Un ringraziamento speciale a Kris Ngai e Jason Del Rio per il loro sostegno e l&#39;assistenza in questo progetto. Questo lavoro è stato supportato da RO1 concessione GM070676 di SPG.

I ceppi di mosche possono essere acquistati e amplificato in laboratorio. A seconda della quantità di flaconi di coltura di Drosophila ricevuti, una necessità di frequenti &#39;capovolgere&#39; i flaconi di coltura, una volta che le fiale ha raggiunto la capacità massima. L&#39;amplificazione prosegue fino a circa 50 flaconi di coltura di Drosophila sono riempiti. Si fa poi &#39;volare coppe&#39; con 100 ml bicchieri tricorno (Fly making cup è discusso nella prossima sezione). Dopo 24 ore, utilizzare gli embrioni da queste tazze di semi nuovi flaconi di coltura di Drosophila con il cibo volare apposta in fondo. A temperatura ambiente, il tempo di crescita per gli embrioni di Drosophila dagli embrioni durante la notte per intero le mosche coltivati ​​sono circa 8,5 giorni. Prioritari gli embrioni si schiudono dopo 12-15 ore nella prima fase delle larve. Le larve crescono per circa 4 giorni la muta due volte nella fase larve secondo e terzo, a 24 e 48 ore dopo la schiusa. Le larve quindi incapsulare in pupariums e presentare una metamorfosi quattro giorni fino a che emerge dalla tcasi erede pupa 1. Consentire una maggiore crescita per circa due o tre giorni in flaconi di coltura di Drosophila per aumentare la quantità di mosche in ciascuno di essi. Quando 400 fiale sono riempite, ci sarà una quantità sufficiente di mosche per cinquanta tazze deposizione delle uova (circa 1.000 mosche di sesso femminile per tazza). Le mosche bisogno di tempo per adattarsi al loro nuovo ambiente. Solitamente occorrono due giorni per loro per essere pronto per la raccolta, dopo essere stato trasferito alle tazze. Sostituzione piastre di agar quotidiano mantenere le tazze pulite mosca, che permettono di vivere più a lungo le mosche. (Per una maggiore comprensione della cura Drosophila e amplificazione, consultare Drosophila DB Roberts &#39;: A Practical Approach 2). Una buona fonte di ottenere grandi quantità di embrioni di Drosophila sono gabbie popolazione 3, che sono commercialmente disponibili. Il montaggio e la manutenzione delle gabbie popolazione può essere visto sul capitolo 5 e 7 nel libro Drosophila melanogaster: PUsi ractical nella cella e 4 Biologia Molecolare. Tuttavia, le gabbie di popolazione sono costosi e sono difficili da mantenere. Poiché gabbie popolazione può contenere una quantità abbondante di mosche, l&#39;uso di anidride carbonica è necessaria per il trasferimento e di alimentazione mosche. Come affermato prima, biossido di carbonio diminuisce la salute delle mosche, inducendoli non prevedere anche. Su scala piccola, 100 ml bicchieri tricorni può essere utilizzato. Con cinquanta bicchieri 100 ml, 9 grammi di embrioni dechorionated può essere raggiunta. Per rimuovere le mosche morte, pasta di lievito inutilizzata e altre impurità che abbiamo creato un collettore a doppio strato setaccio con maglie di dimensioni diverse. Uno trappole setaccio materiali indesiderati, come mosche morte pur consentendo di passare attraverso gli embrioni (350 micron dimensione dei pori). La seconda parte contiene una mesh (120 micron dimensioni dei pori), che si propone di cogliere embrioni di Drosophila e altre impurità passeranno attraverso le maglie. 1. Vola Preparazione Cup e di raccolta di embrioni <ol><li> Lanciarele mosche amplificati da più flaconcini in un flacone di plastica vuota, fino a quando la quantità di mosche hanno raggiunto un pollice di altezza della fiala. Poi, trasferire quelle mosche in un uovo 100 ml di raccolta cup (bicchiere Tricon con nylon finestre a maglie). Tenere la coppa battendo su una superficie dura per impedire la fuga durante il trasferimento delle mosche mosche. Coprire tazza con pasta di lievito piastra contenente agar e consentire 24-48 ore di tempo di stabilizzazione. </li><li> Raccogliere piastre di agar notte da cinquanta tazze mosca e lavare i contenuti delle piastre al catcher setaccio con un pennello pulito vernice e acqua corrente. Flesh gli embrioni nel setaccio con abbondante acqua fino a quando tutta la pasta di lievito viene lavato via. </li><li> Dechorionate gli embrioni puliti immergendoli in 50% candeggina per 3 min. </li><li> Sciacquare con acqua distillata molto fino a quando gli embrioni liberi l&#39;odore di candeggina. Asciugare quindi la rete con gli embrioni mettendolo sui tempi di asciugamani piegati ac multipli. Trasferire gli embrioni in una fiala pulita e registrare il peso. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Embryo Omogeneizzazione e Chiarimenti <ol><li> Mettere gli embrioni dechorionated in Dounce omogeneizzatore con 1,5 x volume di ghiaccio-freddo tampone di estrazione. </li><li> Do 5 colpi con il pestello allentata. Aliquotare l&#39;omogeneizzato in provette pulite. Centrifugare a 15000 g per 40 min. a 4 ° C. </li><li> Raccogliere accuratamente il liquido chiaro sopranatante senza lo strato lipidico bianco superiore o inferiore del pellet. </li><li> Trasferire il supernatante per pulire provette e centrifugare a 50.000 g per 30 min. a 4 ° C </li><li> Risultante ad alta velocità supernatante raccolto come spiegato sopra possono essere utilizzati immediatamente o può essere scatto congelate e conservate a -80 ° C per mesi. </li></ol> 3. Microtubuli di polimerizzazione e Kinesin Binding <ol><li> Scongelare il congelate ad alta velocità supernatante a temperatura ambiente. Per polimerizzare microtubuli, aggiungere GTP (0,3 mM) e taxolo (20 pM) e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 20 min inun agitatore rotante. </li><li> Per associare chinesina, aggiungere 2,5 mM ATP nonhydrolyzable analogico 5&#39;-ciclasi imidodiphosphate (AMPPNP), seguito da un&#39;agitazione di 10 minuti a temperatura ambiente in un agitatore rotante. </li></ol> 4. Sedimentazione differenziale dei microtubuli e Kinesin <ol><li> Sedimento attraverso un cuscino uguale volume di saccarosio (20% di saccarosio e 10 pM taxolo in tampone di estrazione) tramite centrifugazione a 23.000 g (sw41ti rotore, TLS-55) per 30 min. a 4 ° C. </li><li> Lavare pellet mediante risospensione in 10% dei volumi omogenato in tampone di estrazione contenente 10 taxolo pM e 75 mM NaCl. </li><li> Ripetere la sedimentazione con un altro cuscino uguale volume di saccarosio come nel passaggio 4,1. </li><li> Risospendere pellet di lavaggio sale in tampone di estrazione 5% con 20 pM