We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Questo protocollo e il video hanno lo scopo di servire come un compagno per la carta originale che descrive il pacchetto software in modo più dettagliato 4, così come la relazione tecnica che accompagna il download del software sul sito web di Danuser Lab. I lettori sono invitati a rivedere questi documenti con attenzione se ci sono domande supplementari per quanto riguarda l&#39;utilizzo del software. 1 Prima di Image Analysis <ol><li> Convertire ogni filmato time-lapse in una sequenza di TIFF (Tagged Image File Format) file di immagine. Se ci sono più coni di crescita / cellule in un determinato film, primo raccolto ogni cono di crescita / cellulare per creare la propria sequenza di immagini. Nota: Questo non è necessario, in quanto possono essere selezionati singole regioni-di-interesse (ROI) entro plusTipTracker. Tuttavia, utilizzando dimensioni immagine inferiori aumenta la velocità del trattamento computazionale, quindi questo passaggio è consigliata in caso di notevole spazio vuoto nell&#39;immagine. </li><li> Salva ogni serie TIFF nel propriocartella chiamata &quot;images&quot; all&#39;interno di un percorso che MATLAB è impostato su Accesso (notare che &quot;le immagini&quot; è case-sensitive). Per aggiungere un nuovo percorso, passare alla directory del file corrispondente nella finestra &quot;Current Folder&quot;, fare clic destro sull&#39;icona della cartella e selezionare &quot;Aggiungi a Path - Cartelle selezionate e sottocartelle&quot;. E &#39;importante che la cartella del software plusTipTracker essere aggiunta al Sentiero, pure. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Nota: Il primo passo per l&#39;analisi delle immagini è quello di individuare le comete EB1-GFP, collegare le comete in tracce, e determinare i parametri della dinamica dei microtubuli. Questo si ottiene con il comando &quot;plusTipGetTracks&quot; 4. <ol><li> Per iniziare l&#39;analisi, applicazioni MATLAB aperto e digitare &quot;plusTipGetTracks&quot; nella finestra di comando. Ciò causerà una nuova finestra di dialogo deve. </li><li> Clicca su &quot;Imposta nuovi progetti&quot; e selezionare uno (o more), della precedente serie di immagini TIFF selezionando il &quot;immagini&quot; appropriate cartella (o directory contenenti &quot;immagini&quot; cartelle). Al termine di questa fase, una directory di file (roi_1) verrà creato (nella stessa cartella che contiene &quot;immagini&quot;) che conterrà i file di dati futuri. Nota: la fase di &quot;creare nuovi progetti&quot; può essere completato prima del tempo, nel corso di una sessione separata. </li><li> Una nuova finestra apparirà: &quot;Seleziona un poligono, fare clic destro su quest&#39;ultimo punto, e fare clic su &#39;Create Mask&#39;&quot;. Fare clic su &quot;OK&quot;. Verrà visualizzata la prima immagine della serie dell&#39;immagine selezionata. Usa il mouse per fare clic e creare un poligono che racchiude la totalità del cono di crescita. Fare doppio clic con il mouse per chiudere il poligono. </li><li> Una volta che il poligono è stato chiuso, una finestra di dialogo apparirà: &quot;Vuoi selezionare un altro ROI?&quot; Se l&#39;immagine ha un altro cono di crescita per analizzare, selezionare &quot;Sì&quot;; altrimenti seletti &quot;No&quot;. </li><li> Selezionare i progetti che verranno immediatamente analizzati. Clicca su &quot;Seleziona Projects&quot; e selezionare la cartella (roi_X) analizzare. </li><li> Viene visualizzata una schermata listSelectGUI. Selezionare il progetto (s) dal lato sinistro dello schermo e spostarli sul lato destro dello schermo. Fare clic su &quot;OK&quot;. Scegliere un percorso per salvare l&#39;elenco di progetti e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Detection&quot;, &quot;monitoraggio&quot;, e &quot;Post-Processing&quot;. Una volta effettuate queste selezioni, il lato destro della finestra di dialogo sarà configurabile. Configurare ogni opzione. <ol><li> Questi parametri vengono utilizzati per collegare le comete rilevati in tracce MT. Dettagli per la scelta di questi parametri di controllo per il monitoraggio sono inclusi nelle pagine 9-10 della relazione tecnica in formato PDF che accompagna il pacchetto di download del software; leggere questo rapporto con attenzione se si verificano