Ringraziamo Radek Šindelka per il suo aiuto, e Cas Bresilla per aiutare con la rana allevamento e preparazione embrione. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH tramite il R01DE021109 concessione di HLS Laura Jacox è stato finanziato dalla Herschel Smith Graduate Fellowship presso la Harvard University e una borsa F30 borsa individuale F30DE022989-01 attraverso il NIDCR.

1. Reagenti Preparazione <ol><li> 10x MBS: Preparare 1 L di 10x modificata di Barth Saline (MBS) soluzione 17. Fare riferimento alla Tabella 1, reagenti, gli ingredienti e le istruzioni. Utilizzare acqua distillata per tutte le soluzioni. Mescolare in un bicchiere, con un ancoretta, fino al completo scioglimento. Tutte le soluzioni devono essere effettuate a temperatura ambiente. </li><li> 1x MBS: Diluire 100 ml di soluzione 10x MBS in 900 ml di acqua distillata per fare 1 l di 1x MBS. Aggiungere 0,7 ml di 1 M CaCl 2 soluzione. </li><li> 0.1x MBS: diluire 1x MBS per preparare 1 L di soluzione 0,5 x MBS e 2 L di 0.1x soluzione MBS. Per 1 L di 0.1x soluzione MBS, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml soluzione gentamicina. La soluzione MBS 0.1x con gentamicina sarà utilizzato per coltura degli embrioni a lungo termine. </li><li> Ficoll / MBS: Aggiungi 15 grammi di Ficoll 400-500 ml di soluzione 0,5 x MBS. Mescolare energicamente. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare fino Ficoll è completamente dissolto (diverse ore). </li><li> 70% di etanolo: Diluire 100% di etanolo al 70% di etanolo utilizzandoacqua distillata. </li></ol> 2. Preparazione Glass strumenti operativi <ol><li> Preparazione Needle: Caricare tubi capillari in un estrattore ago. <ol><li> Estrarre gli aghi base alle impostazioni indicate nella Tabella 2: Impostazioni estrattore ago. Le impostazioni sono per una micropipetta estrattore Sutter Instrument Co. Modello P-80/PC e tubi capillari, come descritto nella Tabella di reagenti e attrezzature specifiche. Tuttavia, queste impostazioni sono specifiche per l&#39;ago estrattore Sutter, e dovranno essere regolata per altre macchine. Le impostazioni possono essere determinate utilizzando un test di rampa, come specificato dal costruttore della macchina. </li><li> Tirare 4-6 aghi in preparazione per la procedura. Gli aghi devono essere ripartiti in modo tale che la porzione a ciglia flessibile della punta di vetro viene completamente rimosso, che è tipicamente 2-3 mm di lunghezza. La punta deve essere relativamente rigido, ma ancora abbastanza stretto da essere usato come uno strumento di taglio. Una foto di un ago ideale nella Figura 1A. </li&gt; <li> Conservare gli aghi in una capsula di Petri con una striscia di argilla verso il centro. Premere l&#39;albero di ogni ago nella creta, per tenerlo in luogo e per mantenere la punta affilata fragile dal fondo e sui lati. </li></ol></li><li> Per strumenti aggiuntivi, ottenere copertura scivola in vetro, un paio di lunghe pinze standard di modello, un becco Bunsen, e 3-4 pipette Pasteur in vetro (Size 5 ¾ in). </li><li> Strumento pipetta: Per effettuare una pipetta strumento, accendere il bruciatore Bunsen e posizionare la punta di una pipetta Pasteur di vetro nella parte blu della fiamma ruotandolo, in modo che la punta si scioglie e il foro completamente guarnizioni, formando una chiusa, estremità arrotondata . Il arrotondata, punta sigillata viene poi utilizzato per rendere depressioni nel piatto argilla che contiene gli embrioni durante l&#39;operazione. Vedere la Figura 1B. </li><li> Ponti di vetro: Per effettuare ponti di vetro, utilizzare pinze modello lungo standard per rompere con cura 3 millimetri da 3 millimetri pezzi di vetro vetrino. Tenendo il pezzo di vetrino con tweezers, posizionare il vetro della fiamma fino a quando tutti e quattro i bordi ammorbidiscono e curva verso il basso, formando una piccola cupola di vetro. I bordi non dovrebbero più essere taglienti. Vedere la Figura 1C. </li><li> Conservare i ponti di slittamento copertura in vetro inserendoli, bordi verso il basso, in plastilina, allineando la parte inferiore di una piastra di Petri. Inserire i ponti tale che la parte superiore del ponte rimane sopra la superficie di argilla. Non spingere troppo tale