taxolo, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, e 10 mM ATP. </li><li> Sedimenti a 120.000 g (sw41ti rotore: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) per 20 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante (chinesinafrazione). </li><li> Eseguire una filtrazione centrifuga a 14.000 g per 15 min a 4 ° C. Recupero campione concentrato e ripetere filtrazione con un filtro nuovo come sopra per 30 minuti e raccogliere il campione concentrato. </li><li> Eseguire un saggio di proteina per determinare la concentrazione. Brevemente, variando le concentrazioni di una proteina nota (albumina sierica bovina; BSA) è stata miscelata con un volume noto di reagente di Bradford e misurata la densità ottica alla lunghezza d&#39;onda di 595nm. Poi una densità ottica trattamento standard curva di concentrazione è stato stabilito per calcolare la concentrazione sconosciuta di chinesina frazione purificata utilizzando la densità ottica di questo campione misurato in condizioni simili a quella dei campioni standard di BSA. Gel elettroforesi nonché western blotting è stato effettuato anche una quantità nota della chinesina purificato. </li><li> Chinesina frazione Aliquotare in piccoli volumi di concentrazione desiderata e congelare a scatto in azoto liquido per conservare a -80 ° C. </li></ol> A tutta lunghezza Kinesina funzionale è stato purificato da embrioni di Drosophila. Figura 1 illustra il gel colorato argento mostra le frazioni differenti durante la purificazione. Corsia 1 è un esempio del surnatante dopo la chiarificazione alta velocità (passo 2,5), corsia 2 è un esempio di pellet dopo chiarificazione, corsia 3 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione primo cuscino saccarosio (punto 4.1), corsia 4 è un campione del pellet dopo la sedimentazione prima, corsia 5 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione secondo (passo 4,3), corsia 6 è un esempio di pellet dopo la sedimentazione secondo, corsia 7 è un esempio di pellet di la sedimentazione finale (punto 4.5), corsia 8 è il campione chinesina purificato, corsia 9 è il campione chinesina filtrato, e Lane 10 è il marcatore. La band concentrato sulla corsia di 8 e 9 a circa 115 kD è chinesina pesante catena 1, che è coerente con Figure 1, corsia 8 della carta Saxton pubblicato nel 1988 5. figura 2 rappresenta il blot c occidentale della frazione purificata chinesina rilevato usando l&#39;anticorpo chinesina catena pesante. L&#39;anticorpo AKINO1-A non influisce significativamente cross-reagiscono con gli altri membri della famiglia chinesina 6. Si noti che anche se questo protocollo si traduce in una buona fonte di chinesina funzionale, mentre la frazione è arricchito per kinesina-1, ci sono probabili agenti contaminanti, tra cui potenzialmente kinesine altre proteine ​​a motore. Abbiamo rimosso una varietà di contaminanti più piccoli per filtrazione. Per quanto riguarda la rimozione altri motori che non può essere fatto da sola dimensione, la purificazione è simile a quanto fatto da altri per studiare chinesina 7, e crediamo che la maggioranza del motore attivo è Kinesina-1, ma la purificazione più sofisticati permetterebbe la rimozione di contaminanti motore potenziali, come è stato fatto da Cole et al 8 e Saxton et al. 9 </p&gt; La processività della chinesina è stata valutata mediante test in vitro microtubuli singola molecola legante, come descritto più in dettaglio nel libro di Scholey intitolato &quot;Assay motilità per Motor Proteins&quot; 10. Brevemente, perle di polistirene con un solo motore attivo sono stati portati in contatto con i microtubuli, in presenza di saturazione (1 mm) ATP. Il motore collegato al microtubulo, e cominciò a camminare di distanza dal centro della trappola laser. In un predefinito spostamento del tallone dal centro trappola (100 nm) la potenza del fascio laser è automaticamente disattivata, consentendo al motore a percorrere il MT sotto vuoto. Il film mostra un diametro di 500 nm tallone con chinesina singola a piedi lungo MT. La lunghezza della schermata video corrisponde a 20 micron. Figura 3 rappresenta la distribuzione misurata di run-lunghezze per singola lunghezza intera Drosophila molecole chinesina, purificato secondo il protocollo qui presentata. Il EXPOnential adatta alla distribuzione fornisce la runlength media singola chinesina 1,55 ± 0,1 micron e 1.28 ± 0.12 micron per il campione filtrato e non filtrato, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 gel colorato d&#39;argento delle frazioni purificate:. Campioni provenienti da ciascuna frazione sono stati eseguiti in un gel al 10%. 10 pg di proteina è stato caricato in ciascuna corsia. Corsia 1 è un esempio del surnatante dopo la chiarificazione alta velocità (passo 2,5), corsia 2 è un esempio di pellet dopo chiarificazione, corsia 3 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione primo cuscino saccarosio (punto 4.1), corsia 4 è un campione del pellet dopo la sedimentazione prima, corsia 5 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione secondo (passo 4,3), corsia 6 è un esempio di pellet dopo la sedimentazione secondo, corsia 7 è un esempio di pellet di la sedimentazione finale (punto 4.5), corsia 8 è il chinesina purificatacampione, corsia 9 è la chinesina filtrato usando un 100 kD cut-off Amicon ultra filtro centrifugo 0,5 ml (Millipore, USA). Le frecce blu indicano le proteine ​​i cui importi sono diminuiti e la freccia rossa indica la concentrazione degli chinesina a causa della fase di filtrazione centrifuga utilizzata nel presente protocollo. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="Figura 2" /> . Figura 2 frazione purificata KHC cancellato contro l&#39;anti-anticorpo chinesina: purificato campione chinesina stata sottoposta ad elettroforesi su gel e cancellati (in membrana di nitrocellulosa) contro l&#39;anticorpo primario AKINO1-A (1:1000 in TBST) per 1 ora a temperatura ambiente seguita da incubazione in Donkey-anticorpo anti-coniglio (1:10.000 in TBST) per un&#39;ora a temperatura ambiente. An (chemiluminescente) ECL kit è stato utilizzato per rilevare il segnale di chinesina mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. </strong&gt; RunLength e velocità di una singola lunghezza chinesina Drosophila completa: (A) e (B) RunLength e la velocità del campione chinesina filtrato. (C) e (D) runlength e la velocità di campione filtrato chinesina. Figura 4. Video della motilità chinesina. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il video</a> .

