le MV a 14.000 x g. Poiché il pellet è normalmente visibile e saldamente fissato alla parete del tubo, il supernatante può essere facilmente rimosso con una pipetta. In contrasto Exos che tendono a formare aggregati durante la preparazione per ultracentrifugazione alta velocità e sono spesso difficili da riportare in sospensione, questo problema non si verifica con MV. Il nostro studio dimostra che è possible per caratterizzare le sottopopolazioni MV presenti nel sangue mediante citometria di flusso. Anche se il limite di rilevamento della maggior parte dei citometri a flusso è di circa 200-300 nm, MV sono stati misurati in modo riproducibile donatore così come campioni di colture cellulari con gli stessi parametri di analisi e delle porte che permettevano chiaramente la loro distinzione da segnali di fondo. È importante verificare prima delle misurazioni che il PBS utilizzata per le analisi non contiene particelle contaminanti che potrebbero causare un fondo elevato durante citometria di flusso (figura 3). Anche se alcuni MV più piccoli non potrebbero essere catturati in un approccio citometria a flusso, abbiamo rilevato MV da tutte le principali popolazioni di cellule del sangue (ad esempio, piastrine, globuli rossi, leucociti, cellule endoteliali). Nella nostra analisi abbiamo utilizzato gli indicatori standard, per le diverse cellule del sangue che sono stati precedentemente riportati sulla MV 26 - 29. Va notato che, al fine di ottenere i migliori risultati possibili per citometria a flusso, tlui di concentrazione di tutti gli anticorpi deve essere titolato su un campione MV che esprimono l&#39;antigene di interesse. Se specifiche sottopopolazioni MV nel sangue sono identificati con maggiore specificità, è possibile effettuare doppia colorazione contro due antigeni differenti presenti sulle rispettive MV e non solo tutti gli MV doppio positive per la successiva analisi 23. Attualmente, ci sono gli sforzi per definire una gamma standard di sottopopolazioni MV nel sangue di individui sani 23,30. Questi studi hanno già dimostrato che gli MV di derivazione piastrinica costituiscono la più grande popolazione di MV nel sangue, che è in corrispondenza con le nostre osservazioni. Uno dei vantaggi di citometria a flusso per caratterizzare campioni MV è che questo metodo è già ben stabilito a scopo diagnostico nella maggior parte dei centri clinici che permettano l&#39;eventuale uso di MV come biomarcatori nella diagnostica clinica di tutti i giorni. Precedenti studi sui veicoli elettrici nel sangue che hanno per lo più attenzioneEd il Exos più piccoli, si basano sia su procedure di selezione specifici per analizzare in modo selettivo l&#39;Exo popolazione target desiderato 31,32 o richiedono un (2 giorni) processo di isolamento in termini di tempo con accoppiamento di Exos al lattice perle prima dell&#39;analisi 18. Le nostre osservazioni non pubblicate suggeriscono che l&#39;analisi di citometria di flusso della MV da preparazioni di sangue intero consente anche l&#39;individuazione di MV come MV tumore-derivato senza tali processi di selezione. Nel loro insieme, il protocollo presentato qui permette l&#39;isolamento veloce di MV da campioni di sangue periferico con apparecchiature di laboratorio di serie e la loro successiva caratterizzazione mediante citometria a flusso e Western Blotting. L&#39;intero processo può essere eseguito in circa 2 ore, che faciliterà gli studi futuri sui profili MV nel sangue dei pazienti che sono necessari per valutare il potenziale di MV come biomarcatori di malattia.