che le interruzioni ponte, e non inserire completamente il ponte nella creta, perché può essere difficile da rimuovere. Dopo la sterilizzazione con una fiamma o etanolo al 70%, i ponti possono essere riutilizzati da esperimento sperimentare. </li></ol> 3. Preparazione per l&#39;operazione Embryo <ol><li> Foderare una piccola 60 millimetri di plastica piastra di Petri con il pongo. Tra gli usi, la superficie del disco e argilla viene accuratamente lavato con acqua distillata e poi con etanolo al 70%. NOTA: Usare rosso, bianco o giallo, Van Aken Plastalina plastilina, che può essere acquistato in un localey o negozio d&#39;arte. Argilla nera non è raccomandato perché rilascia un residuo. </li><li> Riempire il piatto con il 3% soluzione di Ficoll 0.5x MBS. La concentrazione salina superiore impedisce dissociazione tessuto, e il Ficoll polisaccaride aiuta ad addensare la soluzione, che aiuta a tenere il viso in posizione. </li><li> Utilizzare lo strumento pipetta Pasteur fiammato (vedi Figura 1) per rendere poco profonde, 2-3 mm depressioni nella creta, sulla profondità di un corpo stadio embrionale 20. Rendere 20-30 depressioni, 1-2 mm di distanza, su ciascun lato del piatto, per cui vi è un totale di 40-60 depressioni. Etichettare un lato LOF / GOF, e l&#39;altro lato wild type, incidendo le iniziali nella creta con una pinza. </li></ol> 4. Preoperatorio Embryo Preparazione <ol><li> Ottenere e cultura Xenopus laevis embrioni utilizzando metodi standard 17. Per una descrizione dettagliata della rana allevamento, consultare Sive et al 17. <ol><li> Quarantotto ore prima della obta esperimentonelle uova di rana femminili ed effettuare la fecondazione in vitro. </li><li> Iniettare 0,5-1 ng di membrana ricoperto GFP mRNA, più eventuali mRNA desiderato o anti-senso oligonucleotidi antisenso morpholino modificati (&quot;Morpholinos&quot;) allo stadio di una cellula o in 2 cellule nella fase 2 cellule. La fase di una cellula dura circa 70-90 min. Iniettare un volume totale di 1-3 nl. Al posto di RNA codificanti per una proteina fluorescente (come GFP o RFP RNA), si può iniettare FITC morfolino etichettati o destrano fluorescente. La fluorescenza è importante per determinare se il tessuto guarisce trapiantato e rimane nella testa. </li><li> Capped mRNA può essere preparato da un plasmide linearizzato utilizzando un SP6 mMessage mMachine o kit T7. Morpholinos possono essere progettati e ordinati attraverso Gene Strumenti LLC. La quantità di morfolino necessaria per un effetto desiderato deve essere determinato per ciascun gene 18. </li><li> Memorizzare gli embrioni iniettati a 15 ° C per 48 ore, fino a raggiungere 19-20 stadio. (Fin tutto o in fasi successive, embrioni stadio secondo la tabella Normale di Xenopus laevis da Nieuwkoop e Faber 19.) NOTA: Il giorno della chirurgia, sia embrioni beneficiari e donatori devono essere all&#39;interno di uno stadio di ogni altro per i trapianti di lavorare in modo ottimale. Tuttavia, gli embrioni iniettati con Morpholinos (&quot;morphants&quot;) a volte si sviluppano più lentamente di tipo selvaggio o controllare embrioni morphant, rendendo necessario coordinare gli esperimenti in modo che entrambi morphant e tipo embrioni selvatici sono allo stesso stadio. Morphants potrebbero dover essere mantenuta ad una temperatura superiore per 12-24 h prima della procedura. Per aumentare la probabilità che gli embrioni possono essere trovati in fasi corrispondenti, embrioni possono essere mantenuti a temperature diverse. Ventiquattro ore prima dell&#39;esperimento, si dovrebbe dividere gli embrioni in un diversi piatti, e posto morphants a 18-20 ° C e il tipo di embrioni selvatici a 15-18 ° C. </li></ol></li><li> Il giorno dell&#39;esperimento trapianto, remOve gli embrioni da the15 ° C incubatore e lo stadio li secondo Nieuwkoop e Faber 19. Se sono più giovani di ritardo neurula (fase 19), lasciarli a temperatura ambiente per 1-2 ore, fino a raggiungere la fase 19. </li><li> Schermo gli embrioni iniettati sotto un microscopio a fluorescenza. Selezionare embrioni che mostrano uniforme, fluorescenza per l&#39;esperimento. </li><li> Rimuovere il disordine e possibili contaminanti vicino alla zona operativa. Pulire la superficie