Il nostro protocollo supera la finestra di imaging a bioluminescenza limitata includendo un tag GFP che facilita anche il rilevamento e la quantificazione della micrometastasi mediante analisi PCR. Poiché il tag GFP elude la finestra di acquisizione della bioluminescenza limitata, è possibile visualizzare più soggetti senza la perdita del segnale e il potenziale di risultati falsi negativi è limitato. Questo studio sarà utile ai ricercatori per la valutazione dell'efficacia terapeutica degli agenti antitumorali.
Questa metodologia fornisce un modello utile per i ricercatori interessati all'EMT, alla resistenza ai farmaci e ai meccanismi delle cellule staminali tumorali relativi al processo metastatico e allo sviluppo di farmaci anti-cancro. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, tamponare la quarta ghiandola mammaria sinistra con alcool e utilizzare forcelle fini a dente di ratto per sollevare leggermente la quarta ghiandola mammaria. Assicurandosi che la punta sia smussata, inserire un ago calibro 25 attaccato a una siringa millilitro contenente 100 microlitri di miscela di matrice di membrana basante cellulare e ritrarre leggermente lo stantuffo per assicurarsi che l'ago non contatti alcun recipiente sanguigno.
Per risultati comparativi, il sito di iniezione di cellule tumorali deve essere coerente tra tutti gli animali riceventi. Se nessun sangue entra nella siringa, iniettare lentamente l'intero volume di soluzione nel cuscinetto grasso mammario. Una massa sollevata rotonda apparirà sotto la pelle.
Attendere da 10 a 15 secondi affinché la matrice della membrana basale si indurisca prima di rimuovere l'ago e consentire allo xenoinnesto di crescere liberamente senza interruzioni per sette o 10 giorni prima di eseguire una misurazione delle dimensioni del tumore. Quindi utilizzare le pinze per misurare le dimensioni dello xenograft in tutti i topi e determinare il volume tumorale usando l'equazione come indicato. Prima di immaginare gli animali da studio, immagini tre topi portanti di tumore aggiuntivi per 40 minuti a intervalli di due minuti utilizzando i parametri come indicato per ottenere la cinetica della luciferina per lo studio.
Utilizzare il segnale di bioluminescenza misurato di picco per definire la finestra di tempo di acquisizione dell'immagine ottimale per tutti i punti di tempo successivi. Per eseguire l'imaging della metastasi, coprire il tumore primario con una manica tagliata da un guanto nero e posizionare un mouse anestetizzato nello scanner, quindi posizionare il segnale di luciferina utilizzando gli stessi parametri appena dimostrati con il lato ventrale del mouse rivolto verso la fotocamera per l'imaging della metastasi polmonare e il lato dorsale del mouse rivolto verso la fotocamera per l'imaging della metastasi cerebrale. Utilizzando uno scanner e un software di analisi dei dati, disegnare una regione di interesse sull'area di immagine per garantire che l'intero organo di interesse sia coperto per consentire la valutazione del carico metastatico e quantificare l'output di bioluminescenza come flusso totale e fotoni al secondo.
Immediatamente dopo la quantificazione del segnale di bioluminescenza, raccogliere il cervello e il tessuto polmonare e risciacquare rapidamente gli organi in PBS per rimuovere eventuali macchie superficiali del sangue. Posizionare gli organi su una piastra di plastica nera a bassa fluorescenza automatica e trasportare i campioni su uno scanner a fluorescenza multispettrale dotato di capacità di unmixing spettrale per il rilevamento della GFP. Per acquisire immagini GFP multispettrali degli organi estratti, scansionare gli organi da 500 a 720 nanometri con dimensioni del passo di 10 nanometri.
Per ottenere il profilo di fluorescenza automatica dei tessuti, scansionare gli organi asportati dei topi di controllo non iniettati. Inoltre, immagini GFP tessuti positivi come il tumore primario per acquisire profilo GFP misto a fluorescenza automatica. Elaborare questi spettri secondo il protocollo del produttore per stabilire una libreria spettrale con GFP puro e profili di fluorescenza automatica.
