1. Preparazione del trapianto di epitelio Tessuto del donatore freschi o surgelati epiteliali possono essere trapiantate nel cuscinetto di grasso eliminato, ma la preparazione prima di epitelio donatore congelato è più conveniente con una diminuzione minima in termini di efficienza trapianto (efficienza&gt; 85%). Il protocollo per la preparazione di epitelio donatore congelato è la seguente: Prima di preparare trapianto di epitelio donatore, preparare i supporti per congelare epitelio e aliquote di 1 ml in cryovials. Questo può essere conservato a 4 ° C fino a 6 mesi fino al momento dell&#39;uso. Congelare supporto contiene DMEM/F12 supporti tamponata con HEPES e NaHCO 3, 10% di siero fetale bovino (FBS) e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Harvest epitelio mammario da un mouse di recente eutanasia femminile. <ol><li> Lavare il mouse con il 70% EtOH. </li><li> Fai una sagittale tagliare la parete del corpo che si estende dal pube allo sterno senza perforare la membrana sierosa della cavità del corpo ventrale. Fare un taglio obliquo dall&#39;incisione iniziale al pube verso ogni zampa posteriore (Figura 1). </li><li> Sbucciare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose per esporre il 5 ° ghiandola mammaria inguinale attaccato alla fascia sulla parte inferiore della parete del corpo. Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è afferrando le membrane sierose attentamente con la parte ricurva di un paio di pinze curve, facendo attenzione a non forare la cavità del corpo ventrale. Contemporaneamente, afferrare il bordo tagliato del tegumento con diritto pinze dentellate e tirare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose. </li><li> Identificare il linfonodo all&#39;interno della ghiandola mammaria. Il linfonodo si trova all&#39;intersezione di tre vasi sanguigni importanti nella ghiandola mammaria e può essere sentito come un nodulo denso all&#39;interno del cuscinetto adiposo (Figura 2). Con la punta di un paio di forbici occhio, stroncare il tessuto adiposo che circonda il nodo. Con un dito ribalta sul lato epidermico della pelle, applicare una pressione per aumentare il nodo fuori del cuscinetto adiposo e un pizzico fuori con un paio di pinze curve. Eliminare il linfonodo. </li><li> Mentre si tiene ai margini della pelle, afferrare il cuscinetto di grasso mammaria con il bordo curvo di una coppia di pinze curve e gradualmente il cuscinetto adiposo buccia di distanza dalla parete del corpo. Seguire la direzione del cuscinetto adiposo verso la superficie dorsale del mouse come si rimuove l&#39;intera ghiandola mammaria in un unico pezzo. </li><li> Mettere la ghiandola mammaria in un blocco sterile taglio di plastica. Aggiungere una piccola quantità di media, circa 200 ul, alla superficie della ghiandola per mantenerlo umido. Tritare la ghiandola in pezzi 1mm con una lama di rasoio fresca. Dividere la ghiandola tritata in quattro porzioni e distribuire tra quattro cryovials dei media congelare con una pinza. Mettere il cryovials in una &quot;cellula congelatore Nalgene Mr. Frosty che ha 250 ml di alcool isopropilico nel compartimento esterno. Mettete il freezer Nalgene in un congelatore ° -70 C per 24 ore. Conservare le fiale congelate di frammenti mammaria in azoto liquido fino al momento di trapianto. Ogni provetta Microbank ™ conterrà frammenti abbastanza ghiandola mammaria di trapiantare nel cuscinetti di grasso eliminato da 4 a 8 topi host. </li></ol> 2. Preparazione del trapianto di cellule Il nostro laboratorio ha trapiantato diversi tipi di cellule, tra cui immortalato le linee di cellule epiteliali mammarie, mammarie linee di cellule tumorali o cellule primarie mammaria in un topo cancellato cuscinetto adiposo. Il protocollo per la preparazione di Comma-D cellule per il trapianto è la seguente: <ol><li> Comma-D le cellule sono coltivate in normali mezzi di comunicazione MECL contenente DMEM: F12 integrato con 2% siero di bovino adulto (ABS), mEGF, insulina, antibiotica / antimicotica (AB / AM). </li><li> Harvest Comma-D cellule quando le cellule sono confluenti 85% -90%. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 1200rpm per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere le cellule in fresco mezzi MECL e regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Per il trapianto di cellule mammarie primarie, il primario cellule epiteliali mammarie sono isolati dal 5 ° del mouse ghiandole mammarie attraverso la dissociazione meccanica ed enzimatica. Le cellule sono risospese in DMEM: media F12 e adattata alla concentrazione desiderata, di solito 5 x 10 6 / ml. 3. Procedura standard per la Cancellazione del cuscinetto adiposo mammario mouse <ol><li> Anestetizzare le tre del mouse vecchio host settimana. Selezionare i topi che sono &lt;12 g per garantire che la crescita duttale mammario non è stata avviata. Noi usiamo 200mg/kg di peso corporeo di 2,2,2-tribromoethanol. </li><li> Dopo che il mouse è anestetizzato, trattenere saldamente il mouse, lato ventrale con le membra distese, su un palco chirurgico in modo che l&#39;addome è provocazione. Prima dell&#39;intervento, amministrare analgesici: o bupivacaina (1mg/kg &lt;) o buprenorfina (0.05mg/kg), per via sottocutanea. </li><li> Afferrare la pelle con una pinza di pochi millimetri al di sopra del bacino e sollevarlo con l&#39;addome<html> . Nip la pelle con le forbici e per fare un sagittale tagliare la parete del corpo che si estende dal pube allo sterno. Non perforare le membrane sierose del corpo cavità ventrale. Non fate la vostra incisione iniziale troppo vicino l&#39;uretra in modo che le clip ferita non interferisce con la capacità del topo di urinare. </li><li> Dalla incisione iniziale, fare dei tagli obliqui attraverso la pelle dalla linea mediana in tutto il bacino verso entrambe le zampe posteriori. </li><li> Utilizzare l&#39;area curva della pinza curva per afferrare delicatamente le membrane sierose. Utilizzare pinze tessuto di cogliere il margine di taglio della pelle e tirare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose ed esporre il 5 ° ghiandola mammaria inguinale trova sulla fascia sulla parte inferiore della parete del corpo. </li><li> Cauterizzare l&#39;, nodo capezzolo e due arterie che conducono al nodo (Figura 2) </li><li> Separare le ghiandole quarto e quinto. Cauterizzare il margine della ghiandola quinte per evitare che ricrescita dalla ghiandola 6 °. </li><li> Dividere il cuscinetto adiposo della ghiandola mammaria quarto tagliando attraverso il cuscinetto adiposo con le forbici solo ventrale (lato verso il capezzolo) del nodo. Utilizzare pinze curve di afferrare saldamente la parte ventrale del cuscinetto adiposo e tirarlo fuori dalla parete del corpo in un unico pezzo. Premere la parte ventrale del cuscinetto adiposo tra due vetrini e mettere in un piatto di vetro colorazione istologia contenente fissativo Carnoy. Questo tessuto verranno fissate e colorate successivamente con una soluzione di allume carminio per verificare i margini cancellata (Figura 3). Pulire la fascia intorno alla regione della parte rimossa del cuscinetto adiposo per rimuovere tutte le tracce della ghiandola mammaria con le pinzette ricurve. </li></ol> 4. Alternative &quot;Procedura per Sparing Cancellazione del cuscinetto adiposo Dopo che si è diventati competenti con la procedura standard per la cancellazione del cuscinetto adiposo mammario del mouse, si può preferire di tentare la procedura di risparmiare meno invasiva sviluppata da Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Preparare