problemi. Ai fini del monitoraggio comete EB1-GFP in Xenopci laevis coni di crescita, utilizzare le seguenti impostazioni di rilevamento: Cerca Raggio Gamma (5-12 pixel), lunghezza minima Sub-Track (frame) 3; Max Gap Lunghezza (fotogrammi) 8; Max Factor Ritiro 0.8, angolo di andata massima 50, angolo di Max indietro 10, Fluctuation Radius 2.5. Queste impostazioni sono mostrate nella Figura 1. </li></ol> Nota: Max Factor Il restringimento è impostato per ridurre il numero di &quot;lacune arretrate&quot; rilevati, come &quot;lacune arretrati&quot; non sono utili per analizzare nel contesto di coni di crescita, date le condizioni di sovraffollamento e le probabili errori nei collegamenti della pista. Inoltre, sia l&#39;angolo di andata massima ed anche cambiamenti Radius sono impostati relativamente alta, come MTS cono di crescita presentano piccoli traslocazioni frequenti oltre alle crescite e ritiri, e aumentando le impostazioni di controllo permette di questa maggiore movimento durante la fase di collegamento. <ol><li> Compilare i post-elaborazione delle impostazioni a seconda delle impostazioni di acquisizione di immagini specifiche desiderate. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Una volta configurate le impostazioni, fare clic su &quot;Start&quot;. Il software verrà eseguito a seconda delle impostazioni sono stati selezionati. Questo può richiedere minuti o ore, a seconda del numero di progetti selezionati e le loro dimensioni. La Finestra di comando visualizza il tempo residuo stimato per ogni funzione. Quando il passo plusTipGetTracks è completata, la finestra di comando visualizzerà &quot;Finito!&quot; Nota: Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono ora calcolato da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l&#39;analisi delle dinamiche di MT in coni di crescita, i parametri più utili per esaminare sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), durata percorso di crescita (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Nota: Ora che le tracce microtubuli sono state definite, la funzione &quot;plustipSeeTracks&quot; viene utilizzato per la visualizzazione traccia 4. Questa funzionein grado di fornire le uscite multiple per la visualizzazione, tra cui dinamica MT spaziali mappe e filmati di velocità, ma qui, l&#39;attenzione è rivolta esclusivamente sull&#39;utilizzo di &quot;Movies Track&quot; per visualizzare i brani MT sovrapposte le immagini cono di crescita. Mentre plusTipGetTracks possono analizzare più filmati alla volta, plusTipSeeTracks possono analizzare solo un film alla volta. <ol><li> Digitare &quot;plusTipSeeTracks&quot; nella finestra di comando. </li><li> Dopo il caricamento della finestra di dialogo, cliccare su &quot;Select Progetto&quot;. Selezionare la directory principale che contiene il progetto per visualizzare e clicca su &quot;Seleziona cartella&quot;. Una nuova finestra apparirà: &quot;Selezionare il progetto che si desidera visualizzare&quot;. Scegliere il file da visualizzare e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Avanti, fare clic su &quot;Select Saved ROI&quot;. Passare alla stessa cartella roi_X come quello selezionato nel passo precedente e selezionare il file denominato &quot;roiYX&quot;. </li><li> Clicca su &quot;Seleziona directory di output&quot; per designare wqui MATLAB salverà i file di visualizzazione delle tracce. Nota: si consiglia di utilizzare la stessa cartella che contiene il resto dei dati. </li><li> Selezionare &quot;Crea Traccia di un film&quot; e apparirà una schermata che visualizza tutte le tracce plusTipGetTracks calcolati dalle comete TIP +. Questo passaggio consente di risparmiare la serie storica rintracciato in un formato video, nel file &quot;allTracks_X_X_X&quot;. C&#39;è un&#39;opzione per salvare il filmato come AVI, altrimenti il ​​formato predefinito è come un file Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Nota: Questa funzione finale è utilizzata per creare gruppi di film per l&#39;analisi e il confronto dei parametri di traccia MT. <ol><li> Digitare &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; nella finestra di comando. Per selezionare manualmente i gruppi per confrontare, prima de-selezionare &quot;gruppo di Auto da gerarchia&quot;. Quindi, fare clic su &quot;Seleziona