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Cervello bovino è il materiale più ampiamente usato per purificare partenza 11 full-length chinesina, sebbene cervello murina è stato usato come pure 12. Un grande svantaggio di utilizzare cervello bovino come fonte chinesina è la disponibilità di fresco materiale di partenza: macelli sono tipicamente inaccessibili, e il cervello deve essere estremamente fresca per ottenere chinesina attivo. Inoltre, solo il cervello dei giovani mucche sono efficaci. Infine, la manipolazione genetica delle vac...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo, o materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Agar (granulato) </td><td> Pescatore </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio (D-glucosio) anidro </td><td> Pescatore </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre di Petri </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> Style 60x15mm (Poliestere) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila Culture Vials </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tricorno beaker </td><td> Econo Lab Inc. </td><td> B700-100 </td><td> Volume: 100ml, Dimensioni: 58x72mm </td></tr><tr><td> Lievito </td><td> Red Star </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon Mesh </td><td> Genesse Scientific </td><td> 57-102 </td><td> 120 micron dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Nylon Mesh </td><td> Parti piccole </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (anidro) </td><td> Pescatore </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> AprotOnin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP analogico 5&#39;-ciclasi imidodiphosphate </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Filtri ultracentrifugo: 0,5 mL, 100kD tagliati, 8 confezioni </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

