Ringraziamo David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, Columbia Britannica) per la fornitura del AcMNPV baculovirus e di discussione utile. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione canadese per l&#39;innovazione (CFI), il Canadian Institutes of Health Research (CIHR), la Michael Smith Fondazione per la Ricerca sulla Salute (MSFHR), e le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) .

Parte 1: Preparazione di ovociti di Xenopus per microiniezione <ol><li> Posizionare un piccolo pezzo (circa 2 cm) di ovaio Xenopus laevis in una da 50 ml tubo conico che contiene 20 ml di soluzione di collagenasi (5 mg / ml di collagenasi di calcio senza modifica di Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 Hepes mM, pH 7,5). Collagenasi viene utilizzata per rimuovere le cellule del follicolo che circondano gli ovociti. </li><li> Posizionare il tubo su una piattaforma shaker e rock delicatamente (a 100 RPM) per un&#39;ora. Questa volta varia con diversi lotti di collagenasi. Così dopo un&#39;ora, prendere un piccolo campione di ovociti e di esaminare sotto un microscopio da dissezione. Correttamente de-folliculated ovociti devono essere ben separati gli uni dagli altri, e dovrebbe essere facile per inserire un ago di vetro nel citoplasma dell&#39;ovocita. Se gli ovociti non sono sufficientemente de-folliculated, sono lasciati nella soluzione di collagenasi e ricontrollato ogni cinque minuti. </li><li> Lavare gli ovociti tre volte con soluzione salina modificato Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 Hepes mM, pH 7,5), e trasferirli per un piatto del diametro di 100 mm Petri contenenti MBS più 1% di penicillina / streptomicina. Gli ovociti sono ora pronti per essere microiniettati. Se microiniezione verrà eseguita in un altro giorno, conservare gli ovociti a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, selezionare gli ovociti maturi fase VI per microiniezione. Questi ovociti sono grandi, con un buon contrasto tra l&#39;emisfero animale nero e il color crema emisfero vegetali. </li><li> Trasferire il maturare ovociti VI tappa in una micropiastra (Nunc, 10 microlitri di volume bene). Questo dovrebbe essere fatto con cura, utilizzando una pipetta da 200 microlitri con un puntale che è stato tagliato alla fine di permettere undisrupted aspirazione degli ovociti. </li></ol> Parte 2: microiniezione degli ovociti di Xenopus <ol><li> Preparare il supporto all&#39;importazione da microiniettati con l&#39;aggiunta di una piccola quantità di 1% blu di bromofenolo, per facilitare la visualizzazione di microiniezione. Per esempio, si aggiunge 1 ml di blu bromofenolo a 10 ml di substrato. </li><li> Mettere una piccola striscia di Parafilm su un piatto di diametro 100 mm Petri, ed erogare un 5-microlitri goccia della soluzione da iniettare sulla striscia Parafilm. </li><li> Riempire un ago per iniezione precedentemente tarato (ottenuto tirando una 6,6 microlitri micropipetta Drummond con la Iniettare + Estrattore Matic) con la soluzione da iniettare. Per questo, il microinjector è impostato su modalità di aspirazione. Per calibrare l&#39;ago dell&#39;iniezione fare segni sul punto l&#39;ago ogni 0,5 mm, che corrispondono ad un volume di 50 nl. </li><li> Per l&#39;iniezione citoplasmatica, inserire la punta di un ago in un ovocita nell&#39;emisfero vegetali, molto vicino alla emisfero animale, con un angolo di circa 45 gradi. Girare l&#39;impostazione microinjector a microinject e microinject ogni ovocita con 50 nl di sottofondo importazione. I segni punto sul ferro sono usati per monitorare la quantità di substrato che è stato iniettato. </li><li> Trasferire gli ovociti iniettati di un piccolo (35-mm di diametro) Petri riempite con MBS, e incubare a temperatura ambiente per la quantità di tempo desiderato (punti di tempo sono scelti in modo da consentire l&#39;osservazione del substrato importazione associati con gli NPC, ciò si verifica tra 10 e 30 minuti per le proteine ​​e per i virus che sono attivamente trasportati verso la NPC, questo tempo dipende anche dal sito di iniezione e la dimensione della proteina / virus). </li><li> Quando l&#39;incubazione è completa, trasferire ovociti per un 4-ml, flaconcino di vetro contenente il 2% glutaraldeide in MBS, e fissare una notte a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: dissezione di ovociti di Xenopus <ol><li> Il giorno dopo, lavare gli ovociti 3 volte con MBS. </li><li> Trasferimento ovociti ad una piccola scatola di Petri riempite con tampone iposodica (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl 2, 10 HEPES mM, pH 7,5). Utilizzando un microscopio da dissezione e dissezione pinzette, rimuovere il polo vegetale da ogni ovocita. E &#39;utile per stabilizzare l&#39;ovocita viene sezionato con un paio di pinzette, mentre l&#39;altra coppia è usato come forbici per rimuovere il palo vegetale. A questo punto è possibile valutare il successo della microiniezione dalla presenza di una sfumatura blu