Questo protocollo facilita l'identificazione e l'isolamento delle popolazioni di cellule coralline vive a un livello di descrizione non precedentemente possibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'accesso a un livello di specificità cellulare che fino ad ora è stato per lo più irraggiungibile. A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Shannon Saigh, un'associazione di ricerca della risorsa condivisa di citometria a flusso presso il Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Per impostare il citometro di flusso per l'ordinamento delle celle di corallo vive, aprire un nuovo modello di progetto nel software del citometro a flusso e selezionare i laser appropriati per l'analisi nel pannello laser. Quindi, create un grafico a dispersione laterale rispetto a quello forward nei grafici appropriati per impostare la strategia di gating e analisi. Per l'analisi citometrica del flusso e lo smistamento delle cellule coralline vive, caricare il campione di cellule non contaminate di controllo nella camera campione del citometro e avviare il processo di lettura.
Poiché le cellule coralline sono particolarmente fragili, mantenere bassa la pressione del citometro per prevenire la llisi cellulare. Nel grafico a dispersione, regolare la tensione del moltiplicatore di foto per centrare i punti e iniziare a registrare gli eventi. Nel grafico a dispersione avanti contro laterale, create un gate attorno alle celle intorno al 10-4° segno sull'asse x a dispersione in avanti.
Sostituire l'esempio di controllo con il primo campione di celle macchiate e registrare circa 10.000 celle prima di fermarsi. Quindi eseguire il gate degli eventi univoci per il gruppo di campioni macchiato. Per ordinare le cellule coralline vive, dopo aver selezionato la popolazione cellulare di interesse nel software del citometro di flusso, posizionare un tubo di microcentrifugo contenente da 250 a 500 microlitri della soluzione di raccolta appropriata nella camera di raccolta del citometro per ogni popolazione da ordinare.
Una volta che è passata una quantità appropriata di tempo per eliminare i detriti, inizia a ordinare la popolazione desiderata da raccogliere ovunque da 10.000 a diversi milioni di cellule. Ogni volta che viene utilizzata una nuova macchia, specie o cernita, ordinare almeno 20.000 cellule di interesse in 500 microlitri di mezzo di colorazione per consentire l'esecuzione di un controllo di purezza sulla popolazione di interesse e rianalizzare le celle ordinate per confermare che gli eventi vengono letti all'interno del cancello utilizzato per lo smistamento iniziale. Per gli studi in vitro, conservare le cellule ordinate sul ghiaccio fino a quando non vengono trasferite in un'incubatrice o in un ambiente sterilizzato.
Per introdurre altre particelle non cellulari che non condividono la stessa forma o granularità delle cellule coralline, è possibile rimuovere dall'analisi creando una selezione di gate su un grafico a dispersione avanti e laterale. Le cellule morte possono essere escluse confrontando il segnale DAPI delle sospensioni cellulari non macchiate e macchiate usando un istogramma e snodiando le cellule ad alta esprimezione DAPI. In parallelo, le cellule che ospitano la simbiodeneasia dell'autofluorescenza possono essere rimosse sgando contro le cellule con il segnale alto nel canale rosso lontano.
Dopo questo processo di gating iterativo, le cellule rimanenti rappresentano le popolazioni intatte di cellule coralline vive prive di simbiodeneasia. Queste cellule possono quindi essere classificate in sottopopolazioni cellulari diverse macchiando caratteristiche quali l'attività reattiva delle specie di ossigeno e/o il contenuto di lisosomio. È fondamentale ricordare che alcune cellule sono più fragili di altre ed eseguire questo processo con la massima attenzione possibile.
Una volta isolate, cellule specifiche possono essere utilizzate per saggi funzionali x-vivo come la creazione di colture cellulari e la creazione di profili trascritomici.