Dopo aver confermato l'accuratezza della libreria spettrale e aver separato il segnale GFP dallo sfondo di fluorescenza automatica dei tessuti, utilizza la stessa libreria per unmix tutte le immagini sullo studio. Per l'estrazione del DNA dopo il congelamento a scatto, posizionare l'intero cervello in un tubo omogeneizzante da cinque millilitri contenente due millilitri di tampone di lisi del DNA e utilizzare un omogeneizzatore impostato su 50 per omogeneizzare il tessuto. Quando il tessuto è stato completamente omogeneizzato, trasferire un millilitro del lisato in un tubo di microcentrifugo a due millilitri privo di DNA e RNAse e isolare il DNA secondo il protocollo del produttore.
Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 100% all'isolato e mescolare il campione per inversione. Dopo tre minuti a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta per trasferire il precipitato di DNA simile alla lana in un nuovo tubo privo di DNAsi e RNAse a due millilitri. Lasciare asciugare l'aria del campione per un minuto prima di aggiungere un millilitro di 75% di etanolo al tubo e invertire il tubo da tre a sei volte per lavare il campione.
Scartare l'etanolo dopo l'ultima inversione prima di lavare il DNA altre due volte con etanolo fresco per lavaggio come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare all'aria il campione per 10 secondi prima di sciogliere il DNA in 52 microlitri di otto idrossido di sodio millimolare. Trasferire un'aliquota di DNA a due microliter a un flaconcino spettrofotometrico e quantificare la concentrazione di DNA nel campione utilizzando un rapporto di assorbanza compreso tra A260 e 280 secondo la formula.
Regolare la concentrazione di DNA del campione a 50 nanogrammi per microlitro con idrossido di sodio millimolare aggiuntivo e progettare internamente la coppia di primer specifica della sequenza GFP verde esogena utilizzando un portale web open source primer design per il rilevamento PCR in tempo reale del tag GFP e delle cellule metastatiche che hanno invaso e colonizzato i siti distali del tumore. Quindi utilizzare un rapido reagente PCR in tempo reale e una macchina PCR in tempo reale che supporta un protocollo PCR veloce in tempo reale per l'analisi PCR quantitativa in tempo reale del campione. Per il rilevamento di cellule tumorali del seno metastatiche nel polmone, utilizzare forbici sezionanti per aprire la cavità toracica e tagliare oltre il cuore e il timo per esporre la trachea.
Inserire un ago calibro 22 attaccato a una siringa da 10 millilitri contenente la soluzione di Bouin nella trachea e deprimere lo stantuffo fino a quando i polmoni collassati non si gonfiano con circa due millilitri della soluzione. Rimuovere la siringa e l'ago una volta che i polmoni sono stati gonfiati e trasferire l'intero polmone in un tubo da 15 millilitri contenente soluzione di Bouin fresca. Invertire delicatamente il tubo alcune volte prima di lasciare il tessuto in ammollo per 24 ore a temperatura ambiente.
Il giorno successivo sciacquare il polmone con acqua e posizionare il campione in un tubo di 70%etanolo. Quindi utilizzare un microscopio sezionato per contare il numero di macchie bianche metastatiche e noduli sulle superfici dei polmoni. La misurazione del volume tumorale per pinza è un metodo consolidato per valutare l'efficacia del trattamento.
Per ottenere segnali comparabili tra gruppi di studio, è necessario condurre uno studio cinetico BLI pre-imaging per determinare il miglior lasso di tempo di imaging. A causa del rapporto segnale-sfondo superiore, l'intero corpo in vivo BLI è abbastanza sensibile nel rilevare segnali di metastasi di basso livello rispetto all'approccio GFP. Tuttavia, a causa della natura stabile della molecola GFP, i ricercatori hanno tempo sufficiente per elaborare la carcassa prima di catturare i segnali GFP dagli organi bersaglio in studi dual reporter.
Questo esempio di vita reale dimostra come le misurazioni delle dimensioni del tumore della pinza possano distorcere l'interpretazione dei dati poiché questo xenograft ha perso la maggior parte del contenuto vitale di cellule tumorali pur mantenendo la sua grande massa e forma. Il rilevamento molecolare da parte della PCR in tempo reale può anche fornire prove convincenti della metastasi cerebrale nel modello di cancro al seno ortotopico usando il sequenziamento esogeno del DNA GFP poiché la sequenza di DNA GFP trasfettata non esiste naturalmente negli esseri umani o nei roditori. Il sito di impianto dovrebbe essere fisiologicamente e anatomicamente correlato alla malignità del cancro.
Sia il gene tumorale che l'espressione proteica possono essere valutati in siti primari e distali e le cellule metastatiche possono essere isolate per un'ulteriore caratterizzazione.