nel citosol. Il protocollo è continuata solo per gli ovociti che sono stati microiniettati successo. Inoltre, se i campioni devono essere preparati per EM, questo passo dissezione rende molto più facile trovare il nucleo durante il taglio e sezionamento dei campioni. </li><li> Fissare gli ovociti sezionato di nuovo con il 2% glutaraldeide in LSB per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la fissazione, lavare gli ovociti sezionato tre volte con LSB. </li></ol> Parte 4: Preparazione di ovociti iniettati per incorporamento e EM sottile sezionamento <ol><li> Trasferire gli ovociti sezionato a una diapositiva depressione. Aspirare la maggior quantità di liquido possibile, e poi rapidamente (in modo che non si seccano) coprono gli ovociti sezionato con il 2% agarosio a basso punto di fusione. Mentre l&#39;agarosio è ancora morbido, l&#39;uso di un puntale per separare gli ovociti gli uni dagli altri, e per assicurare che ogni ovocita è rivolto verso l&#39;alto o verso il basso (non lateralmente). </li><li> Lasciare che il agarosio solidificare per circa 10 minuti. Una volta che l&#39;agarosio si solidifica, usare una lama di rasoio per tagliare l&#39;agarosio in piccoli pezzi, ciascuno dei quali contiene un ovocita sezionato. </li><li> Posizionare il agarosio-embedded ovociti in un 4-ml flacone di vetro, e li post-fix con l&#39;1% OsO 4 in LSB per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il campione tre volte in LSB. Se necessario, conservare il campione a 4 ° C durante la notte e proseguire il protocollo il giorno successivo. </li><li> Sequenziale disidratano i campioni in una serie ascendente di alcool (50, 70, e 90% di etanolo per 20 minuti ciascuno). Questo è seguito da due cambiamenti in 100% etanolo per 15 minuti ciascuno. Infine disidratano campioni con 100% di acetone per 15 min. </li><li> Infiltrati campioni con una miscela 1:1 di Epon (Fluka) e acetone per un&#39;ora, seguita da infiltrazione con una miscela 02:01 di Epon e acetone per due ore e, infine, in puro Epon per almeno sei ore. </li><li> I campioni in formelle piatto pieno di fresca pura Epon. Gli ovociti sono orientate in modo tale che il lato del nucleo più vicino al sito di iniezione - in questo caso la parte degli ovociti che è stato sezionato - sarà sezionato per primo. Questo passo ottimizza la possibilità di visualizzare l&#39;importazione del substrato scelto. </li><li> Infine, polimerizzare il Epon per due giorni a 60 ° C. </li><li> Per visualizzare i campioni, i blocchi sono tagliati e poi sezionato con un ultramicrotomo. Le sezioni sono trasferiti su griglie di EM, macchiato con procedura standard, e visualizzati con un microscopio elettronico a trasmissione. Non mostrare questa parte del protocollo in quanto è procedura standard di EM. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Se il protocollo ha avuto successo, poi l&#39;involucro nucleare (NE) e NPC dovrebbe essere chiaramente visibile in EM micrografie. A seconda del substrato e iniettato la quantità di tempo che intercorre tra l&#39;iniezione e la fissazione, il substrato deve essere visibile la faccia citoplasmatica della NPC, nel NPC, o il volto nucleare della NPC. La figura 1 mostra una sezione trasversale NE con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato con capsidi del baculovirus AcMNPV, incubate a 4 ° C per quattro ore, e trattati per l&#39;inclusione e la sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Una docking capside la faccia citoplasmatica di un NPC è indicata da una freccia bianca. Al contrario, la figura 2 mostra una sezione trasversale NE con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato il virus parvovirus Minuto di topi (MVM), incubate a temperatura ambiente per quattro ore, e elaborati per l&#39;integrazione e la sezione sottile EM come descritto. Utilizzando questa tecnica, abbiamo scoperto che MVM induce interruzioni del NE (Cohen e Pante, 2005). Parentesi indicano interruzioni nella NE. Frecce indicano i PNG. Capsidi MVM putativo associati alla NE sono indicati da frecce bianche. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figura 1" width="600" height="459" /> Figura 1: al microscopio elettronico a NE sezione trasversale con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato con capsidi del baculovirus MNPV Ac, incubate a 4 ° C per quattro ore, e trattati per inclusione e sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Capsidi sono indicati da frecce bianche. Scala grafica: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="264" /> Figura 2: al microscopio elettronico a NE sezione trasversale con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato il virus parvovirus Minuto di topi (MVM), incubate a temperatura ambiente per quattro ore, e elaborati per l&#39;integrazione e la sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Parentesi indicano interruzioni nella NE. Capsidi MVM putativo associati alla NE sono indicati da frecce bianche. Scala grafica: 100 nm.