operativa, stereomicroscopio e tutti gli strumenti con il 70% di etanolo. </li><li> Una volta che gli embrioni sono in fase di 19, rimuovere la membrana vitellina usando # 5/45 pinza Dumont sotto uno stereomicroscopio. <ol><li> Rimuovere la membrana vitellina di 20-30 di ciascuna di donatore e embrioni ospitante. </li><li> Per i primi esperimenti di trapianto di faccia, si dovrebbe praticare con pochi embrioni per ogni condizione. Il metodo è impegnativo e richiede una attenta pratica prima di poter essere usato su larga scala, rapidamente e con successo. Si può lavorare up a fare 20 trapianti / esperimento. </li></ol></li><li> Spostare embrioni ospitanti nel piatto operativo utilizzando una plastica graduato pipetta con la punta tagliata in modo tale che l&#39;apertura è molto più ampio di un embrione (almeno alcuni millimetri). Fare attenzione a non toccare gli embrioni di bolle o la superficie dell&#39;acqua, come embrioni esploderà nella tensione superficiale. </li><li> Utilizzare # 5/45 pinze per inserire gli embrioni nelle depressioni argilla, con il posteriore dell&#39;embrione in argilla. Chiudere delicatamente l&#39;argilla intorno alle basi dell&#39;embrione utilizzando le pinze, lasciando il quarto superiore dell&#39;embrione, la testa, sporgente dalla depressione. </li><li> Una volta che tutti gli embrioni host vengono fissati nelle loro depressioni, muoversi verso l&#39;altro lato della piastra e cominciare a inserire gli embrioni donatori nelle loro depressioni. Ripetere il processo di protezione degli embrioni nei loro pozzi. </li></ol> 5. Esecuzione del viso Chirurgia dei trapianti <ol><li> Lama di taglio: Come una lama di taglio per la rimozionedi EAD tessuto del donatore, utilizzare un ago capillare di vetro opportunamente rotto (vedi punto 2.3 e Figura 1). NOTA: Si può detenere direttamente il capillare tra le dita (questo funziona bene per le persone con mani piccole) o si può montare l&#39;ago in un supporto del perno insetto. Electrosharpened aghi di tungsteno 17 caricati in un supporto del perno possono essere utilizzati al posto di un ago capillare. Si prega di consultare i titolari pin proposte e gli aghi di tungsteno nella tabella dei reagenti specifici e attrezzature. </li><li> Allo stereomicroscopio, inserire l&#39;ago nella testa dell&#39;embrione a fianco della ghiandola cemento. L&#39;ago deve essere inserito in profondità, in modo che passi dall&#39;esterno l&#39;embrione, attraverso la testa, e nel foregut. Trapiantare tutta EAD, tagli dovrebbero estendersi dall&#39;esterno dell&#39;embrione al foregut. Per i trapianti solo ectoderma-, tagli dovrebbero essere meno profondo ed estendere solo attraverso l&#39;ectoderma. <ol><li> Flick l&#39;ago dalla sinistra alla destra deltesta, per tutta la larghezza della ghiandola cemento. Il rapido passaggio è importante come il moto dà un taglio netto. Fare riferimento alla Figura 2A per una sintesi della tecnica e la Figura 2B per una dimostrazione dei tagli. La ghiandola del cemento e gli occhi sono punti di riferimento importanti per i tagli. L&#39;ordine dei tagli non influenza il risultato e può variare a seconda della preferenza dell&#39;utente o manualità. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;ago all&#39;inizio del taglio precedente, al bordo sinistro della ghiandola cemento, e aspirare l&#39;ago verso l&#39;alto fino a raggiungere il fondo dell&#39;occhio sinistro. Questo creerà un taglio verticale dal bordo sinistro della ghiandola cemento al fondo dell&#39;occhio sinistro. </li><li> Posizionare l&#39;ago sul bordo destro della ghiandola cemento, e sfogliare l&#39;ago verso l&#39;alto fino a raggiungere la parte inferiore dell&#39;occhio destro. Questo creerà un taglio verticale dal bordo destro della ghiandola cemento sul fondo dell&#39;occhio destro. </li><li> Per asportare completamente il tessuto, flick l&#39;ago dal fondo dell&#39;occhio sinistro sul fondo dell&#39;occhio destro, creando un taglio orizzontale che libererà il tessuto. Tagli possono estendersi dall&#39;esterno dell&#39;embrione al foregut, comprendente sia ectoderma e endoderma nel espianto EAD. In alternativa, i tagli superficiali possono essere utilizzati per ectoderm sola trapianti