Vorremmo ringraziare le seguenti persone senza il cui aiuto la collezione di tessuti pino non sarebbe stato possibile: Dr. Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, e Amanda Bouffier.

Parte 1: Harvest Albero Dopo che l&#39;albero viene selezionato e abbattuto, è importante lavorare con la stessa cura e il più rapidamente possibile. Come ogni tipo di tessuto diverso è raccolto, che dovrebbe essere messo immediatamente in loro pescherecci azoto liquido per evitare qualsiasi contaminazione del materiale del campione. Questo protocollo di isolamento del RNA è scalabile. <ol><li> Tagliare i bulloni in lunghezze di circa 0,5-0,75 metri e con un punteggio motosega la corteccia in due o tre posti dopo l&#39;asse longitudinale del bullone. </li><li> Utilizzando uno scalpello in legno, opera ai margini della regione ha segnato fino a quando la corteccia comincia a separare dal legno e continuare a lavorare lo scalpello mentre si tira indietro sulla parte di corteccia fino a quando non separa completamente dal fusto. </li><li> Xilema secondario viene raccolto con un regolo, rasoio solo lato raschiando lungo l&#39;asse longitudinale del bullone che è stato spogliato della corteccia. Guanti in lattice per minimizzare la contaminazione del tessuto. </li><li> Floema, che si trova sul lato interno delle sezioni corteccia, viene prontamente raccolto da manuale peeling. </li><li> Legno di reazione viene raccolto dalla parte inferiore degli arti dopo aver segnato con vernice spray per indicare il loro orientamento originale rispetto al suolo. </li><li> Gli arti sono tagliati in rotoli di m 1-2 e segnato ai lati opposti lungo l&#39;asse longitudinale secondo la posizione approssimativa dei due tipi di legno di reazione: legno opposto (sul lato superiore dell&#39;arto) e legno di compressione (sul fondo lato dell&#39;arto). La corteccia è separato dal arto, come descritto sopra, eccetto che solo la corteccia copre ogni tipo di legno di reazione viene rimosso in una sola volta. Xilema o floema secondario viene poi raccolto come sopra descritto e posto in azoto liquido. </li><li> Altri campioni, come aghi, suggerimenti sparare e coni giovani, possono essere raccolte a mano o usando forbici come richiesto. </li><li> Campioni raccolti congelati in azoto liquido deve essere posto in sacchi marcati o contenitori idonei e confezionati in ghiaccio secco per tornare spedizione al laboratorio. </li></ol> Parte 2: Mulino di elaborazione congelatore dei campioni <ol><li> Riempire il serbatoio Spex 6850 mulino congelatore con azoto liquido e posizionare la barra di impatto in una delle fiale di macinazione e riempire con azoto liquido pre-chill. Eliminare azoto liquido e aggiungere campione flaconcino. </li><li> Assicurarsi che nessun eccesso di azoto liquido resta nella camera di fresatura e che il gas azoto in eccesso viene scaricata completamente prima che il tappo è seduto per sigillare la camera. </li><li> Inserire la fiala di rettifica nel supporto e chiudere. </li><li> Campioni legnosi mulino per due cicli di 1 minuto / ciclo a un&#39;impostazione di velocità di 14. </li><li> Utilizzare una spatola di azoto liquido refrigerato per rimuovere l&#39;esempio lavorato (farina di legno) in un bicchiere che è stato pre-refrigerati e contiene una piccola quantità di azoto liquido. </li><li> Versate il liquido di azoto / campione impasto in un contenitore e luogo di stoccaggio a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> Parte 3: Isolamento di RNA, Giorno 1 <ol><li> Mettere 20 mL di tampone di isolamento di RNA in un tubo ricoperto 50mL Falcon e aggiungere 400 microlitri β-mercaptoetanolo, vortice brevemente, poi il calore in un bagno d&#39;acqua a 60 ° C. </li><li> Aggiungere 4 g di tessuto congelato ad ogni provetta. Tappo e agitare vigorosamente a mano seguita da vortex per 10 secondi. </li><li> Aggiungere un uguale volume di cloroformio al tubo e capovolgere delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo su una ruota in movimento