il mouse come per la procedura standard. </li><li> Afferrare il capezzolo del quarto ghiandola mammaria inguinale e tagliare un cerchio di 3-5 mm di circonferenza intorno al capezzolo con la punta di forbici. </li><li> Tirare il capezzolo lontano dal corpo per staccare la parte di taglio della pelle e tracciare il quarto ghiandola mammaria inguinale attraverso il foro. </li><li> Identificare il nodo. Utilizzare il cauterio per cauterizzare il nodo e il 6 ° ghiandola mammaria attraverso il foro. </li><li> Tagliare e staccare la parte più superficiale della ghiandola mammaria 5 ° appena prima del nodo. L&#39;, zona del capezzolo circolare di pelle e porzione di epitelio mammario cuscinetto adiposo contenente vengono rimossi in un unico pezzo. </li></ol> 5. Tessuto / trapianto di cellule <ol><li> Per i frammenti di epitelio trapianto, sbrinamento uno provetta Microbank ™ di epitelio e trasferire i frammenti epiteliali di una piastra di Petri contenente mezzi freschi per diluire il DMSO. Fai un piccolo foro o in tasca il cuscinetto di grasso eliminato con punta a forbice per il nuovo epitelio. Mettete un pezzo di epitelio 1 millimetro donatore nella tasca con una pinza ago. Tenere la tasca chiusa con una pinza il tessuto quando si estrae il forcipe ago in modo che il tessuto rimane in vigore. </li><li> Per il trapianto di cellule, iniettare 50.000 cellule in 10 l di media in ogni pad grasso usando una siringa 50μl Hamilton con un ago calibro 22s. </li></ol> 6. Chiusura / Revival di mouse <ol><li> Disporre la pelle per la chiusura. Afferrare opposti margini di pelle, li tengono insieme con le pinze, ascensore via dalle membrane sierose del corpo cavità ventrale e chiudere con clip ferita. In genere, è necessario utilizzare due clip per chiudere la sagittale incisione e una clip per ogni incisione obliqua per la procedura standard. Evitare di ostruire l&#39;uretra. Può essere necessario per colmare le lacune nella pelle nel punto di intersezione delle incisioni sagittale e obliquo con una sutura. La procedura risparmiando richiede solo una clip ferita per ogni lato. </li><li> . Posizionare il mouse nella sua gabbia e tenere la gabbia sotto una lampada di riscaldamento fino a quando il mouse ha fatto rivivere. </li><li> Le clip ferita deve essere rimosso dopo 2 settimane. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Dimostrazione di disegno incisione. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Luogo di linfonodi, vasi sanguigni, capezzolo e l&#39;epitelio endogena. Cauterizzare in luoghi indicati. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Montare Figura 3. Whole dimostra che l&#39;epitelio endogena è limitata alla zona all&#39;interno del cerchio, e quindi i margini sono &quot;chiari &#39;. 7. Rappresentante Risultati _r.jpg &quot;alt =&quot; Figura 4 &quot;/&gt; Figura 4. Montare intere di cuscinetto adiposo rimosso da 3 topo settimana di vita mostrando margini cancellata. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Montare intero da un mouse 10 settimane vecchio mostrando rimozione del cuscinetto adiposo endogene dell&#39;epitelio mammario. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Ematossilina e eosina sezione macchiato di un cuscinetto di grasso eliminato da un mouse 10 settimane di età. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Montare intero da un mouse 10 settimane vecchio che mostra normale albero mammario duttale sviluppato da epitelio trapiantato. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Ematossilina e eosina sezione macchiato di dotti mammari sviluppate da epitelio trapiantato. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figura 9" /> Figura 9. Ematossilina e eosina sezione macchiato di un tumore mammario sviluppato da epitelio trapiantato.