progetti&quot;. Passare alla directory superiori che contengono tutte le cartelle roi_Xanalizzare. </li><li> Viene visualizzata una schermata listSelectGUI. Selezionare tutti i progetti da includere nei gruppi dal lato sinistro dello schermo e spostarli sul lato destro dello schermo. Fare clic su &quot;OK&quot;. Scegliere un percorso per salvare l&#39;elenco di progetti e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Apparirà una finestra: &quot;Si prega di selezionare primo gruppo dall&#39;elenco&quot;. Fare clic su &quot;OK&quot;. La finestra listSelectGUI mostrerà di nuovo. Questa volta, selezionare solo i file che corrispondono al primo gruppo che dovrebbe essere raggruppate. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Quindi, immettere il nome del gruppo e fare clic su &quot;OK&quot;. Apparirà una finestra: &quot;Selezionare un altro gruppo?&quot; Risposta di conseguenza e continuare a selezionare gruppi. Apparirà una finestra: &quot;Selezionare una posizione per salvare la lista del gruppo&quot;. Passare alla posizione e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Clicca su &quot;Select Output Directory&quot; per scegliere dove le cartelle di output sarannomemorizzato. </li><li> Selezionare il tipo di analisi di gruppo per condurre - se le tracce MT devono essere raggruppati per ciascun gruppo o per l&#39;analisi delle cellule dovrebbe essere eseguita. I test statistici raccomandati sono già designati. Per includere tutti i brani nell&#39;analisi, de-selezionare &quot;Rimuovi le tracce a inizio / fine del film&quot;. In caso contrario, avendo questa casella selezionata rimuove eventuali tracce di crescita MT che sono in corso come il film inizia o termina. </li><li> Una volta effettuata la selezione Analysis Group, selezionare &quot;Confronta i gruppi&quot;. </li></ol>

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	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker fornisce una semplice interfaccia grafica per rilevare rapidamente e automaticamente quasi tutti visibili comete EB1-GFP in un cono di cellulare o di crescita, collegare le comete in tracce, e calcolare i parametri MT. Altre pubblicazioni hanno riportato la progettazione di simili tipi di software (per esempio, Marx et al. Analisi quantitativa anche utilizzato delle dinamiche EB1 taggati in coni di crescita 18). Ma, questo software sembra essere unico nella sua facilità di accesso, in...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di ottenere informazioni quantitative in materia di microtubuli (MT) più--end inseguimento dinamica a vivere coni di crescita di proteine ​​(+ TIP). MT + TIP sono un gruppo di proteine ​​che localizzano ai più-end di MTS 9,10. Essi svolgono una serie di funzioni per regolare i parametri di instabilità dinamica MT 11, compresi i tassi di polimerizzazione, catastrofe, e soccorso. Un metodo ben utilizzato per analizzare le dinamiche MT è quello di monitorare il comportamento del EB1 TIP +, che si lega specificamente alla crescente MT plus-conclude 1,12. EB1 è conosciuto per reclutare diverse altre proteine ​​per crescere MT plus-conclude 13,14, ed è stato recentemente istituito come un fattore di maturazione MT 15, MT promuovere sia la crescita e la frequenza catastrofe 15,16. Molti studi di dinamica MT all&#39;interno di coni di crescita hanno utilizzato metodi di mano-tracking per misurare i cambiamenti nelle dinamiche EB1-GFP nel tempo 1-3, come EB1 localizatia MT, più-end possono essere usati come marker per MT polimerizzazione. Uno dei principali vantaggi per l&#39;esame comete EB1-GFP come proxy per la crescita MT è che la dinamica MT possono essere misurati anche nelle regioni di sovrapposizione significativa MT. Mentre il metodo di tracciamento a mano comete EB1-GFP ha fornito indicazioni utili in MT comportamenti 1-3, è che richiede tempo e può essere prevenuto. Inoltre, come la crescita aberrante comportamenti cono sono probabilmente il risultato di cambiamenti minute dinamica del citoscheletro, analizzando solo un piccolo sottoinsieme di MTS (di solito necessario quando la mano-tracking) possono perdere informazioni significative. Così, misuriamo globali parametri delle dinamiche MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, dopo l&#39;acquisizione ad alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software, sviluppato in Danuser Lab, è stata utilizzata in diversi studi che caratterizzano dinamiche MT in vari tipi di cellule 6-8. Si tratta di un open-source, cier-amichevole, pacchetto basato su MATLAB, che comprende il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l&#39;analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono calcolati da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l&#39;analisi delle dinamiche MT in coni di crescita, i parametri più utili sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), traccia la crescita durata (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron). Il software può essere scaricato direttamente dal sito web Danuser Lab (sotto &quot;Software&quot;). Mentre il Danuser Lab supporta attualmente una nuova interfaccia per il monitoraggio TIP + analisi, che è integrata in un pacchetto software chiamato u-track 2.0, l&#39;originale, software stand-alone rimarrà disponibile. Gli algoritmi sottostanti tra i due programmi sono uguali (almeno dal 2014), con solo una differenza di uscite dell&#39;interfaccia e di analisi. Per l&#39;utente inesperto con poco MATLAB e / o l&#39;analisi computazionale esperimentiza, plusTipTracker ha più caratteristiche user-friendly, tra cui le uscite dei parametri statistici automatizzati. Qui, descriviamo la procedura per l&#39;analisi di immagini dinamiche EB1-GFP in coltura Xenopus laevis coni di crescita. Questo protocollo è stato utilizzato in un recente documento esamina le dinamiche MT 17. Per istruzioni dettagliate relative coni di crescita coltura esprimono EB1-GFP Vedi anche Lowery et al. 2012 5. Anche se questo documento è concentrata principalmente sull&#39;esame dinamiche EB1-GFP in coni di crescita, lo stesso protocollo può essere utilizzato per altri tipi di cellule 17. Per tutti i tipi di cellule, l&#39;intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere compresa tra 0,5-2 sec per il monitoraggio ottimale + TIP. Un intervallo di tempo di fino a 4 secondi tra i frame è possibile, ma questo aumento risultati in tempo intervallo di tracking error supplementari.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubuli (MT) più-end-tracking proteine ​​(+ TIP) localizzano alle crescenti più-estremità di MTS e regolano le dinamiche MT 1,2. Uno dei suggerimenti più noti e ampiamente utilizzati + per l&#39;analisi dinamica MT è l&#39;End-binding protein, EB1, che lega tutte le crescenti MT plus-end, e, quindi, è un marker per MT polimerizzazione 1. Molti studi del comportamento EB1 entro coni di crescita hanno utilizzato in termini di tempo e di parte assistita da computer, i metodi a mano-tracking per analizzare singoli MT 1-3. Il nostro approccio è quello di quantificare i parametri globali della dinamica MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, a seguito dell&#39;acquisizione di alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software è un basato su MATLAB, open-source, pacchetto user-friendly che combina il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l&#39;analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Qui, vi presentiamo il protocollo per l&#39;utilizzo di plusTipTRacker per l&#39;analisi delle comete fluorescenza marcata + TIP in colture di Xenopus laevis coni di crescita. Tuttavia, questo software può anche essere utilizzato per caratterizzare la dinamica MT in vari tipi di cellule 6-8.

Usando questo software, come descritto qui fornirà diversi file di informazioni che quantificano + dinamiche TIP nelle cellule viventi. I plusTipGetTracks funzione identifica le tracce (con esempio impostazioni mostrate nella figura 1), e quindi fornisce parametri relativi alle tracce TIP +. Per visualizzare le informazioni che il software ha ottenuto, andare nella directory roi_X creata nel passaggio 2.2. La cartella &quot;impresa&quot; contiene &quot;overlayImages&quot;, ...

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Views.  Boston College.  Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli. 

Video: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Ricerca

Biologia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Colture cellulari neuronali da Aplysia per imaging ad alta risoluzione di coni di crescita

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.