Concede NINDS NS49720 e NS65819, e NCI concedere CA97257

1. Preparazione cellule del tumore. Cellule per xenotrapianti tumore al cervello umano può essere acquistato sia da tumori propagata come escrescenze sottocutaneo in topi atimici, o da colture cellulari. L&#39;utilizzo di entrambe le fonti cella è discusso più avanti, insieme a dimostrazione di un metodo per l&#39;impianto delle cellule. Per preparare le cellule dai tumori sottocutanei per il trasferimento al comparto intracranici, i tumori asportati fianco sono collocati in capsule di Petri, dove il tessuto è inizialmente tritato con un bisturi e poi meccanicamente interrotta da pipettaggio ripetitivo per creare una sospensione aggregato di cellule 1. La sospensione aggregato di cellule viene poi fatto passare attraverso una maglia di nylon 70 mM filtro per produrre un&#39;unica sospensione cellulare adeguata per iniezioni intracraniche. La sospensione cellulare viene centrifugato a 1000 rpm per 10 minuti a 4 ° C e il supernatante aspirato prima di risospendere il pellet cellulare in un volume adeguato di siero senza mezzi per ottenere una concentrazione finale di lavoro (vedi sotto). Per la preparazione di linee cellulari stabilizzate per l&#39;impianto intracranici, le cellule vengono raccolte a monostrati trypsinizing, o attraverso la raccolta di culture sospensione neurosfere, poi centrifugazione e risospendere le cellule come sopra indicato 2. Il numero di cellule iniettate è variabile dipendente sul posto neuroanatomiche di iniezione. Per preparazioni iniettabili sopratentoriali abbiamo regolarmente iniettare 3-5 x 10 5 cellule in 3 ml di siero-multimediale gratuito (DMEM), mentre per il tronco encefalico iniezioni 3, da un minimo di 5 x 10 4 cellule vengono iniettate in 0,5 microlitri. Iniettare volumi maggiori di quanto raccomandato può causare reflusso delle cellule tumorali attraverso il tratto dell&#39;ago, con esofitica risultante (Figura 1), piuttosto che la crescita dei tumori intracranici. Dopo il ritiro del campione per l&#39;iniezione intracranica, la sospensione cellulare residua deve essere posto in ghiaccio, con contenuti misti di frequente per mantenere la concentrazione adeguata, mentre il completamento stabilimento intracranica del tumore tra i membri di una serie di iniezione. 2. Cella impianto del tumore Si noti, tutte le procedure descritte di seguito sono stati esaminati e approvati dal Utilizzare animali Istituzionale e Comitato Cura presso l&#39;Università di California San Francisco. <ol><li> L&#39;area chirurgica deve essere preparato a spruzzo tutte le superfici con un disinfettante, come soluzione di clorexidina al 2%. Dopo aver usato il disinfettante, le seguenti forniture deve essere posto in zona chirurgica: <ul><li> Riscaldamento pad per mantenere la temperatura corporea del mouse </li><li> Due piccoli piatti Petri, uno contenente perossido di idrogeno al 3%, e uno contenente 2% di clorexidina </li><li> Garza sterile e cotone tamponi </li><li> Bisturi sterile monouso </li><li> Autoclave cucitrice chirurgica </li></ul></li><li> Per l&#39;anestesia uno iniettato anestetico dovrebbe essere utilizzato, in genere uno ketamina-xylazina miscela. </li><li> Una volta che il mouse è anestetizzato, il cuoio capelluto è preparato da tampone più volte con un pezzo di garza sterile immerso nella soluzione di clorexidina. Unguento occhio deve essere applicato per mantenere l&#39;umidità adeguata durante la procedura. Usando un bisturi sterile, completo di un&#39;incisione sagittale il parieto-occipitale osso, circa 1 cm di lunghezza. La superficie del cranio esposto è poi puliti con un tampone di cotone imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. Il bregma dovrebbe essere evidente a questo punto (vedi video). </li><li> Le coordinate per l&#39;iniezione di cellule tumorali possono variare secondo il sito desiderato per lo stabilimento di tumore. Il seguente rappresenta la procedura che usiamo per tumore intracerebrale stabilimento 2 in una posizione neuroanatomici in cui molti pazienti affetti da tumore al cervello esperienza di sviluppo del tumore. Altre località di interesse nella ricerca sul cervello tumore includono il ponte, per la modellazione anatomica dei tumori del tronco encefalico 3, e le iniezioni subdurale per la modellazione l&#39;ubicazione dei tumori meningei 4. Prima dell&#39;iniezione di cellule tumorali, utilizzare una sterile 25 ago appuntito manometro per forare il cranio a 2 mm a destra del bregma e 1 mm anteriore alla sutura coronale, creando un varco per l&#39;iniezione di cellule tumorali (vedi video). Questa procedura funziona bene sia per i topi e ratti (22 gauge per i ratti). </li><li> Prima di disegnare le cellule nella siringa, mescolare il contenuto della sospensione cellulare toccando con un dito. Caricare la siringa con la quantità desiderata di sospensione cellulare, facendo attenzione a non creare bolle d&#39;aria. L&#39;esterno della siringa deve poi essere puliti con un tampone imbevuto di alcool per pulire la parte esterna priva di cellule aderenti, che aiuterà a prevenire creazione e la crescita tumorale extracranica (Figura 1A). Per garantire che la profondità di iniezione appropriato si ottiene, usare un bisturi per tagliare tre millimetri al largo della punta di una punta P20 pipetteman. Questa sezione della punta può essere montato sulla siringa e agirà per limitare la profondità di iniezione, e sarà inoltre assicurare che il tip l&#39;ago della siringa di 3 mm dalla parte inferiore del cranio. Posizionare la siringa perpendicolare al cranio e nel foro creato in precedenza, e iniettare lentamente la sospensione cellulare (una sospensione 3μL deve