Per iniziare, prendi i giovani adulti sincronizzati C.Elegans ermafroditi in una micro provetta da centrifuga. Aggiungere 200 microlitri di tampone M9, contenente Poloxamer 188, Pluronic F127 e due microlitri del reagente del kit di colorazione al pellet di verme. Coprire i tubi con un foglio di alluminio per proteggere i coloranti dalla luce.
Lasciare ruotare la miscela a 20 RPM per un'ora a temperatura ambiente. Quindi girare i vermi a 500 G per un minuto. Successivamente, rimuovere la soluzione colorante senza disturbare il pellet di verme.
Lavare i vermi con tampone M9 tre volte e trasferirli in una piastra di agar NGM seminata contenente il trattamento appropriato. Lavare i vermi dalle piastre in provette da microcentrifuga fresche con un millilitro di tampone M9. Successivamente, fissare i vermi con l'1% di formaldeide sul ghiaccio per 30 minuti.
E lavare i vermi con un millilitro di tampone M9 tre volte per rimuovere qualsiasi residuo di formaldeide. Dopo aver pellettato i vermi, aspirare la quantità massima di surnatante, mantenendo intatto il pellet in 10 microlitri di M9. Successivamente, per preparare il 2,5% di agarosio, pesare 0,125 grammi di agarosio in una provetta di vetro borosilicato da 10 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di tampone M9 e sciogliere l'agarosio riscaldando delicatamente il tubo con un bruciatore bunsen.
Trasferire l'agarosio fuso in un bagno asciutto impostato a 75 gradi Celsius. Aggiungere 100 microlitri di agarosio fuso su un vetro di copertura del microscopio lucido del ponte usando una punta da un millilitro. Immediatamente, metti un'altra diapositiva perpendicolarmente sulla goccia di agarosio formando una forma a croce.
Dopo due minuti, separare delicatamente i vetrini spingendo il vetro del coperchio superiore lasciando il tampone di agarosio sul vetrino del coperchio inferiore. Trasferire i vermi sul tampone di agarosio con una pipetta di vetro Pasteur. Utilizzare uno stoppino fatto di una salvietta da laboratorio per rimuovere il liquido in eccesso.
Quindi coprire i vermi con una pellicola più piccola e applicare lo smalto trasparente alla periferia per evitare l'evaporazione. Posiziona il vetrino in una scatola scura per proteggerlo dalla luce. Utilizzare un microscopio confocale per visualizzare i vermi entro 24 ore alle lunghezze d'onda appropriate utilizzando una lente di ingrandimento 60 volte.
Quindi, apri il software di imaging e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'area grigia. Dal popup visualizzato, seleziona acquisizione. Ti2 pad completo.
Acquisizione ND e tabelle di ricerca. Sotto Ti2 full pad, selezionare 60 volte e regolare la manopola di messa a fuoco fine del microscopio per mettere a fuoco i vermi. Quindi selezionare il disco rotante e scegliere l'opzione di binning a 16 bit.
Per ciascun filtro a fluorescenza, impostare il tempo di esposizione su 500 millisecondi e 20 millisecondi per il campo luminoso. Una volta impostati questi parametri, selezionare Esegui ora e attendere che l'immagine di output venga generata come file ND2.