EAD. Una volta che il tessuto EAD viene rimosso, ci dovrebbe essere un foro rettangolare da fuori dell&#39;embrione al foregut, che si estende dalla ghiandola cemento appena sotto gli occhi (dall&#39;alto in basso). Il foro dovrebbe estendersi dal confine interno dell&#39;occhio sinistro al bordo interno dell&#39;occhio destro (lato a lato). Vedere la Figura 2Bb. </li><li> Spingere delicatamente il tessuto asportato sulla punta dell&#39;ago, e sollevarla attraverso il buffer per la parte del piatto contenente embrioni ospitante. Non esporre il tessuto all&#39;aria superficie o diventerà danneggiato. </li><li> Asportare lo stesso tessuto dall&#39;embrione ospitante, come per il donatore. Eliminare l&#39;espianto EAD host o salvarlo inserit in faccia donatore, per il trapianto reciproci. </li><li> Inserire l&#39;espianto del donatore nel foro ospitante risultante utilizzando # 5/45 pinze. </li><li> Una volta che il tessuto donatore sia posizionato correttamente e completamente inserito, posizionare accuratamente un ponte di vetro (vedi Figura 1 e Figura 2BC) sulla faccia dell&#39;embrione di tenere il trapianto in posto. Le estremità del ponte devono inserire nella creta, tenendolo in posizione. Il ponte dovrebbe comprimendo leggermente il tessuto trapiantato, tale che il trapianto si trova a filo con la testa ospitante, senza che sporge dalla testa o sdraiata profondità all&#39;interno della testa. La testa può essere leggermente appiattita dalla polizza di copertura, ma fate attenzione a non danneggiare l&#39;embrione con troppa pressione. Trapianti devono essere effettuate entro 5 minuti. NOTA: Un investigatore esperto può eseguire una ventina di trapianti per esperimento, oltre 2-3 ore. Durante questo periodo gli embrioni saranno progredire dalla fase 20-22. Completamento del trapianto di faccias allo stadio 21 o 22 non influisce risultati. Trapianti più tardi (fasi 22-26) può essere fatto, ma sono più difficili come EAD regione mediana priva di cresta si restringe come cranici cresta neurale si porta in faccia. La coerenza di tutti i trapianti è critica. </li></ol> 6. Trapianto di faccia Post-Operazione di recupero <ol><li> La guarigione richiede in genere 2-3 ore. Lasciare gli embrioni a temperatura ambiente indisturbati nelle loro depressioni argilla con i ponti di vetro tenendo il tessuto del donatore a posto. </li><li> Una volta che i trapianti sono guarite, rimuovere con attenzione i ponti di vetro, rimuovere l&#39;argilla intorno alla base degli embrioni usando pinze, e utilizzare una plastica laureato pipetta per aspirare delicatamente gli embrioni di loro depressioni. </li><li> Mettere gli embrioni in una capsula di Petri adeguatamente etichettati, a metà pieno di MBS 0.1x pulite con gentamicina. </li><li> Far crescere gli embrioni a 15 ° C o 18 ° C per diversi giorni fino a quando non raggiungono l&#39;alimentazione stadio di girino in fase 40, wgallina fenotipi facciali possono essere segnati. <ol><li> La soluzione MBS 0.1x con gentamicina deve essere cambiata ogni giorno, e gli embrioni morti deve essere rimossa prontamente per evitare contaminazione e morte di altri embrioni. </li><li> La bocca si apre allo stadio 40. Nella fase 40-41, si deve verificare che il tessuto trapiantato rimane guarito in luogo visualizzando sua fluorescenza. Trapianti di tanto in tanto cadono, per cui bisogna garantire che tutti gli embrioni ottenuti sono il tessuto del donatore a posto. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Fasi critiche e limitazioni: La procedura di trapianto di faccia EAD è il tempo e il lavoro intenso. Si richiede pratica, mano ferma, e la destrezza di perfezionare. Il protocollo di trapianto di faccia si basa sulla capacità del ricercatore di rimuovere in modo efficiente e il tessuto di trapianto. Se si prende troppo tempo per inserire il trapianto nel volto del padrone di casa, il volto ospite inizierà a contrarsi e guarire. Pinze possono essere utilizzati per espandere delicatamente la regione facciale. Tu...

