Questo metodo aiuta ad osservare la mitofagia nelle cellule viventi usando un colorante mitocondriale verde-fluorescente a cellule e un colorante lisosoma rosso-fluorescente. La mitofagia svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi dei mitocondri e di vari aspetti della funzione cellulare. Questa tecnica potrebbe fornire un nuovo approccio al trattamento delle malattie legate ai mitocondri.
Questa procedura non è molto complicata. Catturare immagini chiare è molto importante per contare la sovrapposizione di mitocondri e lisosomi. Per iniziare, coltura di fibroblasti embrionali di topo o cellule MEF in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri con 10 millilitri di Modified Eagle Medium o DMEM di Dulbecco.
Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e monitorare le cellule al microscopio con un ingrandimento 100X. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, lavarle con due millilitri di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco. Quindi aggiungere due millilitri di 0,05% di tripsina EDTA per un minuto per dissociare le cellule, seguito da due millilitri di DMEM per fermare la reazione.
Centrifugare la sospensione cellulare a 100 G per tre minuti e risospendere il pellet in un millilitro di DMEM. Contare le cellule utilizzando un contatore automatico delle cellule e vetrini della camera di conteggio delle cellule e inoculare 1,5 volte 10 alla sesta cellula in un nuovo piatto di coltura cellulare da 10 centimetri contenente 10 millilitri di DMEM. Per il test della mitofagia, preparare una sospensione cellulare come descritto e diluire la sospensione cellulare a una volta 10 alla quinta cellula per millilitro di DMEM fresco.
Aggiungere due millilitri della sospensione cellulare diluita a un piatto confocale da 20 millimetri e agitare il piatto in una croce. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Preparare soluzioni di lavoro dei coloranti diluendo le soluzioni di stock.
Aggiungere due microlitri ciascuno di colorante mitocondriale 0,2 millimolare e colorante lisosoma 50 micromolari a due millilitri di DMEM per ottenere una concentrazione operativa di 0,2 colorante mitocondriale micromolare e 50 colorante lisosoma nanomolare. Rimuovere il mezzo dal piatto di coltura confocale e aggiungere un millilitro della soluzione colorante per coprire le cellule. Posizionare il piatto di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 20-30 minuti.
Impostare i parametri del software di imaging per microscopia confocale. Per le immagini a doppia eccitazione, utilizzare l'eccitazione sequenziale a 488 nanometri e 543 nanometri e raccogliere l'emissione rispettivamente da 505 a 545 nanometri e superiore a 560 nanometri. Rimuovere il piatto di terreno di coltura contenente il colorante dall'incubatore e aggiungere un millilitro di tampone Krebs-Henseleit o KH al piatto.
Per indurre la mitofagia, trattare le cellule con FCCP a un micromolare nel tampone KH per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere immediatamente all'immagine delle cellule utilizzando il microscopio confocale. Applicare una quantità appropriata di olio sulla parte superiore della lente dell'olio 63X. Posizionare il campione sullo stadio del campione del microscopio confocale e spostarlo direttamente sopra la lente dell'obiettivo.
Utilizzare il software di imaging per trovare il campione facendo clic sulla scheda Trova nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia del software. Seleziona un set di filtri verde per l'esperimento. Utilizzare la manopola di regolazione grossolana per mettere a fuoco rapidamente spostando l'obiettivo verso l'alto e verso il basso.
Dopo che il campione di cellule è chiaramente visibile attraverso l'oculare, cercare e focalizzare l'area delle singole cellule e spostarla al centro del campo visivo. Fare clic sulla scheda Acquisizione nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia del software per acquisire immagini. Selezionare solo il canale a 488 nanometri e la risoluzione del fotogramma 1024x1024 per l'anteprima.
Fare clic sulla scheda Live nell'angolo in alto a sinistra per avviare una scansione dal vivo. Regolare il campo visivo al massimo e regolare la potenza del laser spostando il cursore a sinistra o a destra. Mantieni l'impostazione del guadagno al di sotto di 600 per evitare sovraesposizioni.
Regolate il valore stenopeico su 156, il valore di guadagno su 545 e il valore di offset digitale su zero. Seleziona il miglior campo visivo, controlla i due canali e scegli la risoluzione del fotogramma 1024 per 1024. Fare clic su Snap per acquisire immagini 2D e salvare le immagini acquisite.
In questo studio, FFCP è stato utilizzato per innescare la mitofagia nelle cellule MEF per l'imaging confocale. Qui sono mostrate immagini rappresentative di cellule colorate con il colorante mitocondriale fluorescente verde che mostra i mitocondri e colorate con il colorante lisosoma fluorescente rosso che mostra il lisosoma. Quando i mitocondri colorati di verde danneggiati vengono inghiottiti da lisosomi colorati di rosso, la fluorescenza verde e rossa si sovrappongono per rivelare lisosomi mitocondriali co-localizzati gialli.
I punti gialli corrispondono a questi lisosomi mitocondriali co-localizzati che rappresentano la mitofagia in corso e quindi possono essere contati per valutare l'estensione della mitofagia. La preparazione di una soluzione di lavoro di coloranti per la colorazione dei mitocondri e del lisosoma e il mantenimento di un'appropriata confluenza cellulare durante l'imaging con microscopia confocale sono passi chiave da ricordare. Questa procedura può anche essere utilizzata per analizzare il numero e la morfologia mitocondriale che è importante per valutare la dinamica mitocondriale.
La mitofagia è strettamente associata a una varietà di malattie umane e questa tecnica può essere utilizzata per esplorare la connessione tra mitofagia e malattie umane.