e permettono end-over-end mescolando per 5 minuti. </li><li> Decantare la miscela in un tubo da 50 ml Ridge Oak e centrifugare a 12.000 (17.200 xg) giri in un angolo fisso rotore SS34 per 5 minuti. </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta Oak Ridge e aggiungere un mezzo volume di cloroformio. </li><li> Vortex per 1 minuto e continuare a mescolare su una ruota girevole per 5 minuti. Centrifugare a 12.000 giri (17.200 xg) in un rotore SS34 angolo fisso per 5 minuti. </li><li> Trasferire la fase acquosa a tubo fresco di Oak Ridge e aggiungere un mezzo volume di cloroformio. Vortex per 1 minuto. Centrifugare a 12.000 giri (17.200 xg) in un rotore SS34 angolo fisso per 10 minuti. </li><li> Trasferire la fase acquosa in un tubo 50 ml in polipropilene ad alta velocità. Centrifugare a 10.000 rpm (11.900 xg) in un rotore SS34 angolo fisso per 20 minuti. </li><li> Surnatante decantare in tubo da 50 ml Falcon e aggiungere un quarto volume di 10 M soluzione di LiCl di supernatante. Mescolare brevemente nel vortex e posto a 4 ° C per le precipitazioni durante la notte. </li></ol> Parte 4: RNA Isolamento, Giorno 2 <ol><li> Calore tampone SSTE in un bagno d&#39;acqua a 65 ° C prima di iniziare. </li><li> Versare il LiCl precipitato a campione in un tubo di polipropilene e pellet l&#39;RNA mediante centrifugazione a 11.000 rpm in un rotore SS34 angolo fisso (14.450 xg) per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione,versare al largo e gettare il liquido, e invertire i tubi in Kimwipes per circa 1 minuto. Pipetta fuori qualsiasi surnatante rimanente. </li><li> Risospendere ogni pellet in 800 ml di SSTE riscaldata utilizzando una pipetta per mescolare completamente i campioni. Trasferire il campione risospeso in 2 mL Ambion RNasi-free tubi microcentrifuga. </li><li> Campioni di calore a 65 ° C per 2 minuti, seguita da vortex vigorosa per garantire la completa risospensione. </li><li> Aggiungere un uguale volume di fenolo-cloroformio, pH8, ad ogni provetta. Vortex ogni campione per 30 secondi e poi girare in una microcentrifuga a 14.000 giri al minuto per 3 minuti </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova Ambion 2 ml RNasi-free tubi microcentrifuga, e aggiungere un uguale volume di cloroformio. Vortex ogni campione per 30 secondi e spin in microcentrifuga a 14.000 giri al minuto per 3 minuti. </li><li> Trasferimento fase acquosa alla fase-Lock Gel tubi che sono stati precedentemente preparati da microfuging a 11.000 rpm per 2 minuti. Aggiungere un mezzo volume di cloroformio e mescolare delicatamente pipetta. </li><li> Centrifugare a 11.000 rpm per 5 minuti e trasferire la fase acquosa a fresco 2 ml Ambion RNasi-free tubi microcentrifuga. </li></ol> Parte 5: RNA Precipitazioni e Wash Etanolo <ol><li> Aggiungere 50 microlitri di acetato di sodio 3,0 M, pH 4.8, e 1 mL di etanolo al 100% alla fase acquosa. E precipitare nel vortice -80 ° C per 30 minuti o tutta la notte a -20 ° C. </li><li> Campioni microcentrifuga a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, e con attenzione aspirare il sopranatante. Non disturbare il pellet. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di RNA a -20 ° C il 70% (v / v) di etanolo. Microcentrifuga a 14.000 rpm per 1 minuto e aspirare fuori l&#39;etanolo. </li><li> Ripetere il punto 5.3. </li><li> Stappare i tubi e aria secca pellet in panchina per 3-5 minuti. </li></ol> Parte 6: Resuspension finale e quantificazione <ol><li> Risospendere ogni pellet in 100 l DEPC-acqua trattata. Mescolare nel vortex e incubare le provette a 65 ° C per 2 minuti prima dell&#39;immissione sul ghiaccio. Ripetere se necessario per garantire la risospensione del campione. </li><li> Piscina come campioni se lo si desidera e fare 50 ml di una diluizione 1:10 in 10mM Tris, pH 7,5, per la quantificazione spettrofotometrica. Rapporti di assorbanza per 260/280 e 260/230 sono in genere superiori a 2.1 e 2.2, rispettivamente. RNA gamma isolamento rese dal 60-120μg / g di tessuto