essere iniettato in un periodo di 1 minuto). Un angolo inadeguato di inserimento siringa può provocare l&#39;iniezione intraventricolare di cellule e la successiva diffusione spinale (Fig. 1B: Destra) Al termine dell&#39;iniezione, lasciare l&#39;ago in posizione per un altro minuto, poi lentamente ritirarsi (vedi video): questi passi aiuteranno a ridurre riflusso delle cellule tumorali. </li><li> In alternativa all&#39;approccio autonomamente sia a mano libera per l&#39;impianto delle cellule tumorali intracranici 5, si può usare un piccolo telaio stereotassico animale (F panel di visione schematica), che promuove in genere luogo di iniezione più consistente, ma a spese di notevoli quantità di termini della procedura. Nella nostra esperienza, due membri del personale chirurgico può iniettare fino a 60 topi / ora quando si usa l&#39;approccio a mano libera, mentre la massima velocità di iniezione con una piccola cornice stereotassica animali è di circa 15 topi / ora. Espediente procedurale è una considerazione importante quando si iniettano grandi serie di topi, e aiuta a ridurre il tempo in cui sono lasciati cellule tumorali, da iniettare, sul ghiaccio. </li><li> Pulire il cranio con perossido di idrogeno al 3% e asciugare con un tampone sterile di cotone asciutto. Applicare la cera sterile osso al foro. Utilizzando una pinza, disegnare insieme il cuoio capelluto sopra il teschio e fiocco a chiudere. Ottimale per la guarigione, il cuoio capelluto devono essere pinzati con il derma di ogni lato del cuoio capelluto contro l&#39;altra (contro la parte inferiore parte inferiore). Il cuoio capelluto pinzati devono essere puliti con soluzione di Clorexidina, buprenorfina e poi somministrato per via sottocutanea per post-operatorio del dolore. </li><li> Monitorare tutti i mouse dopo l&#39;intervento fino a diventare ambulanti e mantenere la normale attività. Tipicamente, il tempo di recupero è di circa 30 minuti. </li></ol> 3. Monitoraggio bioluminescenza della crescita tumorale <ol><li> Sfondo. Di imaging bioluminescenza (BLI) si basa sulla ossidazione dei luciferina [d-(-) -2 - (60-idrossi-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-carbossilico] in presenza di ossigeno e di adenosina trifosfato (ATP). Questa reazione è catalizzata dalla luciferasi enzima che converte l&#39;energia chimica in fotoni con conseguente emissione di luce. Le cellule umane possono essere modificati per esprimere la luciferasi (vedi sotto), con solo luciferasi che esprimono cellule capaci di emettere luce in presenza del substrato luciferina. C&#39;è luminescenza livello minimo da animali trattati con luciferina ospita, in modo tale che vi è un molto favorevole rapporto segnale-rumore per rilevare le emissioni di luminescenza da cellule tumorali luciferasi modificati, consentendo il monitoraggio altamente sensibile della crescita tumorale e risposta alla terapia in vivo. Inoltre, luciferasi e il suo substrato, luciferina, hanno dimostrato di essere non tossico per le cellule di mammifero, e abbiamo osservato differenze funzionali tra cellule che esprimono luciferasi rispetto ai corrispondenti cellule non modificate. Luciferina attraversa facilmente le membrane cellulari e la barriera emato-encefalica dopo intraperitoneale (ip) o endovenosa (ev) nei topi, consentendo in tal modo l&#39;imaging di ogni scomparto che contiene luciferasi modificato cellule. Il livello di emissione di fotoni e lo spettro della luce emessa dalla luciferasi modificati cellule è sufficiente per penetrare nei tessuti degli animali ricerca piccoli, come topi e ratti, e può essere rilevata esternamente con scarsa illuminazione termocamere. La natura non invasiva di imaging bioluminescenza permette il monitoraggio ripetuto di crescita tumorale e risposta alla terapia nei soggetti singolo animale. </li><li> Fonti di cellule impiantate devono essere stabilmente modificata per l&#39;espressione lucciola luciferasi. Tali fonti di cellule possono essere acquistati o ottenuti nei singoli laboratori con lentivirus che sono state costruite per l&#39;espressione costitutiva della luciferasi. Si consiglia vivamente l&#39;uso di cellule modificate con lentivirus codifica luciferasi, piuttosto che plasmide, per garantire la stabilità l&#39;espressione cellulare della luciferasi in vivo, che è necessario per l&#39;imaging luminescenza quantitative per fornire un&#39;indicazione precisa delle variazioni del carico tumorale di soggetti singoli animali che vengono ripetutamente ripreso nel corso di un esperimento. </li><li> BLI monitoraggio. Si consiglia di effettuare l&#39;imaging quantitativo bioluminescenza (qBLI) 1x-2x settimanale, con inizio una settimana dopo l&#39;iniezione delle cellule tumorali. Il nostro qBLI sia effettuato utilizzando i IVIS Lumina Imaging Station (Caliper Life Sciences), ed i nostri risultati indicano dati simili si ottengono utilizzando il Lumina IVIS, IVIS il 150 o il 200 stazione di imaging IVIS. In preparazione per l&#39;imaging, i topi sono simultaneamente anestetizzati con ketamina / xylazina e somministrato luciferina (D-Luciferin sale di potassio, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences) tramite iniezione intraperitoneale, con i topi ripreso 12 minuti dopo l&#39;iniezione. La farmacocinetica di luciferina indicano che il tempo tra amministrazione di luciferina e la determinazione della luminescenza cellulare dovrebbe essere compresa tra 10-15 minuti dopo l&#39;iniezione di luciferina, al fine di ottenere la massima emissione di luminescenza e grande sensibilità di rilevazione. Il periodo di tempo selezionato entro l&#39;intervallo di 10-15 minuti di tempo dovrebbe essere mantenuto il