Negli ultimi anni molti studi in vitro hanno dimostrato che le vescicole extracellulari (EV) svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare. Le cellule viventi capannone costantemente vescicole che si differenziano per dimensioni, contenuti e biogenesi. I veicoli elettrici più studiati sono esosomi che hanno origine dal sistema endosomal dove vengono memorizzati come vescicole endoluminali nei corpi multivesicular. Una volta che questi ultimi si fondono con la membrana plasmatica, le vescicole contenuti sono rilasciati come esosomi (Exos, diametro 30-100 nm 1). Una seconda popolazione di EV, che ha guadagnato crescente attenzione negli ultimi anni sono grandi microvescicole (MVS, diametro 100 - 1.000 nm) che germogliano fuori direttamente dalla membrana plasmatica 2. Entrambi i tipi di vescicole sono circondati da un doppio strato lipidico e contengono acidi nucleici, ad esempio, DNA, mRNA o miRNA 3 - 5, e una pletora di proteine che possono trasferire alla vicina cells. Mentre in generale la composizione proteica delle vescicole riflette lo stato della cella di origine, alcune proteine sembrano essere selettivamente mirati e arricchito su EVs 1. Uno dei principali interessi di ricerca è quello di caratterizzare i veicoli elettrici dalle cellule anormali e malate al fine di definire le firme EV specifici che potrebbero consentire l&#39;uso di veicoli elettrici come nuovi biomarcatori. Soprattutto nel cancro, in cui spesso il tumore stesso non è facilmente accessibile, biopsie liquidi destinati EVs tumore-specifici nel sangue potrebbero consentire il monitoraggio delle risposte terapeutiche o aiutare caratterizzare il tumore primario senza la necessità di procedure invasive 6. Infatti, i veicoli elettrici sono già stati isolati con successo da vari fluidi corporei, tra cui l&#39;urina 7, 8 CSF, il latte materno 9 o del sangue 10. Diversi studi identificati cambiamenti nella conta EV e la composizione di diverse malattie umane. Per esempio, in pazienti con sepsi numero di MV pro-coagulanti èsignificativamente aumentata rispetto ai soggetti sani 11. Anche in pazienti con grave malaria cerebrale un aumento della MV totale nel sangue può essere osservato e conti di MV di derivazione piastrinica correlano con la profondità coma e trombocitopenia 12. Altri studi riportano numeri elevati di vescicole endotelio-derivati in pazienti con lupus eritematoso sistemico o insufficienza cardiaca e, nel caso di quest&#39;ultima, questo correla con una maggiore probabilità di eventi cardiovascolari 13,14. In particolare nel cancro, i veicoli elettrici nel sangue sono attualmente discussi come nuovi biomarcatori con valore diagnostico e prognostico. I livelli di MV che esprimono proteine associati al tumore, come MUC1, EGFR o FAK sembrano essere elevati nel sangue di pazienti affetti da cancro al seno 15,16. Anche per Exos, recenti studi hanno dimostrato che Exos derivati ​​dal sangue che portano antigeni tumore-specifici, come Glypican-1 per il cancro del pancreas o Del-1 per il cancro al seno permette precoce della malattia deprotezione con elevata specificità e sensibilità 17,18. Inoltre, tumore siero derivato Exos può contenere DNA che può essere utilizzato per il rilevamento di mutazioni come KRAS e p53 che suggerisce il loro uso per la terapia previsione 19. I recenti progressi hanno dimostrato che l&#39;analisi di Exos nel sangue di pazienti con glioblastoma utilizzando uno specifico chip microfluidico consente il monitoraggio della terapia 20. Presi insieme, questi risultati implicano che l&#39;analisi di sottopopolazioni specifiche per la malattia di vescicole fornisce preziose informazioni circa diagnosi, prognosi così come le opzioni terapeutiche e il successo. Tuttavia, l&#39;isolamento e l&#39;analisi di Exos dal sangue è tempo, richiede attrezzature speciali laboratorio e quindi non è ancora adatto per diagnostica clinica di routine. Al contrario, gli MV possono essere isolati molto più veloce e, a causa della loro dimensione più grande, può essere facilmente analizzati mediante citometria di flusso senza la necessità di loro Coppia di perle di lattice, come è necessario per Exos 18, 21. Così, qui vi presentiamo un protocollo che può essere utilizzato per l&#39;isolamento standardizzato di MV da campioni di sangue e la successiva caratterizzazione di sottopopolazioni MV mediante citometria di flusso. Questo protocollo consente l&#39;ulteriore studio e in profondità caratterizzazione dei profili MV in grandi gruppi di pazienti che saranno richiesti per utilizzare gli MV per diagnostica clinica quotidiana.

<table><tbody><tr><td>butterfly needle (21 gauge)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin Fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust pH to 7.6</td></tr><tr><td colspan="4">For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and add 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>use 0.8 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>use 0.1 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD81 antibody</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA vacutainers for blood collection</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>heat-inactivated (30 min, 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfuge SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca and Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>perfusor syringe 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S staining solution</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5,000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>valve filter Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