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	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Microiniezione degli ovociti di Xenopus combinato con sottili sezionamento EM è uno strumento altamente efficace per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. Questo sistema è stato utilizzato per mappare fasi distinte di importazione attraverso la NPC, per esempio l&#39;interazione di un substrato di importazione nucleare con componenti strutturali della NPC, come i filamenti citoplasmatici e basket nucleare (recensito da Pante, 2006). E &#39;stato anche utilizzato per studiare il nucleare di importazione nuc...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Microiniezione degli ovociti di Xenopus laevis seguita da sottile sezionamento microscopia elettronica (EM) è un sistema eccellente per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. A causa del suo nucleo di grandi dimensioni e ad alta densità di complessi poro nucleare (NPC), il trasporto nucleare può essere facilmente visibili nel ovociti di Xenopus. Di conoscere molto dei meccanismi di importazione ed esportazione nucleare è stata acquisita attraverso l&#39;utilizzo di questo sistema (recensito da Pante, 2006). Inoltre, abbiamo utilizzato microiniezione degli ovociti di Xenopus di sezionare le vie importazione nucleare di diversi virus che si replicano nel nucleo ospitante. Qui mostriamo la microiniezione citoplasmatica degli ovociti di Xenopus con un substrato importazione nucleare. Mostriamo anche la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento EM, tra cui la dissezione, disidratazione e inclusione degli ovociti in una resina epossidica embedding. Infine, mettiamo a disposizione dei risultati rappresentativi per ovociti che sono stati microiniettati con il capside del nucleopolyhedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o il virus Minuto parvovirus del Mouse (MVM), e discutere le potenziali applicazioni di questa tecnica.

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Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Ovociti con un substrato di importazione nucleare, così come la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento microscopia elettronica.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

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Biology

22.8K Views.  University of British Columbia - UBC. Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica di Xenopus laevis Ovociti con un substrato di importazione nucleare, così come la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento microscopia elettronica.

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Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Ricerca

Biologia

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...