congelato. </li><li> Analizzare campioni eseguendo 1,5-2,5 mg di RNA su un 1% gel in tampone TAE. Per ulteriori campioni sensibili, analizzare la RNA utilizzando un Agilent 2100 Bioanalyzer secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Rendimenti isolamento RNA da diversi tessuti gamma di conifere 60-120 mcg / g tessuti congelati con i campioni legnosi tipicamente cedendo circa 70-80g / g di tessuto congelato. Rapporti di diagnostica di 260/280 e 260/230 sono entrambi di solito maggiore di 2.1, e sono buoni indicatori che il campione di RNA è priva di qualsiasi significativa fenoliche o contaminazione carboidrati, rispettivamente. I campioni analizzati mediante elettroforesi su gel seguita dalla colorazione EtBr dovrebbe mostrare tre fasce distinte per 25S, 18S e 5S RNA (Figura 1). Determinazione della stechiometria del 28S a 18S su gel di agarosio è un po &#39;soggettiva, e fattori quali condizioni di funzionamento per il gel, colorazione, e caricare campioni possono avere un effetto. In generale, il 28S: rapporto 18S appare essere&gt; 1,5. Tuttavia, alcuni campioni di conifere hanno minore. Per esempio, a seguito di Agilent 2100 analisi abbiamo visto diversi casi di campioni di conifere da diversi tipi di tessuto in cui la stechiometria è più vicino a 1,2:1. Così, un apparente basso 28S: 18S stechiometria mediante elettroforesi su gel di agarosio non è necessariamente indice di scarsa qualità del campione. Foglia, sparare, e campioni di cono spesso avrà ulteriori bande distinte presenti a causa di cloroplastica RNA ribosomiale. EtBr macchiati di materiali che non migrare dal pozzetto o alto peso molecolare bande (&gt; 8-10 kb) di solito indice di contaminazione di DNA genomico (Figura 2). A basso peso molecolare strisci in prossimità di o al di sotto della band 5S e ridotta colorazione banda ribosomiale 18S o un apparente&gt; stechiometria 28S è un buon indicatore che la degradazione dell&#39;RNA è verificato (Figura 3). Nell&#39;analisi 2100 elettroferogramma Agilent, la linea di base deve essere bassa e relativamente liscia con picchi principali corrispondenti a 18S e 28S RNA ribosomiale 28S avere: rapporti 18S che vanno ovunque da 1.2 alla 2.0. L&#39;integrità Agilent RNA Numero (RIN) valore può essere un migliore indicatore di qualità RNA e deve essere di almeno 7 o maggiore per RNA che deve essere utilizzato per la preparazione degli obiettivi microarray. La Figura 4 mostra una tipica Agilent 2100 elettroferogramma per RNA xilema con un 28S: rapporto 18S pari a 1,4 e un valore RIN di 8,6 mentre la Figura 5 mostra una xilema povero RNA avere una preparazione di base molto alta e il degrado evidente come rivelato dal 28S: 18S rapari a 0,65 e un valore di 3,4 RIN Tio. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Agarosio analisi gel di alta qualità RNA pino. Corsia 1, NEB 1 KB standard, corsia 2 mostra un tipico totale isolamento di RNA da xilema loblolly pino secondarie con caratteristiche ribosomiale 28S, 18S e 5S bande e apparente 28S: rapporto 18S&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Analisi gel agarosio di campioni di pino RNA contaminato da DNA genomico. Corsia 1, NEB 1 KB standard, Lane 2, xilema campione di RNA che mostra la contaminazione di DNA genomico. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Gel di agarosio analisi del campione di pino che mostra la degradazione dell&#39;RNA e la contaminazione con il DNA genomico. Corsia 1, NEB 1 KB standard, Lane2, xilema campione di RNA che mostra la contaminazione di DNA genomico e grave degradazione dell&#39;RNA. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Agilent 2100 elettroferogramma di RNA totale xilema isolato con il metodo descritto su xilema loblolly pino. 28S: rapporto 18S è uguale a 1,4, valore uguale a 8,6 RIN <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Agilent 2100 elettroferogramma di RNA punta apicale totale mostrando grave degrado e contaminazione genomico. 28S: rapporto 18S è uguale a 0,65, valore uguale a 3,4 RIN