Il rilascio di vescicole extracellulari (SVE) comprese le piccole exosomes endosomali-derivato (Exos, diametro &lt;100 nm) e microvescicole membrana derivata da plasma di grandi dimensioni (MV, diametro&gt; 100 nm) è un processo cellulare fondamentale che si verifica in tutte le cellule viventi. Queste proteine di trasporto vescicole, lipidi e acidi nucleici specifiche per il loro cellulare di origine e in vitro hanno evidenziato la loro importanza come mediatori di comunicazione intercellulare. I veicoli elettrici sono stati isolati con successo da vari fluidi corporei e, soprattutto, i veicoli elettrici nel sangue sono stati identificati come promettenti biomarcatori per il cancro o le malattie infettive. Per consentire lo studio delle sottopopolazioni MV nel sangue, presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento e la caratterizzazione standardizzata di MV da campioni di sangue periferico. MV sono in pellet da campioni di plasma EDTA-coagulato mediante centrifugazione differenziale e tipicamente possiedono un diametro di 100 - 600 nm. Grazie alla loro dimensione più grande, possonofacilmente essere studiato mediante citometria di flusso, una tecnica che viene normalmente usato in diagnostica clinica e disponibile nella maggior parte dei laboratori. Diversi esempi di test di controllo della qualità delle MV isolate saranno dati e gli indicatori che possono essere utilizzati per la discriminazione delle diverse sottopopolazioni MV nel sangue saranno presentati.

Al fine di quantificare il rendimento di MV che possono essere isolati seguendo il protocollo descritto, abbiamo calcolato la quantità di MV isolati da campioni di sangue di 10 donatori. La resa MV, che è stata valutata in un test di proteine Lowry, variava da 10 a 30 mg con una media di 19,2 ug MV al sangue mL (Tabella 1). La concentrazione di particelle determinata mediante analisi nanoparticelle inseguimento (NTA) varia da 1,66 x 10 9 al 2.36 x 10 10 con una media di 5,9 x 10 9 particelle per campione di plasma mL (Tabella 2). Ulteriore caratterizzazione dei MV di microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato una popolazione di vescicole con un diametro&gt; 100 nm che sono stati circondati da un doppio strato lipidico e non conteneva alcun organelli cellulari (Figura 1A). NTA confermato che la dimensione delle MV isolati variava da 100 a 600 nm (Figura 1B) e la dimensione media era MV 201nm (Figura 1C). Colorazione per tipici marcatori MT e Exo tramite Western Blotting dimostrato che i MV isolati sono risultati positivi per la tubulina e ha mostrato solo una leggera espressione di CD9 e CD81, mentre Exos sono risultati negativi per la tubulina e arricchito in CD9 e CD81 (Figura 2). Analisi delle MV isolate mediante citometria di flusso (figura 3A) ha rivelato una popolazione vescicole definita che potrebbe essere gated utilizzando gli stessi parametri normalmente utilizzati per MV isolati da surnatanti di coltura cellulare e che era chiaramente diverso dal segnale di fondo ottenuto dalla misurazione di PBS + 1% vescicole-esaurite FCS, senza aggiunta di MV (Figura 3B). Al fine di analizzare le diverse popolazioni MV presenti nel sangue, MV sono state colorate con indicatori stabiliti per le diverse popolazioni di cellule del sangue, ad esempio, CD62p per MVS derivazione piastrinica, CD45 per MVS leucociti-derivati, CD235a perMV e CD62E rosso sangue cellule-derivato per MVS derivati dalle cellule endoteliali (Figura 4). Questa caratterizzazione ha mostrato che la percentuale di sottopopolazioni MT differiva tra i campioni di sangue del donatore esaminati, mentre la maggior parte di MV sembrava essere versato dalle piastrine in tutti i campioni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Figura 1: Dimensioni Distribuzione di MV isolate da sangue periferico. A, MV isolati sono stati visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione. B, analisi inseguimento rappresentativa nanoparticelle (NTA) del MV illustrano la distribuzione delle dimensioni delle vescicole. C, La dimensione media MV da 10 preparati indipendenti è stata misurata mediante NTA (media). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere al</a>Versione Arger di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Figura 2: Caratterizzazione di MV isolato mediante Western Blotting. espressione della proteina differenziale sul MV isolati e Exos da due donatori è stato visualizzato mediante Western Blotting. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Figura 3: Analisi di MV mediante citometria di flusso. A, MV vengono prima visualizzati su avanti (FSC) rispetto sidescatter trame (SSC) per cancello sulla rispettiva popolazione di MV. Successivamente, queste MV si caratterizzano per l&#39;antigene di interesse da parte<html> utilizzando fluorescente anticorpi diretti contro l&#39;antigene. B, Tipica FSC rispetto piazzole SSC per MV isolate dal plasma di due donatori. Come confronto, una trama tipica per MVS derivati ​​dalle cellule tumorali da cellule del cancro del polmone A549 isolati dal surnatante coltura delle cellule così come un controllo negativo usando solo PBS + 1% vescicole-impoverito FCS senza MV vengono visualizzati sulla destra. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Figura 4: Caratterizzazione di MV isolati mediante citometria di flusso. MV da tre donatori sono state caratterizzate per l&#39;espressione di marcatori di cellule del sangue stabiliti (rosso) di citometria a flusso. I rispettivi controlli isotipo sono mostrati in grigio.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Campione </td><td> MV / ml di sangue [mg] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: MV proteine Yield da campioni di sangue periferico. </strong&gt; Visibile è la quantità di MV al sangue periferico mL che è stata elaborata a partire da 10 donatori. rendimenti MV sono stati quantificati mediante test Lowry. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Campione </td><td> MV / plasma mL [count particelle] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: MV particelle Yield da campioni di sangue periferico. </strong&gt; MV sono stati isolati da campioni di plasma di 10 donatori e conteggi delle particelle sono stati determinati con l&#39;analisi di nanoparticelle di monitoraggio. Viene mostrato il valore medio di tre misurazioni indipendenti.