più costante tra gli animali che si sta creando l&#39;immagine. E &#39;estremamente importante per mantenere la coerenza nel tempo tra iniezione di luciferina e ottenere letture BLI. Regioni di interesse che comprende l&#39;area intracranica del segnale vengono definite mediante software di immagini di vita (Figura 2), e il photons/s/sr/cm2 totale (fotoni al secondo per steradiante per cm quadrato) sono registrati (vedi video). </li><li> Analisi dei dati. Mentre la crescita tumorale e risposta alla terapia sono monitorati nei singoli animali, consigliamo vivamente i gruppi di trattamento di almeno 8 per aumentare la certezza statistica di conclusioni concernenti la risposta del tumore, o la loro mancanza, alla terapia. Per quanto riguarda la presentazione dei risultati qBLI, letture luminescenza vengono convertiti in valori normalizzati dividendo luminescenza ogni mouse s, ottenuti durante e dopo il completamento del regime terapeutico, con la sua luminescenza corrispondente pretrattamento massima di lettura 6,7. Per l&#39;analisi di sopravvivenza, di Kaplan-Meier stimatore 8 è usato, e da cui sono generate le curve di sopravvivenza, sopravvivenza mediana ei valori determinati. Le differenze tra le curve di sopravvivenza sono confrontati con un log-rank test 9. </li><li> Recupero del cervello per la successiva analisi di tumore trattati e non trattati. Al momento l&#39;eutanasia degli animali, il cervello del mouse deve essere rapidamente asportata (vedi video), e sia messo in formalina per successive analisi della morfologia del tumore e di immunoistochimica, o dovrebbe essere montato in ottobre per il congelamento del campione. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Nell&#39;esempio mostrato in figura 3a, topi che ricevevano intracranica iniezione di cellule tumorali sono stati monitorati per luminescenza intracranica fino successivi valori di luminescenza significa indicato progressiva crescita del tumore, e al quale la terapia di tempo è stato avviato (a partire grigio freccia al giorno 34: erlotinib somministrato ogni giorno a 150 mg / kg fino a quando l&#39;eutanasia richiesto). Valori di luminescenza per ogni mouse sono impostati su un valore normalizzato di 1 al momento di iniziare la terapia, con letture luminescenza successive per ogni mouse normalizzato al suo valore finale di imaging pre-trattamento. A titolo di esempio, un mouse con un finale di pre-trattamento lettura luminescenza di 2,0 x 10 7 fotoni / sec al giorno 34, la cui luminescenza era aumentato a 6,0 x 10 7 fotoni / sec al giorno 38, avrebbe un valore di 38 luminescenza normalizzato giorni di 3,0. Significa bioluminescenza normalizzato e corrispondente errore standard per il controllo e gruppi di trattamento sono riportati per ogni punto di tempo di imaging. In questo esempio, una differenza significativa della luminescenza normalizzato è evidente al primo punto imaging in tempo successivo l&#39;inizio della terapia (giorno 38), con la differenza di luminescenza gruppo significa che mostrano un ulteriore aumento in momenti successivi. Nella maggior parte dei casi, antitumorale della terapia, come indicato dalla qBLI, è accompagnata da una corrispondente differenza significativa nella sopravvivenza (cioè, p &lt;0,05), come nel caso di specie (Figura 3B). Pannelli 3C e 3D mostrare adiacente ematossilina e eosina e sezioni colorate anti-EGFR di cervello di topo ottenute al momento della eutanasia, dopo il posizionamento del cervello asportato in formalina e successive paraffina-embedding di sezionamento. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Indicazioni di errori iniezione intracranica. A) esofitica (extracraniche) la crescita del tumore (cerchio rosso) può essere causato da troppo grande un volume di iniezione, sospensione cellulare residua attaccato alla siringa, oppure di revocare la siringa troppo rapidamente dopo l&#39;iniezione di cellule tumorali. B) Iniettare cellule tumorali nei ventricoli spinale può causare la divulgazione di tumore (il mouse a destra), in contrasto correttamente iniettato cellule tumorali, il segnale per i quali rimane localizzata nel sito di iniezione (mouse a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Calore mappa rappresentazioni dell&#39;immagine di intensità bioluminescenza per topi rappresentante di controllo (a sinistra) e il trattamento (a destra) i gruppi di un esperimento di risposta alla terapia. Il software immagine vivente può essere impostato per definire le aree di interesse (cerchi rossi), o operatori strumento può definire regioni di interesse manualmente. Per l&#39;utilizzo di immagini come queste per la costruzione di figura, si consiglia che l&#39;operatore strumento mostra le immagini mappa di calore utilizzando lo stesso calore gamma bioluminescenza mappa (parte superiore della figura), a fornire una rappresentazione visiva della portata della bioluminescenza differenza tra soggetti animali. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt = &quot;Figura 3&quot; /&gt; Figura 3. Bioluminescenza, la sopravvivenza e l&#39;analisi del tessuto tumorale da un esperimento in cui la risposta terapeutica è evidente. A) Terreno di letture di bioluminescenza significa per il controllo e topi gruppo di trattamento, con errore standard indicato per ogni punto di imaging. B) appezzamento di sopravvivenza per i topi stessi; p-value determinato attraverso l&#39;uso di log-rank test 7. C) H &amp; E macchiato sezione di cervello di topo con tumore. D) EGFR sezione macchiato. E ed F) Ingrandimenti delle aree indicate dai pannelli C e D, rispettivamente, con E riquadro con colorazione negativa per proteina soppressore del tumore di PTEN.