Proteine ​​motrici si muovono carichi lungo i microtubuli, e trasportarli a specifiche sub-cellulari località. Poiché il trasporto alterato viene suggerito alla base di una varietà di malattie neurodegenerative, la comprensione dei microtubuli dei trasporti basata motore e la sua regolamentazione probabilmente in ultima analisi, portare ad un miglioramento degli approcci terapeutici. Kinesina-1 è una proteina eucariotica motore che si muove in una direzione anterogrado (più-end) lungo i microtubuli (MT), alimentato da idrolisi di ATP. Qui riportiamo un protocollo dettagliato di purificazione per isolare attivo chinesina lunghezza intera da embrioni di Drosophila, consentendo così la combinazione di Drosophila genetica con una singola molecola studi biofisici. A partire da circa 50 tazze di posa, con circa 1000 femmine per tazza, abbiamo effettuato le collezioni durante la notte. Questo ha fornito circa 10 ml di embrioni confezionati. Gli embrioni sono stati candeggina dechorionated (producendo circa 9 grammi di embrioni), e quindi omogeneizzato. After interruzione, l&#39;omogenato è stato chiarificato mediante una rotazione a bassa velocità seguita da una centrifugazione ad alta velocità. Il supernatante è stato trattato con chiarito GTP e taxolo a polimerizzare MT. Chinesina è stato immobilizzato su polimerizzato MTs aggiungendo la analogico ATP, 5&#39;-ciclasi imidodiphosphate a temperatura ambiente. Dopo kinesina vincolante, microtubuli sono sedimentate tramite centrifugazione ad alta velocità attraverso un cuscino di saccarosio. Il pellet microtubulo è stata poi ri-sospeso, e questo processo è stato ripetuto. Infine, ATP è stato aggiunto per rilasciare la chinesina dal MT. Centrifugazione ad alta velocità poi centrifugati la MT, lasciando la chinesina nel supernatante. Questo chinesina è stato sottoposto ad una filtrazione centrifuga 100 utilizzando un cut off KD filtro per ulteriore purificazione, frazionare, congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. SDS gel elettroforesi e western blotting è stato eseguito utilizzando il campione purificato. L&#39;attività motoria dei campioni purificati prima e dopo la fase finale di filtrazione centrifugaè stata valutata utilizzando un saggio in vitro singola molecola microtubuli. Le frazioni chinesina prima e dopo la filtrazione centrifuga mostrato processività come precedentemente riportato in letteratura. Ulteriori esperimenti sono in corso per valutare l&#39;interazione tra chinesina e altre proteine ​​di trasporto correlate.

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Questo è un protocollo per isolare attiva Kinesin piena lunghezza da<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni per la singola molecola studi biofisici. Mostriamo come raccogliere gli embrioni, fare il lisato embrione, e quindi polimerizzare i microtubuli (MTS). Chinesina è purificato per immobilizzare sul MTS, riducendo la velocità dei Kinesin-MT complessi, e quindi rilasciare il chinesina dalla MTS tramite aggiunta ATP.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K Views.  University of California, Irvine. Questo è un protocollo per isolare attiva Kinesin piena lunghezza da Drosophila Embrioni per la singola molecola studi biofisici. Mostriamo come raccogliere gli embrioni, fare il lisato embrione, e quindi polimerizzare i microtubuli (MTS). Chinesina è purificato per immobilizzare sul MTS, riducendo la velocità dei Kinesin-MT complessi, e quindi rilasciare il chinesina dalla MTS tramite aggiunta ATP.

Video: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Ricerca

Biologia

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imaging verticale di Drosophila Embrioni

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti<em&gt; Drosophila</em&gt; Teste

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...