Per comprendere i meccanismi alla base difetti cranio-facciali congenite 1-2, tessuti importanti e il loro contributo di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale deve essere identificato. Nella rana Xenopus laevis, parte del viso, compresa la bocca e la forma narici dal &quot;Extreme anteriore Domain&quot; (EAD), dove ectoderma e l&#39;endoderma sono direttamente giustapposti 3-4. L&#39;EAD funge anche da centro di segnalazione di influenzare i tessuti circostanti, tra cui la cresta neurale cranica, che forma le mascelle e altre regioni facciali 5. Per identificare i geni che contribuiscono alla funzione EAD, una tecnica di &#39;trapianto di faccia&#39; è stato sviluppato, in cui il tessuto viene trapiantato da un donatore in un embrione di accoglienza, dopo aver rimosso la regione ospitante corrispondente. Seguendo il trapianto, con conseguente sviluppo facciale viene valutata. Pertanto, gli effetti della perdita di funzione (OL) o guadagno di funzione (GOF) per un gene specifico nell&#39;EAD sono analizzati localmente, dove il resto della head e il corpo è composto di tipo selvatico tessuto. Il trapianto di reciprocità può essere effettuato, se di tipo selvatico tessuto viene trapiantato in embrioni con LOF globale o GOF in geni specifici. Il trapianto è stato frequentemente utilizzato in Xenopus e pulcino studi 6. Ad esempio, Xenopus trapianto ha affrontato induzione homogenetic neurale, obiettivo e competenza neurale, e neural crest migrazione 7-10. Quaglia-chick innesto chimerico ha analizzato lo sviluppo della piastra anteriore neurale, anteriore cresta neurale, cresta neurale, e le ossa craniche 11-14. Questa è la prima tecnica di trapianto per lo studio dello sviluppo craniofacciale in Xenopus. Questa tecnica ha dimostrato un nuovo ruolo per gli inibitori di Wnt Frzb1 e della Mezzaluna nella regolazione della formazione di membrana basale in bocca presuntiva 5. Xenopus laevis è un modello ideale per lo studio dello sviluppo cranio-facciale come embrioni sono grandi, sviluppare esternamente, unnd il volto è facilmente visibile, permettendo micromanipolazione e di imaging di sviluppo. Meccanismi sottostanti lo sviluppo del viso appaiono conservati, indicando che accertamenti effettuati nella rana forniscono informazioni in sviluppo umano 4,15-16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pasteur pipette</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">14672-400</td>
			<td style="width:128px;">Lime Glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Size 5 3/4&#8217;&#8217;</td>
			<td style="width:128px;">Cotton Plugged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;">Disposable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:195px;">Graduated Transfer Pipette</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">16001-180</td>
			<td style="width:128px;">Disposable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Polyethylene</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:195px;">#5/45 forceps</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools by Dupont medical</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">11251-35</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">Angled 45 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="81" rowspan="3" style="height:81px;width:195px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">11000-20</td>
			<td style="width:128px;">Straight; serrated tip</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Stainless Steel;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">20cm long</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">FHC</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">30-30-1</td>
			<td style="width:128px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">100mm each</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cover slip&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48393 252&#160;</td>
			<td style="width:128px;">24x60mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">micro cover glass</td>
			<td style="width:136px;">or&#160;</td>
			<td style="width:128px;">or&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">(for glass bridges)</td>
			<td style="width:136px;">48393 230</td>
			<td style="width:128px;">24x40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">No.1.5</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F9378</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Needle Puller&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td>