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	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

In questo rapporto, presentiamo due metodi alternativi per la pulizia del cuscinetto adiposo mammario del mouse in preparazione per i trapianti epiteliali mammarie. La procedura standard è stato in uso dal suo sviluppo nel 1959 da DeOme et al. 1 Mentre più invasivo, il metodo standard è il metodo preferito per la formazione del novizio perché la struttura e l&#39;orientamento della ghiandola mammaria sono facilmente visualizzati. Tuttavia, la procedura risparmiando può essere preferito dal chiru...

mammary epithelial transplant procedure

Questo articolo descrive e mette a confronto il grasso procedura di liquidazione pad sviluppato da DeOme KB et al. 1 e della procedura di risparmio sviluppato da Brill B et al. 2, seguita dalla procedura di trapianto epiteliali mammarie. La procedura di trapianto mammaria è ampiamente utilizzato dai biologi mammaria perché sfrutta il fatto che lo sviluppo significativo dell&#39;epitelio mammario non avviene solo dopo la pubertà. A 3 settimane di età, la crescita della pianta epiteliali mammarie è limitata alla vicinanza con il capezzolo e il cuscinetto adiposo è in gran parte privo di epitelio mammario, ma da 7 settimane di età dell&#39;albero epiteliale duttale si estende in tutto il cuscinetto di grasso intero. Pertanto, se questa piccola porzione del cuscinetto adiposo contenente epitelio, la regione tra il capezzolo e il linfonodo, viene rimosso a 3 settimane di età, l&#39;epitelio endogeno non sarà mai popolare il pad mammaria grasso e il cuscinetto adiposo è descritto come &quot;cancellato &quot;. In questo momento, epitelio mammario da un&#39;altra fonte possono essere trapiantate nel cuscinetto di grasso eliminato dove si ha la possibilità di estendere mammario duttale alberi attraverso il cuscinetto adiposo. Questa procedura è stata utilizzata in molti modelli sperimentali tra cui l&#39;esame del fenotipo tumorale in transgenico tessuti epiteliali mammarie senza gli effetti confondenti del genotipo sull&#39;animale intero 3, per l&#39;identificazione delle cellule staminali mammarie trapiantando cellule in diluizione limitato 4,5, determinando se noduli iperplastici procedere alla tumori mammari 6, e di valutare l&#39;effetto della esposizione ormonale prima sul comportamento dell&#39;epitelio mammario 7,8. Tre topi ospitare settimana di vita sono anestetizzati, puliti e trattenuto in una fase chirurgica. Un sagittale incisione è fatta attraverso la pelle, ma non il peritoneo, che si estende dal pube allo sterno. Tagli obliqui sono realizzate attraverso la pelle a partire dalla metà sagittale incisione in tutto il bacino verso ogni gamba. La pelle è allontanata dal peritoneo per esporre il 4 ghiandola mammaria inguinale. Il cuscinetto adiposo viene cancellata, eliminando il grasso anteriore tessuto pad per il linfonodo. Frammenti di epitelio o cellule epiteliali vengono trapiantate nel restante pad eliminato il grasso e il mouse è chiuso.

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Mammary Epithelial Transplant Procedure

Questo articolo illustra la procedura sviluppata da DeOme KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) e la procedura risparmiando sviluppato da Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) per la cancellazione del 4 inguinale pad mammaria di un topo grasso pubescente in preparazione per il trapianto di frammenti mammaria, cellule epiteliali mammarie, o cellule tumorali mammarie.

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K Views.  University of Massachussetts. Questo articolo illustra la procedura sviluppata da DeOme KB Et al. (1959) e la procedura risparmiando sviluppato da Brill B Et al. (2008) per la cancellazione del 4 inguinale pad mammaria di un topo grasso pubescente in preparazione per il trapianto di frammenti mammaria, cellule epiteliali mammarie, o cellule tumorali mammarie.

Video: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

Indagare i meccanismi alla base immunologica rigetto del trapianto d&#39;organo

Ricerca

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Dendra2 Photoswitching attraverso la finestra Imaging mammaria

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

Hemihepatectomy diritto di transezione intraepatica Suprahilar del Hemipedicle Destra utilizzando una pinzatrice vascolare

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.