<ol>
	<li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM.">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li><li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats.">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li><li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging.">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , (2009).</li><li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma.">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li><li>Ozawa, T., James, C. D., Van Meir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Brain+Tumor+Cell+and+Tumor+Tissue+Transplantation+Models.">Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models.</a> CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. , 147-162 (2009).</li><li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel.">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li><li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy.">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations.">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li><li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures.">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li><li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression:+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions.">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ortotopico (intracranica) tumore al cervello stabilimento xenotrapianto fornisce un microambiente adeguato 10 per il cancro modellazione sistema nervoso centrale da testare per la risposta terapeutica. Questo tipo di modellazione fornisce inoltre informazioni relative all&#39;accesso terapeutico al cervello e tumore al cervello, che è di fondamentale importanza per determinare se un agente sperimentale dovrebbe essere avanzata per la valutazione di studi clinici nei pazienti. Poiché la quantità di tumore xenograft intracranica non può essere misurata direttamente, ad esempio per calibri, il monitoraggio longitudinale della crescita tumorale intracranica e la risposta alla terapia richiede imaging non invasiva, con la nostra imaging bioluminescenza dell&#39;esperienza che indica come l&#39;approccio più pratico per gli esperimenti il ​​cui obiettivo primario sta valutando l&#39;estensione della risposta del tumore alla terapia. Quando i risultati di imaging bioluminescenza sono combinati con l&#39;analisi di sopravvivenza soggetto animale, i due insiemi di dati forniscono un approccio potente e affidabile per la valutazione sperimentale dell&#39;efficacia terapeutica. Infine, è estremamente importante che intracranica xenotrapianti di tumori al cervello sono raccolti da soggetti animali sacrificati al fine di valutare gli effetti morfologici e molecolari della terapia, e per questo preferiamo resezione intero cervello al momento di eutanasia, con la conservazione del cervello asportato per successive analisi. Considerando che la presentazione precedente è stato fatto specifico per la ricerca del tumore al cervello, i concetti sono certamente generalizeable ad altri tumori umani che sono suscettibili di modellazione ortotopico nei roditori.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Scapels</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975</td>
			<td>No.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dunlap</td>
			<td>HP950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22028563</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Chlorhexidine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9756995</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H312P-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Needle</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton Sharp Microsyringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>20734</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Stapler and Staples</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>59020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Frame</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoeling</td>
			<td>51725</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Potassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen Lumina</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging

Modelli di trapianto utilizzando cellule umane di tumore al cervello hanno servito una funzione essenziale in neuro-oncologia di ricerca per molti anni. In passato, la procedura più comunemente utilizzata per il consumo umano stabilimento xenograft tumore consisteva nella raccolta di cellule da fiaschi cultura, seguita dalla iniezione sottocutanea delle cellule raccolte in topi immunocompromessi. Che tale approccio vede ancora frequente uso in molti laboratori, c&#39;è stato un significativo spostamento di enfasi negli ultimi dieci anni verso la creazione xenotrapianto ortotopica, che, nel caso di tumori cerebrali, richiede l&#39;iniezione di cellule tumorali in adeguate strutture neuroanatomiche. Perché stabilimento xenotrapianto intracranica elimina la possibilità di monitorare la crescita del tumore attraverso la misurazione diretta, come ad esempio mediante l&#39;uso di pinze, spostamento di interesse verso modelli ortotopico tumore cerebrale xenotrapianto ha reso necessario l&#39;utilizzo di imaging non invasiva per la valutazione della massa tumorale in animali ospitante. Dei metodi di imaging attualmente disponibili, il monitoraggio bioluminescenza è generalmente considerato di offrire la migliore combinazione di sensibilità, opportunità e costi. Qui dimostreremo procedure per l&#39;istituzione ortotopica tumore al cervello, e per monitorare la crescita tumorale e la risposta al trattamento durante il test terapie sperimentali.