			<td rowspan="3" style="width:128px;">The most similar, currently available&#160; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Model P-80</td>
			<td style="width:101px;">Flaming / Brown micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">(discontinued)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zeiss Stemi 1000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:195px;">Stereomicroscope Lighting by Fostec</td>
			<td style="width:101px;">Fostec</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;">Use a light box with 2 fiberoptic arms.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">26018-17</td>
			<td style="width:128px;">Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Length: 17cm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="101" rowspan="3" style="height:101px;width:195px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">26016-12</td>
			<td style="width:128px;">Jaw opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Length: 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:195px;">Tungsten Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">10130-05</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">0.125mm Rod diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Van Aken Plastalina</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Blick&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">#33268-2981</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Modeling Clay- white, red or yellow</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td>
			<td style="width:101px;">Ambion</td>
			<td style="width:136px;">AM1340</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial transplants in xenopus laevis embryos

Malformazioni congenite craniofacciali si verificano in 1 su ogni 700 nati vivi, ma l&#39;eziologia è raramente noto a causa della limitata comprensione dello sviluppo cranio-facciale. Per identificare dove percorsi e tessuti segnalazione agiscono durante patterning del viso sviluppo, una tecnica &#39;trapianto di faccia&#39; è stato sviluppato in embrioni di rana Xenopus laevis. Una regione di presuntiva tessuto facciale (il &quot;Extreme anteriore Domain&quot; (EAD)) viene rimosso da un embrione donatore in fase tailbud, e trapiantato in un embrione ospite della stessa fase, di cui la regione equivalente è stato rimosso. Questo può essere usato per generare una faccia chimerico in cui il tessuto ospite o donatore ha una perdita o guadagno di funzione in un gene, e / o include un&#39;etichetta lignaggio. Dopo la guarigione, il risultato dello sviluppo è monitorato, e indica ruoli della via di segnalazione all&#39;interno del donatore o circostanti tessuti dell&#39;ospite. Xenopus è un modello valido per lo sviluppo viso, come la regione facciale è grande e facilmente unaccessible per micromanipolazione. Molti embrioni possono essere analizzati, nel corso di un breve periodo di tempo dal momento che lo sviluppo avviene rapidamente. I risultati nella rana sono rilevanti per lo sviluppo umano, dal momento che i processi cranio-facciali appaiono conservati tra Xenopus e mammiferi.

Tessuto trapiantato deve essere completamente inserita nella testa ospitante dopo il trapianto, come mostrato nella Figura 3A, e hanno un ponte di vetro opportunamente posizionato sulla faccia dell&#39;embrione, come mostrato nella Figura 2BC. Il tessuto donatore trapiantato deve essere dimensionato correttamente per l&#39;apertura ospitante, per il trapianto abbia successo. Il tessuto EAD non deve sporgere dalla testa, in qualsiasi modo, come si vede nelle figure 3B e ...

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Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Una tecnica per il trapianto &quot;Extreme anteriore dominio&quot; dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un&#39;altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

10.1K Views.  Harvard University.  Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali. 

Video: Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Ricerca

Biologia

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...