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Views.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

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Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Ricerca

Biochimica

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides (MF) and S&#233;zary syndrome (SS) represent the most common subtypes. Despite a number of studies on characterizing gene expression, genetic alterations, and epigenetic abnormalities of CTCL, the molecular pathogenesis of MF/SS remains unclear. MF refers to the more common CTCL with a skin-predominance, and is usually limited to skin, whereas&#160;SS is an aggressive leukemic variant of CTCL with widespread skin involvement and is characterized by neoplastic distribution mainly involving blood, skin, and lymph node. Focusing on clinical practice, the identification of gene expression biomarkers has&#160;enormous potential to improve diagnosis and treatment of MF/SS. Indeed, recent transcriptomic studies have identified potential diagnostic biomarkers from differences in gene expression between normal and malignant T cells, which may improve our understanding of SS biology, and reveal potential therapeutic targets. This manuscript describes a detailed reproducible protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from fresh whole blood from patients diagnosed with SS, selection of CD4+ memory T cells (CD4+CD45RO+ T cells), chemical stimulation, and preparation of RNA suitable for transcriptomic profiling to discover novel prognostic molecular markers to gain additional insight in disease etiology. The stimulation using chemical agonist to activate nuclear regulation provides more specific assessment for pathways important in the dynamic transcription regulation and gene expression and eliminates confounding defects that may arise from upstream signaling defects arising from TCR antigen loss at the cell membrane. The data obtained from comparison of transcriptome of unstimulated to stimulated SS T cells unmasks functional regulatory gene expression defects not evident from analysis of quiescent unstimulated cells. Furthermore, the method outlined from this approach can be adapted for studying T cell gene expression defects in other T cell immune diseases.

We present a simple protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood obtained from patients diagnosed with S&#233;zary Syndrome, followed by selection of CD4+ T cells, their stimulation with phorbol12-myristate13-acetate and A23187 ionophore, and preparation of RNA for transcriptomic profiling.

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico umano e delle cellule T CD4+ da pazienti con sindrome di Sézary per la profilazione trascrittomica

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Ricerca sul cancro

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Bioingegneria

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Immunologia e infezioni

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medicina

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) containing immunologically active molecules. Knowledge regarding the molecular mechanisms of vesicle biogenesis, the content of the vesicles, and their functions at the pathogen-host interface is very limited. Addressing these questions requires rigorous procedures for isolation, purification, and validation of EVs. Previously, vesicle production was found to be enhanced when M. tuberculosis was exposed to iron restriction, a condition encountered by Mtb in the host environment. Presented here is a complete and detailed protocol to isolate and purify EVs from iron-deficient mycobacteria. Quantitative and qualitative methods are applied to validate purified EVs.

Mycobacterium tuberculosis shows increased production and release of extracellular vesicles in response to low iron conditions. This work details a protocol for generating low iron conditions and methods for the purification and characterization of mycobacterial extracellular vesicles released in response to iron deficiency.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

Biologia

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

<meta charset="utf8"></head><body>Studi sui biomarcatori cardiovascolari utilizzando il proteoma delle vescicole extracellulari plasmatiche

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento dell'analisi del proteoma delle vescicole extracellulari plasmatiche per gli studi sui biomarcatori cardiovascolari

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...