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Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Luciferasi modificati xenotrapianti di tumori al cervello umano può essere stabilita intracranially in topi atimici, con successivo monitoraggio della crescita tumorale e la risposta alla terapia con l&#39;imaging bioluminescenza. In combinazione con l&#39;analisi di sopravvivenza, il monitoraggio bioluminescenza è uno strumento di ricerca indispensabile per test pre-clinici di terapie che sono considerati per il trattamento dei tumori cerebrali.

Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

39.0K Views.  University of California, San Francisco - UCSF. Luciferasi modificati xenotrapianti di tumori al cervello umano può essere stabilita intracranially in topi atimici, con successivo monitoraggio della crescita tumorale e la risposta alla terapia con l'imaging bioluminescenza. In combinazione con l'analisi di sopravvivenza, il monitoraggio bioluminescenza è uno strumento di ricerca indispensabile per test pre-clinici di terapie che sono considerati per il trattamento dei tumori cerebrali.

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Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Imaging cerebrale Indagine di compromettere l&#39;effetto delle emozioni sulla cognizione

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Ricerca

Neuroscienze

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments in vision research require displays with more than 12 bits of luminance resolution. Several solutions are available. Bit++ 1 and DataPixx 2 use the Digital Visual Interface (DVI) output from graphics cards and high resolution (14 or 16-bit) digital-to-analog converters to drive analog display devices. The VideoSwitcher 3 described here combines analog video signals from the red and blue channels of graphics cards with different weights using a passive resister network 4 and an active circuit to deliver identical video signals to the three channels of color monitors. The method provides an inexpensive way to enable high-resolution monochromatic displays using conventional graphics cards and analog monitors. It can also provide trigger signals that can be used to mark stimulus onsets, making it easy to synchronize visual displays with physiological recordings or response time measurements.
Although computer keyboards and mice are frequently used in measuring response times (RT), the accuracy of these measurements is quite low. The RTbox is a specialized hardware and software solution for accurate RT measurements. Connected to the host computer through a USB connection, the driver of the RTbox is compatible with all conventional operating systems. It uses a microprocessor and high-resolution clock to record the identities and timing of button events, which are buffered until the host computer retrieves them. The recorded button events are not affected by potential timing uncertainties or biases associated with data transmission and processing in the host computer. The asynchronous storage greatly simplifies the design of user programs. Several methods are available to synchronize the clocks of the RTbox and the host computer. The RTbox can also receive external triggers and be used to measure RT with respect to external events. 
Both VideoSwitcher and RTbox are available for users to purchase. The relevant information and many demonstration programs can be found at <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a>.

Conventional computer hardware can not generate visual stimuli with sufficiently high grayscale resolution and measure response times with sufficient accuracy. We describe how to use the VideoSwitcher to produce high-resolution monochromatic displays, and the RTbox to measure response times with high accuracy on conventional computer hardware.

Abilitazione ad alta risoluzione display in scala di grigi e misurazioni accurate Tempo di risposta su computer convenzionali

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-analisi della struttura e delle funzioni cerebrali con fMRI e Diffusion-weighted imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Kinematic Analysis Using 3D Motion Capture of Drinking Task in People With and Without Upper-extremity Impairments

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion capture with an optoelectronic camera system is considered as golden standard for kinematic movement analysis and is increasingly used as outcome measure to evaluate the movement performance and quality after an injury or disease involving upper extremity movements. This article describes a standardized protocol for kinematic analysis of drinking task applied in individuals with upper extremity impairments after stroke. The drinking task incorporates reaching, grasping and lifting a cup from a table to take a drink, placing the cup back, and moving the hand back to the edge of the table. The sitting position is standardized to the individual&#39;s body size and the task is performed in a comfortable self-paced speed and compensatory movements are not constrained. The intention is to keep the task natural and close to a real-life situation to improve the ecological validity of the protocol. A 5-camera motion capture system is used to gather 3D coordinate positions from 9 retroreflective markers positioned on anatomical landmarks of the arm, trunk, and face. A simple single marker placement is used to ensure the feasibility of the protocol in clinical settings. Custom-made Matlab software provides automated and fast analyses of movement data. Temporal kinematics of movement time, velocity, peak velocity, time of peak velocity, and smoothness (number of movement units) along with spatial angular kinematics of shoulder and elbow joint as well as trunk movements are calculated. The drinking task is a valid assessment for individuals with moderate and mild upper extremity impairment. The construct, discriminative and concurrent validity along with responsiveness (sensitivity to change) of the kinematic variables obtained from the drinking task have been established.

This protocol describes an objective method to evaluate the movement performance and sensorimotor function of the upper extremity applied to individuals with stroke and healthy controls. A standardized test procedure, kinematic analysis and outcome variables for three-dimensional motion capture of drinking task are provided.

Analisi cinematica utilizzando 3D Motion Capture di bere compito in persone con e senza i danni del superiore-estremità

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analizzando l'attività neurale e connettività utilizzando dati EEG intracranico con SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...