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

Ottenere di alta qualità RNA da specie di conifere può essere un compito difficile, visti gli elevati livelli di composti fenolici e polisaccaride che si trova nei tessuti legnosi. A partire dal protocollo sviluppato da Chang et al. (1), abbiamo trovato che l&#39;estrazione più rigorosa e ripulire gradini conducono all&#39;isolamento coerente di altissima qualità RNA totale da woody diversi e non-tessuti legnosi campionato da una grande varietà di specie di conifere. Questo video ha dimostrato non solo il nostro pr...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

Tessuti isolati da specie di conifere, in particolare quelli appartenenti alla famiglia delle Pinaceae, come il pino loblolly (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contengono alte concentrazioni di composti fenolici e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione di RNA. Isolamento di alta qualità RNA da queste specie richiede rigorose procedure di tessuto raccolta sul campo e l&#39;impiego di un protocollo di isolamento del RNA costituito da più fasi di estrazione organica al fine di isolare l&#39;RNA di qualità sufficiente per microarray ed altre analisi genomiche. L&#39;isolamento di alta qualità RNA da campioni raccolti sul campo pino loblolly può essere impegnativo, ma diverse modifiche ai tessuti standard e procedure di isolamento dell&#39;RNA migliorare notevolmente i risultati. Il grado di degradazione dell&#39;RNA generale aumenta se i campioni non sono adeguatamente raccolti e trasportati dal campo, specialmente durante grandi raccolti. Totale rendimenti RNA può essere aumentato in modo significativo da campioni polverizzando in un mulino di azoto liquido congelatore prima di RNA isolamento, soprattutto se i campioni provengono da tessuti legnosi. Ciò è dovuto principalmente alla presenza di agenti ossidanti, come i composti fenolici e polisaccaridi che sono entrambi presenti ad alti livelli in estratti dai tessuti legnosi di specie più conifere. Se non rimosso, questi contaminanti possono riportare le porta a problemi, come l&#39;RNA degradazione, che si traducono in basse rese e un povero campione di qualità RNA. Riporto di composti fenolici, così come polisaccaridi, può anche ridurre o persino eliminare completamente l&#39;attività della trascrittasi inversa o altre polimerasi comunemente utilizzato per la sintesi del DNA. In particolare, l&#39;RNA destinati ad essere utilizzati come modello per doppio filamento sintesi di cDNA per la generazione di librerie di cDNA a singolo filamento la sintesi del DNA per PCR o qPCR, o per la sintesi di materiali bersaglio di microarray deve essere di ottima qualità se i ricercatori si aspettano per ottenere risultati ottimali. Tecniche di isolamento dell&#39;RNA comunemente impiegato per molte altre specie di piante sono spesso insufficienti nella loro capacità di rimuovere questi contaminanti da campioni di conifere e quindi non resa totale campioni di RNA adatto per le manipolazioni a valle. In questo video ci dimostrano i metodi per la raccolta settore dei tessuti di conifere, iniziando con l&#39;abbattimento di un quarantenne albero, per la raccolta di floema, xilema secondario, e il legno xilema reazione. Abbiamo anche dimostrare un protocollo di isolamento di RNA che ha sempre prodotto di alta qualità RNA per le successive manipolazioni enzimatiche.

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An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Tessuti vegetali, tra cui floema e xilema di pino loblolly (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contengono alti livelli di fenoli e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione di RNA. Questa presentazione discute le tecniche per la raccolta del campo coltivato tessuti e l&#39;isolamento di RNA di qualità sufficiente per microarray e analisi genomiche di altri.

Un metodo migliorato di isolamento dell&#39;RNA da Pino Loblolly ( P. taeda L.) e altre specie di conifere

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

13.7K Views.  University of Georgia (UGA). Tessuti vegetali, tra cui floema e xilema di pino loblolly ( Pinus taeda L.), contengono alti livelli di fenoli e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione di RNA. Questa presentazione discute le tecniche per la raccolta del campo coltivato tessuti e l'isolamento di RNA di qualità sufficiente per microarray e analisi genomiche di altri.

Video: An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

L&#39;elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Ricerca

Biologia

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...